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1、 一：倡议书.......................................1 二：卷首语.......................................6 三：活动背景....................................9 四：绪论 4.1 苯胺的污染现状及危害.........................14 4.1.1 对环境的危害..............................15 4.1.2 对人体的危害..............................15 4.1.3 毒性
2、17 4.2 含苯胺污水处理研究现状......................19 4.3 苯胺降解菌的研究进展.........................20 五：具体活动方案 5.1 活动的目的和意义..............................21 5.2 活动的主要内容 5.2.1 实验试剂的配制...........................22 5.2.2 实验方法...................................25 5.2.
3、3 结果与分析................................28 5.2.4 结论与展望................................33 六：结束语......................................35 七：问卷调查...................................37 40 小组成员： 生技131： 唐恒芳、高围、 周建宝、黄功、 黄申平、赵祥 指导老师：孔芳
4、 天有情，地有情，节能减排你我行 ——节能减排倡议书 。 资源是人类生存和发展的重要物质基础，环境不仅制约着人类的发展，更主宰着人类的生存质量。节约资源和保护环境是我国的基本国策，加快建设资源节约型、环境友好型社会是党中央、国务院全面贯彻落实科学发展观、构建社会主义和谐社会的重要举措。最近，国务院和省政府分别召开节能减排工作会议，对节能工作做出全面部署。创建节约型校园是构建节约型社会的重要组成部分，节能减排高校应走在社会的前面。作为学生，我们应该认识在先、行动在前，特发出以下倡议： 一、做宣传节能减排的标兵 认真学习贯彻党的十七
5、大精神，牢固树立生态文明观和节能环保理念，不断增强节能减排的紧迫感和责任感，不断增强能源忧患意识和节约环保意识，积极倡导绿色办公和低碳生活，争做宣传节能减排的标兵，踊跃投身节能减排宣传活动。同时，学习掌握节能减排知识与技能，广泛宣传节能环保政策法规，普及节能知识和方法，努力营造节能减排的浓厚氛围，带动全社会共同形成节能减排的新风尚。 二、做践行节能减排的楷模 要从现在做起，从自己做起，从节约每一度电、每一滴水、每一张纸、每一粒米的点滴小事做起，做自觉践行节能减排的楷模。 1、养成离开办公室、教室及其他公共场所时随手关灯、关空调、关电脑的良好习惯。 2、会议室、
6、办公室（家庭）做到冬天空调温度不高于20度、夏天空调温度不低于26度。 3、天气晴朗、光线充足时，建议教室、办公室、会议室以采用自然光为宜。 4、开展节水行动，随时关闭水龙头，做到人离水断，衣物集中洗涤，减少洗衣次数，洗涤剂要适量投放，避免过量用水。 5、积极推广“无纸办公”、“无纸通信”，节约打印、复印用纸，提倡双面使用打印纸。 6、树立资源循环利用的意识，争取做到“一物多用”。逛街时带上购物袋，少用塑料袋，减少一次性用品（如纸巾、纸杯、筷子、方便碗等）的使用。 7、养成健康科学的饮食习惯，树立节俭文明的生活消费理念，节约粮食，反对浪费，提倡适度消费，不超前消费。 8、
