基于Micro-CT评价温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死模型股骨头微结构的影响.pdf

中医康复2024年3月 第1卷 第3期Traditional Chinese Medicine Rehabilitation,Mar.2024,Vol.1,No.03基础实验研究基于基于Micro-CTMicro-CT评价温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死评价温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死模型股骨头微结构的影响模型股骨头微结构的影响*谢文博1,2，宋红梅1，林菲菲3，吴毅泽2，王和鸣2（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州，350003；2.福建中医药大学，福建 福州，350122；3.福州市长乐区中医院，福建 福州，350299）摘摘要要 目的目的:通过Micro-CT图像评价温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死模型股骨头骨量的影响。方法方法:选取健康雄性新西兰大白兔6只，分成空白组、模型组、中药组（温阳补肾方临床等效剂量组）。用马血清加甲基强的松龙的方法建立兔激素性股骨头坏死模型，同时正常组等量注射生理盐水。造模结束后，正常组与模型组予生理盐水灌胃，治疗组则给予温阳补肾方灌胃，第四周处死所有兔子取材双侧股骨头，用Micro-CT扫描图像进行分析和评价。结果结果:大体形态观察：模型组股骨头破损变薄，骨质脆弱，软骨面颜色苍白，表面粗糙；中药组与模型组相比，股骨头破损程度较降低，软骨面颜色较白，骨质较硬，与正常组相比，光泽度较弱。Micro-CT图像显示：模型组股骨头变形，骨皮质不连续且较正常组薄弱，骨质密度不均，“星芒征”消失；软骨面可见剥脱裂纹，骨小梁排列紊乱，甚至断裂；中药组各个骨组织形态与正常组接近；与模型组相比，股骨头外形饱满；骨小梁的排列趋于规则，软骨层增厚，骨皮质连贯。结论结论：糖皮质激素的大量运用会导致股骨头形态发生改变，主要表现为外形塌陷、骨皮质连续性破坏、骨密度降低、软骨面剥脱、骨小梁紊乱等；温阳补肾方的应用可扭转激素性股骨头坏死的骨组织形态变化，使已变形塌陷的股骨头外形趋于饱满、紊乱的骨小梁排列整齐、恢复骨皮质连续性、增厚薄弱的软骨层。从直观的影像学角度，证明了温阳补肾方在治疗激素性股骨头坏死方面的显著作用。关键词关键词 激素性股骨头坏死，温阳补肾方，Micro-CT，微结构 中图分类号中图分类号 R R285285.5 5 文献标识码文献标识码 B B 文章编号文章编号 20972097-31283128(20242024)0303-00010001-0404DOIDOI：1010.1978719787/j/j.issnissn.20972097-31283128.20242024.0303.001001To Evaluate the Effect of Wenyang Bushen Recipe on the Microstructure of Femoral Head in Rabbit Model ofTo Evaluate the Effect of Wenyang Bushen Recipe on the Microstructure of Femoral Head in Rabbit Model ofSteroid-induced Femoral Head Necrosis Based on Micro-CTSteroid-induced Femoral Head Necrosis Based on Micro-CTXIE Wen-bo1,2,SONG Hong-mei1,LIN Fei-fei3,WU Yi-ze2,WANG He-ming2(1.The Second Affiliated Peoples Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350003;2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122;3.Changle District Traditional Chinese Medicine Hospital of Fuzhou,Fuzhou,Fujian 350299)AbstractObjectiveAbstractObjective:To evaluate the effect of Wenyang Bushen Decoction on the bone mass of femoral head in a rabbit model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by Micro-CT images.MethodsMethods:A total of 8 healthy male New Zealand white rabbits were randomly divided into control group,model group and TCM group(Wenyang Bushen Decoction clinical equivalent dose group).The rabbit model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head