7、分类保存和回收处理废纸、饮料瓶、电池等废弃物，促进生活节能减排。 三、做督促节能减排的典范 倡导文明的低碳生活方式，自觉养成健康、文明、节约、环保的良好习惯，发现身边有浪费等不良行为要主动制止、及时规劝，发现因设备损坏或施工造成的浪费现象要及时通知有关部门并督促整改。围绕节能减排，积极开动脑筋，发挥聪明才智，积极主动地为节能减排建言献策。充分利用学校的科研优势，积极开展节能减排科技创新研究。 勤俭节约、艰苦奋斗是中华民族的传统美德。节能减排是可持续发展的具体体现，是落实科学发展观的必然要求，也是人类的远见、智慧和内涵、修养的外在彰显，更是对子孙后代负责的身体力行、义务担当！一滴滴水能汇合成大
8、海，一棵棵树能成长为森林！让我们每一位同学行动起来，从自己做起、从点滴着手、从现在做起、从身边做起，积极参与节能减排，认真开始低碳生活，为实现国家的节能减排目标、为创建节约型校园、节约型社会做出自己积极的贡献！ 环境是人类生存和发展的基本前提。环境为我们生存和发展提供了必需的资源和条件。随着社会经济的发展，环境问题已经作为一个不可回避的重要问题提上了各国政府的议事日程。保护环境，减轻环境污染，遏制生态恶化趋势，成为政府社会管理的重要任务。对于我们国家，保护环境是我国的一项基本国策，解决全国突出的环境问题，促进经济、社会与环境协调发展和实施可持续发展战略，是政府面临的重
9、要而又艰巨的任务。 环境的污染主要分为大气污染、土壤污染、水污染、放射污染和噪音污染。环境污染破坏了人们正常的生活环境平衡，严重危害人体和动植物生长，影响了社会的进步。污染环境的主要原因是工业生产排除的废水、废气和废渣。在环境污染中，化学污染占各类污染的80%~90%。 化学污染是在化工生产过程中废弃的污染物随废水、废气排出，或以废渣的形式排放。化学工业由于使用化学原料数量大、种类多，生产过程中排出的“三废”也就数量大，成分复杂，含危害物质多的特点。二十世纪五、六十年代，世界化学工业尤其是石油化学工业的兴起和快速发展，更加剧了环境污染的危机。化工产品的使用过程中对环境的污染，主要体
10、现在对化工产品的不当使用，及过度过滥使用上。从这一方面来说，几乎每一个人都对化工污染起到了推波助澜的作用。当前，我国环境污染防治的县长，从总体看，是环境污染加剧的趋势开始得到基本控制，部分城市和地区的环境质量有所改善。但目前环境污染的结构正悄然发生一个重大的变化：即工业污染比重趋于稳定并降低，而生活和农业污染比重正在上升。从这一变化中，我们不难看出，化工产品生产过程的污染已引起了人们的足够重视，而对化工产品使用过程中所产生的污染，则有待人们重新定位评价。 苯胺作为一种重要的化工原料和化工产品，广泛存在于制药、橡胶及其他许多化工厂的废水中。同时苯胺也是一种有毒“三致”物质
11、是环境污染物排放优先控制污染物之一。由于其生物毒性、稳定性、疏水性、生物富集性等特点，苯胺通常长期滞留在环境中。同时苯胺与血红蛋白结合成高铁血红蛋白，使之与氧结合能力下降导致动物中毒，是一种对人类构成严重危害的物质。我们小组成员希望通过微生物降解的方法将苯胺从环境中除去，通过控制苯胺的排放量，减轻苯胺对环境的污染。 而且，近年来像“天津港”这样的事，屡有发生，而遗留的危害又是那么难以根除，因此一个有效的解决这类“残留”问题的办法是有很重大的意义的！ 2012年12月31日，山西天脊集团38.7吨苯胺泄漏，污水经排
12、水系统流入河道。这起重大污染事故在隐瞒5天后才被公众知晓，虽然相关部门采取了补救措施，但仍有8.7吨污染物进入漳河上游的浊漳河，直接危及下游晋冀豫三省数百万人用水安全。而在事故发生地山西潞城，当地百姓已经饱受各种染污二三十年，无助又无奈的他们，只好用一句“习惯了”来形容自己的困境。事故发生后，绿色和平于2013年1月10日派出一支环境调查队伍，前往山西苯胺泄漏区域展开环境调查取样等工作。工作人员在现场看到，肇事企业厂区依旧浓烟弥漫。苯胺是一种应用于印染及农药等行业的原材料，有毒性，可对环境和水体造成污染。发生泄漏事故的方元公司以生产苯胺为主，是天脊集团的下属分公司，企业的生产线与储存区并不在一
13、起，从厂区生产线上出产的苯胺要通过约1公里长的输送管道才能进入储存区。 12月31日7时40分，苯胺储罐下方的一条输送软管破裂，导致38.7吨的苯胺泄漏，其中30吨被当地紧急拦截，但是仍有8.68吨苯胺流入浊漳河。根据国务院颁发的《国家突发环境事件应急预案》规定，在事故发生后最多三个小时，即12月31日11时之前，国务院有关部门应该接到报告。然而，事故却隐瞒了5天。当天泄漏出来的苯胺从总排口出来，沿着几个村子外面的防洪渠、河道，汇到干涸的黄牛蹄水库，再汇入浊漳河下游入河口，造成了严重污染。1月5日，160公里之外的河北省邯郸市全城停水，紧急启用备用水源。不久后，漳河下游的河南省安阳市对外通报
14、该市境内岳城水库、红旗渠等部分水体有苯胺、挥发酚等因子超标。1月7日上午，长治市市长张保才正式承认事故迟报5天，并向社会道歉。连续几天，当地数千名村民和工人在排污渠到浊漳河沿岸清理受污染的冰和污水，并将这些被污染的冰块运输到工厂的应急处理池堆放。截至9日16时，5000余人已累计清冰约1250吨，累计回运污水2648吨。然而仍有8.7吨污染物进入当地最大的河流浊漳河，直接危及下游晋冀豫三省数百万人用水安全。沿着天脊集团排水线路往下游走，泄漏事故的痕迹非常明显，河道沟渠里随处可见白底红字的警示牌：“严禁人畜饮用河内废水”。有村民表示，这些警示牌也是直到5日之后才出现的。囤积在黄牛蹄水库的工业废
15、水，上千工人正在凿冰，投放活性炭到污水里面。同时，将污水抽回槽罐车，拉回至工厂周边的4个环保应急事故水池内暂时存放。然而河道及土壤的清污工作是极具艰难的，且对于回收的污冰和污水如何进一步处理，企业并没有向公众交代。距离方元公司20多公里远的排污渠末端，污水从这里直接进入浊漳河，目前这个入水口已被封堵并填埋活性碳。沿途村民反映，天脊集团排污渠已经有20多年历史了，一年四季都在外排污水。紧邻肇事企业的三井村有400多户人家，村民都知道水有毒，从不用渠里的水。2011年，村里养的羊误喝了渠水，转了几圈口吐白沫后死亡，“以后再也不敢喝那里的水”在山西、河北、河南三省浊漳河交界处，堆放了数道活性碳防护堤
16、在浊漳河入河口指挥筑炭坝的天脊员工介绍，由于在入河口拦得不够严实，导致苯胺流到下游去了，给环境带来严重的污染。 一：苯胺的污染现状及危害 苯胺，又名氨基苯，俗称阿尼林。它是苯分子中的一个氢原子被氨基取代而生成的化合物，分子式C6H5NH2，是最简单的一级芳香胺。苯胺在常温下是无色或微黄色的油状液体，接触空气和光线后变黑，有强烈的刺激性气味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。熔点－6.3℃，沸点184℃，相对密度1.02(20/4℃)，相对分子量93.128，加热至370℃分解。 苯胺是染料工业中最重要的中间体之一苯胺在染料工业中可用于制造酸性墨
17、水蓝G、酸性媒介灰BS、酸性嫩黄、直接橙S等；在有机颜料方面可用于制造金光红、金光红g、大红粉、酚菁红、油溶黑等；在印染工业中用于染料苯胺黑；在农药工业中用于生产许多杀虫剂、杀菌剂如敌敌畏、除草醚、毒草胺等。 苯胺是橡胶助剂的重要原料苯胺可用于制造防老剂，也可作为医药磺胺药的原料，同时也是生产香料、塑料、清漆、胶片等的中间体；并可作为炸药中的稳定剂、汽油中的防爆剂以及用作溶济；其它还可以用作制造对苯二酚、2－苯基吲哚等。 苯胺是生产农药的重要原料苯胺衍生的N－烷基苯胺、烷基苯胺、邻硝基苯胺、环己胺等，可作为杀菌剂敌锈钠、拌种灵、杀虫剂三唑磷、哒嗪硫磷、喹硫磷，除草剂甲草胺、环嗪