was established by horse serum and methylprednisolone,and the normal group was injected with the same amount of normal saline.At the end of modeling,the normal group and the model group were given normal saline by gavage,and the treatment group was givenWenyangBushen decoction by gavage.At the fourth week after the beginning of treatment,all rabbits were sacrificed,and the bilateral femoral headswere taken for analysis and evaluation by Micro-CT scanning.ResultsResults:In model group,the femoral head was damaged and thin,the bone was fragile,the cartilage surface was pale,and the surface was rough.Compared with the model group,the degree of femoral head damage in the Chinesemedicine group was lower,the cartilage surface color was white,the bone was harder,and the glossiness was weaker than that in the normal group.Micro-CT images showed that in the model group,the femoral head was deformed,the bone cortex was discontinuous and weaker than that in thenormal group,the bone density was uneven,and the star sign disappeared.Exfoliation cracks were observed on the cartilage surface,and the bonetrabeculae were arranged disorderly or even broken.In the Chinese medicine group,the morphology of bone tissue was similar to that of the normalgroup.Compared with the model group,the femoral head was plump in shape.The arrangement of bone trabeculae tended to be regular,the cartilagelayer thickened,and the cortical bone was coherent.ConclusionConclusion:The extensive use of glucocorticoids can lead to morphological changes of the femoral head,mainly manifested as shape collapse,cortical bone continuity destruction,bone mineral density reduction,cartilage surface exfoliation,andtrabecular bone disorder.The application of Wenyang Bushen recipe can reverse the morphological changes of the bone tissue of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,make the shape of the deformed and collapsed femoral head tend to be full,the disordered bone trabeculae are arranged in order,the continuity of the bone cortex is restored,and the thin and weak cartilage layer is thickened.From the visual imaging point ofview,it is proved that Wenyang Bushen recipe has a significant effect on the treatment of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.KeywordsKeywordsshormone-induced femoral head necrosis；Wenyang Bushen Formula；Micro-CT；microstructure*基金项目基金项目：国家自然科学基金项目（81973879）作者简介作者简介：谢文博（1997-），女，硕士，研究方向：神经、运动系统疾病的针推防治和康复研究。通讯作者通讯作者：宋红梅（1977-），女，博士，副主任医师，研究方向：神经、运动系统疾病的针推防治和康复研究。1中医康复2024年第1卷激素性股骨头坏死（Steroid-induced AavascularNecrosis of Femoral Head,SANFH）是使用激素最常见的副作用之一，表现为股骨头的骨组织坏死和股骨头变形，最终造成髋关节功能障碍1-2。本病在中医上属于“骨痹”、“骨痿”，病机为肾虚血瘀。研究表明补肾活血对 SANFH 有积极作用3-4，王和鸣教授根据此治则拟定温阳补肾方，经临床实践证明疗效可靠5-6，前期相关研究已证明该方可抑制SANFH兔模型骨组织中的破骨细胞，刺激新骨形成7-8。本研究拟进一步探索该方在修复病损骨质方面的功效，为防治SANFH提供实验依据，现报告如下。1 1材料和方法材料和方法1.1 材料1.1.1 动物与分组 发育正常的清洁级健康新西兰大白兔6只（体质量为2.0-2.1kg，月龄为2），由上海甲 干 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供，合 格 证 编 号 为20200006001407，许可证号码为 SCXK（沪）2020-0006。新西兰大白兔饲养环境的温度保持在 221，湿度保持在65-70%，12小时明/暗光照周期，以标准条形饲料喂养，饮食自由。将大白兔随机分成空白组2只、模型组2只、中药组2只。造模前禁食12小时。1.1.2 实验药品及试剂 温阳补肾方汤剂由福建省第二人民医院提供（处方：巴戟天 15g、骨碎补 9g、淫羊藿 9g、鹿角胶 6g、郁金 9g、丹参 9g、三七 3g、黄芪 15g、牛 膝 9g、甘 草 3g），马 血 清（Solarbio，No.925T051），甲基强的松龙（比利时 PFIZER SA，DD4077），青霉素（科达，20200910），0.9%生理盐水（200218A24）。1.1.3 实验仪器 Micro CT（Bruker（SkyScan 1076），离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TDZ4-WS），移液枪（吉尔森 P 型移液器公司，P2、P10、P20、P100、P200、P1000）、酶标分析仪（北京普朗新技 术 有 限 公 司，DNM-9602），细 胞 培 养 耗 材（TRUELINE，TR4001、TR4002、TR5000），CO2恒温培养箱（Thermo Fisher，Thermo Forma 3111），显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司，XDS-500C），电泳仪（BIORAD，mini protean 3 cell），电转仪（大连竞迈科技有限公司，PS-9），水浴锅（Leica，HI1210），成像 系 统（Tanon，Tanon-5200）、Real-time 检 测 仪（Heal Force，X960），低温冷冻离心机（eppendorf，5425R），荧光显微镜（奥林巴斯，Olympus BX60），恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司，DHG-9023A），显微图象分析系统（NIKON 公司，DS-Ri2）。1.2 方法1.2.1 模型建立 根据文献9采用改进的马血清联合甲基强的松龙的方法，将造模组新西兰大白兔精准称重，按10mL/kg的剂量将马血清经兔耳缘静脉注射。第一次注射：将新西兰大白兔按10ml/kg的剂量经兔耳缘静脉注射马血清，正常饲养三周，正常组注射等体积的生理盐水；第二次注射：正常饲养三周后，按6mL/kg的剂量再次经兔耳缘静脉注射马血清；正常饲养两周，正常组注射等体积的生理盐水；第三次注射：正常饲养两周后，按45mg/kg的剂量腹腔注射甲基强的松龙，每天1次，连续3天。注射激素期间，每天每只大白兔腹腔注射青霉素10万单位，连续7天，预防感染，正常组注射等体积的生理盐水。1.2.2 药物干预 注射青霉素7日后进行药物干预。空白组与模型组的新西兰大白兔采用生理盐水10ml/d 灌胃；中药组按以下方法灌胃：根据 Meeh-Rubner 公式21：A（体表面积）=K（系数）W（体重g）2/310-4，及人与兔用药剂量的换算公式进行计算，所得结果为新西兰大白兔正常干预药量为人干预药量的3.22倍，温阳补肾方成人用药剂量为2g/kgd，故治疗组给予6.44g/kgd 温阳补肾方灌胃。1.2.3 股骨头组织取材及制备 空气栓塞法处死将要取材的大白兔，于无菌环境下操作，取出大白兔两侧的股骨头，样本置于无水乙醇4保存。1.3 观察内容 股骨头形态大体观察以及采用Micro-CT（micro computed tomography,Micro-CT）扫描各组股骨头，评估骨小梁微结构变化及新生骨量情况。扫描参数设置为像素（um）：18.26017；扫描电压：40kV；扫描电流：250uA；曝光：240ms；扫描时长：00:07:30。2 2结果结果2.1 股骨头大体形态观察（图1）空白组：标本外形为完整圆形，骨质硬，关节软骨呈白色，表面光滑，富有光泽（图1a）。模型组：股骨头外形破损、塌陷，与空白组相比，饱满度、圆润度明显降低；骨质变薄、脆弱；软骨面颜色苍白，表面粗糙、失去光泽，并出现剥脱（图1b）。中药组：与模型组相比，股骨头得到修复，破损程度较低，外形基本完整，骨质较硬，光泽度较高（图1c）。