18、酮、咪唑喹啉酸等的中间体。 （一）对环境的危害 苯胺容易挥发，进入水体后，由于分子结构非常稳定，容易导致持久的环境污染，使水体和底泥的物理、化学性质和生物种群发生变化，造成水质恶化，从而影响水资源的有效利用，给人体健康带来潜在的危害，并破坏生态环境。 当水中排入大量苯胺时，水面会出现漂浮污染物，并有刺激性气味，伴随出现鱼虾等水生生物死亡，如果没有大量水源的补充和稀释，污染水系的生态平衡会被破坏，并且短时间难以恢复。 （二）对人体危害 苯胺又称为氨基苯，是苯环中一个氢原子被氨基取代生成的化合物。苯胺常温条件下是无色或微黄色的油状液 体，接触空气和光线后变黑，有强烈
19、刺激 性气昧，微溶于水，易溶于乙醇、苯、乙 醚、氯仿等有机溶剂。苯胺在有机合成和化工产品领域用途十分广泛。苯胺是染料工业中最重要的中间体之一，用于多种有机颜料的合成；在农药工业中是多种杀虫剂的生产原料；是橡胶助剂生产的重要原料，用于制造系列防老剂和促进剂；还可作为医用磺胺药的原料，也用于香料、塑料、清漆、胶片等产品的生产。苯胺可以经过皮肤、消化道和呼吸道进人体。其急性毒性实验结果属于中等毒性，大鼠经口的半数致死剂量为442mg／kg。短时间摄入较大剂量苯胺可以导致急性中毒。由于苯胺将人体红细胞中血红蛋白的二价铁氧化为三价铁，突出表现为高铁血蛋白血症，使人体红细胞失去携氧能力，患者出现不同程度的
20、紫绀，严重者会因为缺氧而死亡。苯胺能引起红细胞内珠蛋白变性，使红细胞膜脆性增加，细胞易于崩解，可在中毒4天左右发生溶血性贫血；中毒后 2～7 天发生中毒性肝病。 苯胺容易挥发到空气中形成蒸气，进入水体的苯胺，由于分子结构非常稳定，容易导致持久的环境污染。苯胺在常 温条件下是油状液体，土壤对其有良好的吸收作用，混入土壤中的苯胺在短时间内很难分解，半衰期在350天左右，且 目前缺乏有效的治理办法。苯胺在氧含量充足的水体中可降解，半衰期为5～25天；进入水体的苯胺，使水体和底泥的物理、化学性质和生物种群发生变化，造成水质恶化，从而影响水资源的有效利用，给人体健康带来潜在的危害并破坏生态环境。
21、当水中排人大量苯胺时，水面会出现漂浮污染物，并有刺激性气味，伴随出现鱼虾等水生生物死亡，如果没有大量水源的补充和稀释，污染水系的生态平 衡会被破坏并且短时间难以恢复。关于水体中的低浓度苯胺，一旦被人体摄入，会产生何种健康损害，尚缺乏 科学研究证据加以证实。有研究者认为，藻类结构简单，生长繁殖速度快，生活周期短，对环境反应灵敏，且同高等生物有 相似的物理化学特性和酶作用过程。近年来，我国科技工作者以水生态毒理学研究方法，观察苯 胺对水生藻类的毒性效应，发现不同种类的淡水藻类，在每升水中1~70mg苯胺的浓度作用条件下，苯胺不但可以抑制藻类生长，还能够破坏其细胞形态与结构。国内研究人员采用植物细胞
22、核畸变技术，研究了苯胺对大蒜根尖细胞的遗传毒性效应，当苯胺溶液浓度为1mg／L时，大蒜根尖细胞分裂指数降为对照的84％，反映出显著的抑制作用；当苯胺溶液浓度达3mg／L以上时，则抑制作用极为显著。由于苯胺能抑制大蒜根尖细胞有丝分裂，具有直接和间接的DNA损伤作用，能引发较高频率的细胞核畸变，表现出一定的遗传毒性。 （三）毒性 1.急性中毒表现 主要引起高铁血红蛋白血症和肝、肾及皮肤损害。短期内皮肤吸收或吸入大量苯胺者先出现高铁血红蛋白血症，表现为紫绀，舌、唇、指（趾）甲、面颊、耳廓呈蓝褐色，严重时皮肤、黏膜呈铅灰色，并有头晕、头痛、乏力、胸闷、心悸、气急、食欲不振、恶心、呕吐
23、甚至意识障碍。高铁血红蛋白10%以上，红细胞中出现赫恩兹小体。可在中毒4天左右发生溶血性贫血。中毒后2-7天内发生毒性肝病。口服中毒出上述症状外，胃肠道刺激症状较明显。 眼睛接触：可出现结膜角膜炎。 皮肤接触：可引起皮炎。 2.慢性中毒表现 长期低浓度接触可引起中毒性肝病。健康危害：该品主要引起高铁血红蛋白血症、溶血性贫血和肝、肾损害。易经皮肤吸收。急性中毒：患者口唇、指端、耳廓紫绀，有头痛、头晕、恶心、呕吐、手指发麻、精神恍惚等；重度中毒时， 皮肤、粘膜严重青紫，呼吸困难，抽搐，甚至昏迷，休克。出现溶血性黄疸、中毒性肝炎及肾损害。可有化学性膀胱炎。眼接触引起结
24、膜角膜炎。慢性中毒：患者有神经衰弱综合征表现，伴有轻度紫绀、贫血和肝、脾肿大。皮肤接触可引起湿疹。 二：含苯胺废水处理研究现状 环境中所含的苯胺类化合物主要来自制药工业和染料工业的废水；含有硝基苯的矿山酸性废水，在有锌粉和铜盐存在下也可还原为苯胺，有色金属选矿厂废水中有时也含有少量苯胺类化合物。目前国内外对苯胺废水的处理主要有物理、化学、生物等方法，但基本处于研究的起步阶段，有的甚至鲜有报道。物理处理法有吸附法和萃取法，吸附法采用吸附材料处理苯胺废水的方法，具有可回收利用苯胺、吸附剂可重复利用等特点。萃取法采用与水互不相溶但能溶解污染物的萃取剂，使其与废水充分混合接触后，利用污染
25、物在水中和溶剂中不同的分配比分离和提取污染物的一种废水净化法。化学处理法有光催化氧化法，超临界氧化法，二氧化氮氧化法、超声波讲解法、电化学讲解法、臭氧和光催化联合降解法。由于苯胺废水的毒性强，生物降解性差，现有的生化处理系统难以有效去除污染，但随着高效苯胺降解菌的筛选分离，利用微生物的代谢活性处理环境中的有机污染物或为一种趋势。由于投资少、占地少也不需要特殊设备而倍受青睐，因而具有很大的潜力。 三:苯胺降解菌的研究进展 上世纪七八十年代以来，国外研究者对苯胺的微生物降解研究做了大量的工作，发现和分离了一些可以降解此类化合物的降解菌，并对其降解特性、降解机理、代谢途径及相关降解酶甚至降解
26、基因的调控表达进行了初步的研究。在最适生长温度为30℃，最适生长PH为7.0，在含低浓度苯胺培养基中生长比高浓度的好。苯胺已被美国 EPA 列为优先控制的 129 种污染物之一。 苯胺在环境中的残留、 迁移和降解主要取决于生物和非生物因子两个方面 。生物降解的研究始于 20世纪 40 年代, 随着对有机污染物降解过程研究的深入, 生物降解的内涵也在不断深化和拓展, 其中因微生物的作用而引起的生物降解越来越引起人们的重视 。 近年来, 国内外对苯胺降解菌的研究日渐增多,多集中在高效降解菌的筛选和特性研究上。目前，国内外研究者对苯胺的微生物降解已开展了大量研究工作，在苯胺降解菌的分离方面，国内
27、外已分离到一些在好氧或厌氧条件下降解苯胺的细菌。最近，关于苯胺降解基因克隆和苯胺双加氧酶基因序列分析的研究工作也有文献报道。 一：活动的目的和意义 印染工业是现代工业中对环境造成严重污染的产业之一，在用生物法对印染废水进行脱色处理时，印染废水中的偶氮类染料及其前体物会被微生物降解生成较高浓度的苯胺，因此在处理印染废水时，不仅要考虑印染废水的脱色，也有必要进一步分析脱色后形成的芳香胺类的降解，而这一点在印染废水生物处理过程中却常常被忽略。因此,在应用分离到的功能微生物对印染废水进行生物强化处理之前，有必要对其脱色功能和苯胺降解功能综合起来进行研究。 本研究对
28、胺降解菌AN1进行了鉴定，研究了该实验菌对苯胺的最高耐受浓度，以及对苯胺的降解能力和对偶氮染料酸性大红的脱色能力，并进一步检测了该实验菌苯胺脱氨氧化酶基因 tdnQ 和黄素还原酶基因fre 的携带情况，为将来利用苯胺降解菌进行苯胺环境污染物修复及进一步的遗传学研究奠定基础。 二：活动的主要内容 1. 实验试剂配制 1.1 LB液体培养基的配置（100mL） 表 1-3 LB培养基的配制 组成成分 用量 氯化钠 蛋白胨 酵母膏 水 pH 1g 1g 0.5g 100mL 7.0 1.2 LB固体体培养基的配置（100mL）
29、表 1-4 LB固体培养基的配制 组成成分 用量 氯化钠 蛋白胨 酵母膏 琼脂 水 pH 1g 1g 0.5g 2.0g 100mL 7.0 LB培养基配置好后需要高温灭菌。即在121℃，20min灭菌，放置一天后，如没有染菌则可以使用。 1.3 微量元素母液的配置（100mL） 表 1-5 微量元素母液的配置 组成成分 用量 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 NaCl (NH4)2SO4 微量元素母液 水 pH 0.2g 0.13g 1.0g 0.2g 12.5uL 100mL 7.0 1.4 M9培养基的配置 (1)