2第3期谢文博 等 基于Micro-CT评价温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死模型股骨头微结构的影响图1a 空白组股骨头外观图1b 模型组股骨头外观图1c 中药组股骨头外观图1 股骨头大体形态2.2 股骨头Micro-CT图像（图2）空白组：股骨头结构完整清晰，骨皮质连续，边缘光滑未见断裂；软骨层光滑，厚度正常；骨质密度均匀，可见“星芒征”，骨小梁完整，排列致密规则（图2a）。模型组：股骨头发生变形，稍有萎缩，骨皮质不连续，有裂隙和塌陷，可见边缘骨赘形成；骨质存在散在囊状低密度影，分布不均，“星芒征”消失；部分软骨面出现剥脱裂纹，骨皮质较正常组明显更薄；骨小梁排列不整齐，间隙变宽，结构松散紊乱，甚至断裂（图2b）。中药组：各个骨组织形态与正常组接近。与模型组相比，可见股骨头外形饱满光滑，未见塌陷；骨小梁的排列趋于规则，软骨层增厚，骨皮质未见断裂（图2c）。图2a 空白组股骨头Micro-CT图像图2b 模型组股骨头Micro-CT图像图2c 中药组股骨头Micro-CT图像图2 股骨头Micro-CT扫描图像3 3讨论讨论激素性股骨头坏死是临床应用激素最常见、最严重的并发症之一，通常引起疼痛、畸形，甚则致残。激素性股骨头坏死的发生机制尚未有统一定论，现代医学认为与脂质代谢紊乱、血管内凝血等有关10，临床常用药物保守治疗或手术治疗，但是髋关节置换术后可能出现双下肢不等长，对未塌陷侧股骨头塌陷是一个潜在的风险因素14。研究表明，激素性股骨头坏死病程长，起病隐袭，保守治疗疗程长、效果不明确，手术治疗费用高、后续调养难度大，对患者生活质量造成极大影响。中医认为激素性股骨头坏死属于“骨痹”、“骨痿”，肾阳亏虚是其发病基础，血瘀痰凝是其病理产物11-12，常用活血化瘀、祛痰通络的方法13，应用中药内服或针灸治疗。本研究所用温阳补肾方是王和鸣教授治疗激素性股骨头坏死的临床经验方，处方由巴戟天、淫羊藿、骨碎补、鹿角胶、丹参、郁金、三七、黄芪、牛膝、甘草组成。巴戟天，有补肾阳，强筋骨，祛风湿之功效，专为肾阳虚衰 之本，是为君药；淫羊藿、骨碎补、鹿角胶，都有温补肾阳之功用，可提高巴戟天的作用，是为臣药；丹参、郁金、三七，具有活血祛瘀之功效；黄芪，可补气升阳举陷，均为佐药；牛膝，具有补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行之功效，可使药效直达病所；甘草，调和诸药，共为使药。全方共同组成温阳补肾、活血祛瘀之功效。活血与补肾并重，在活血化瘀的同时，具有补益肝肾、强筋壮骨的作用。微计算机断层扫描技术（micro computed tomography,Micro-CT），也称为显微CT，具有分辨率极高的特点，广泛应用于骨代谢的研究。Micro-CT可对骨组织进行扫描成像分析，分辨率达到微米级，能够在不破坏样本的同时观测样本的内部结构15。依香叫16等应用 Micro-CT 技术探讨刺老苞根皮对 3 月龄大鼠胫骨骨折显微结构的影响；郭震17等通过Micro-CT评价瘦素缺乏小鼠椎体的骨质；姚建亮18等应用Micro-CT研究强骨饮对去卵巢 3中医康复2024年第1卷大鼠骨折愈合骨小梁的影响。综合多项临床研究，可知使用Micro-CT对骨质进行探索已具有广泛性，对于不同的研究目的和研究方法都有极高的适配度。故本研究应用Micro-CT扫描兔激素性股骨头坏死模型股骨头区域，明确股骨头坏死时的股骨头状态，来阐释激素性股骨头坏死时股骨头的变化，探索温阳补肾方对被破坏骨质的修复功能，对比用药前后的股骨头形态，从而为升级该疾病的治疗方案提供新思路和线索。通过Micro-CT图像可知，激素性股骨头坏死的影像学改变主要有：骨皮质连续性被破坏，软骨出现破裂，股骨头塌陷变形，甚至骨折，出现硬化、囊性低密度影以及边缘骨赘形成。正常健康的股骨头横截面可见“星芒征”，即骨质为发散状，当股骨头发生坏死时，骨小梁断裂、乱序，导致“星芒征”消失。在应用温阳补肾方治疗后，坏死的股骨头Micro-CT扫描结果趋近于正常股骨头，破坏的骨小梁、塌陷的股骨头以及断裂的骨皮质均得到修复。本团队前期相关研究通过对新西兰大白兔进行造模、对照实验发现温阳补肾方能提高兔SANFH股骨头组织中破骨细胞抑制因子OPG的mRNA表达，抑制核因子-B受体活化因子RANK和核因子-B受体活化因子配体 RANKL的 mRNA表达8，刺激成骨细胞与破骨细胞的功能及活性；可提高成骨因子VEGF的表达、调节RANK/RANKL/OPG通路的功能，抑制破骨细胞的过度活化，使骨代谢恢复动态平衡，刺激新骨的形成20。本次试验结果与前期结论吻合，互相佐证，通过更直观的Micro-CT进一步证实结论的准确性。下一步研究将尽可能详实地采集相关指标数据，力求通过设置阳性对照组，更严谨地对比，最终证实本结论。综上所述，激素的大量应用将导致明显的骨质破坏，使脆弱的股骨头塌陷变形，从而造成疼痛、跛行等症状，温阳补肾方能直接促进病损骨质的复原，对激素性股骨头坏死的向愈起积极作用。参考文献参考文献1Liang Xue Zhen,Liu Xiao Chen,Li Song,Wen Ming Tao,Chen YanRong,Luo Di,Xu Bo,Li Nian Hu,Li Gang.IRF8 and its relatedmolecules as potential diagnostic biomarkers or therapeutic candidates and immune cell 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