30、先配制1M的MgSO4: MgSO4·7H2O 2.46g 加双蒸水10ml溶解，高压灭菌备用； (2)配制1M的CaCl2: CaCl2·6H2O 2.191g 加双蒸水10ml溶解，高压灭菌备用； (3)再配制5×M9盐溶液： Na2PO4·7H2O 12.8g ,KH2PO4 3.0g ,NaCl 0.5g,NH4Cl 1.0g 加双蒸水200ml溶解，121度灭菌15分钟， 备注：以上三样分别配制，分别装瓶，可以一起送去高压。 (4)配制20%的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20ml溶解，0.22微米滤器过滤除菌； (5)无菌操作配制M9培养基,5×M9盐溶液 200
31、ml,1M的MgSO4 2ml,20%的葡萄糖溶液 20ml,1M的CaCl2 0.1ml,加灭菌双蒸水至1000ml 。 1.5 MSA培养基的配置 称取本品23.6克，加热溶解于100ml蒸馏水中, 116℃高压灭菌20分钟，冷至50~55℃时，加入过滤除菌1%，亚碲酸钾溶液0.28ml，混匀。倾入无菌平皿，备用。 1.6 0.9%生理盐水的配置 称取0.9g氯化钠，溶于100mL的蒸馏水中，高压灭菌，置于实验室保存。 2. 实验方法 2.1 菌株对苯胺的耐受浓度研究 在含有不同浓度苯胺（500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、
32、4000和5000mg/L）的选择培养基平板上接种实验菌株，30℃恒温培养箱培养24小时，对苯胺的耐受度进行研究。 2.2 苯胺降解菌的筛选及降解率的测定 将经反复纯化确证为纯菌的菌种接入5mL LB 试管中, 150 r/min、30℃摇床过夜活化, 取活化后的菌液 3mL , 8 000 r/min离心 2min, 用无菌生理盐水洗涤菌体3次,然后把菌体接入装有 5mL250 mg/L MSA 培养基的试管中 ,以未接菌的MSA 培养基作为对照 ,分别置于 150 r/min、30℃摇床振荡培养和 30℃恒温培养箱内静置培养。分别在设定的时间点取样，8000 r/min离心
33、5min 去菌体后采用 N- ( 1-萘基) 乙二胺偶氮分光光度法测定苯胺浓度,计算苯胺降解率。 2.3 苯胺降解菌脱色能力的测定 将分离纯化后的菌种接入 5mL LB培养基试管中,150 r/min、30℃摇床过夜活化 ,取活化后的菌液0. 2mL 接入装有 2mL 染料培养基的小试管 ,以未接菌的染料培养基作为对照,分别置于 150r/min、30℃ 摇床振荡培养和 30℃恒温培养箱静置培养。分别在设定的时间点取样, 8000 r/min离心 5min去菌体后用紫外可见分光光度计( 美国 BECKMAN,DU-640) 分别在染料酸性大红( C. I. 27290) 最大吸收波长处(
34、 503nm) 测定吸光度值,计算染料的脱色率. 染料培养基为 M 9 培养基 ,在100mL的倍M9溶液中补加微量元素母液0.06mL ,酵母膏0.1g ，酸性大红终浓度均为50mg/L。 2.4 引物的设计与PCR反应扩增 tdnQ是苯胺脱氨氧化酶（oxidative deamination of aniline ）结构基因之一，黄素还原酶基因(fre，flavin reductase)具有偶氮还原酶的功能，可用来检测菌种对偶氮染料的脱色能力，根据酶的基因保守序列设计两对PCR引物，以期扩增本实验中的出发菌株对苯胺降解的基因保守片段。本实验设计的两对PCR特异性引物序列如表1-6所示，
35、引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 表1-6 与苯胺降解相关的PCR扩增引物序列 引物 引物序列 (5’--3’） 长度（nt） tdnQ（苯胺脱氨氧化酶基因） fre（黄素还原酶基因） F:5′-TCCCTGCCTGGAGCCCGAAAC-3′ R:5′-TCCCGCGCCGTGAGTGACTG-3′ F:5′-GCGCATATTGACGCCATCTGGGA -3′ R:5′- GCCAGCCCGCTTCCGGTTGT -3′ 21 20 23 20 PCR扩增体系如下： 表1-7 PCR扩增体系 PCR各成分 用量 10×b
36、uffer MgCl2 dNTPs Forward Reverse DNA template Taq DNA polymerase ddH2O 2µL 1.2µL 2µL 2µL 2uL 2µL 1µL Add ddH2O to Total volume 20µL 取0.2mL已灭菌的Eppendorf PCR管，依次加入各组成成分，低速离心混匀放入PCR扩增仪中进行扩增。PCR反应程序如下：94℃5 min；94 ℃ 30 s，X℃ 45 s，72 ℃1 min，共33个循环；72℃10 min；4℃保存
37、PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳（120V，45 min）后，在凝胶成像系统中观察成像及记录结果。 3. 结果与分析 3.1 出发菌株对苯胺临界抑制浓度 （1）出发菌株AN1经种子培养基活化后，稀释一定倍数涂布于含不同质量浓度苯胺的培养基平板上，30 ℃恒温培养1～2 d后，在含有不同苯胺浓度（500-5000mg/L）的选择性培养基进行观察。由图2-1A至图2-1I可以看出，当培养基含苯胺浓度低于2500mg/L时，实验菌生长情况良好。当培养基苯胺浓度达到3000mg/L时，苯胺生长情况开始受到抑制，菌株基本不生长。因此确认该实验菌对苯胺的临界抑制浓度为3000mg
38、/L。 图 2 -1A在500mg/L苯胺中的生长情况 图 2 -1B在1000mg/L苯胺中的生长情况 图 2 – 1C在1500mg/L苯胺中的生长情况 图 2 – 1D在2000mg/L苯胺中的生长情况 图 2-1E在2500mg/L苯胺中的生长情况 图 2-1F 在3000mg/L苯胺中的生长情况 图 2 -1G 在3500mg/L苯胺中的生长情况 图 2-1L在4000mg/L苯胺中的生长情况 图 2 -1M在5000mg/L苯胺中的生
39、长情况 图 2 - 1 苯胺降解菌在不同浓度苯胺中生长情况 2.2苯胺降解菌降解苯胺能力的测定 在摇床振荡培养和静置培养条件下分别测定实验菌的苯胺降解率。结果如图2-2所示，对初始浓度500mg/L的苯胺，在72h内菌株AN1在摇床好氧条件下的苯胺降解率为11.8%,在静置培养条件下，菌株的苯胺降解率为6.6%。表明实验菌在摇床好氧条件下或静置培养条件下都显示出一定的苯胺降解能力。 图 2 - 2 菌株在静置和振荡培养下的苯胺降解率 2.3 苯胺降解菌脱色能力的测定 在测定苯胺降解率的同时 ,又分别在摇床振荡培养和静置培养条件下对菌株AN1的脱色能力进行了测定, 结果如
40、图2-5显示在静置培养条件下菌株具有较强的脱色能力，该菌株可在 4h内将初始浓度为 50 mg/L的偶氮染料酸性大红脱色94%以上. 而在摇床振荡培养条件该实验菌不具有脱色能力。 图 2 - 3 菌株在静置和振荡条件下脱酸性大红K-GP的比较 2.4 tdnQ （苯胺脱氨氧化酶）基因与fre（黄素还原酶） 基因的扩增检测 tdnQ基因是苯胺脱氨氧化酶结构基因之一，采用tdnQ基因的引物进行扩增，以菌株Pseudomonas putida WM120S-1的基因组DNA为模板，以期扩增获得苯胺降解途径中的此酶的基因片断，WM120S-1菌株可以扩增出两条较亮的条带，大小分别约为
41、600bp与400bp，文献中报道tdnQ基因的目标条带约384bp，而本实验菌株的扩增条带400bp的条带与目标条带较为接近，扩增产物条带的差异，可说明本实验中的出发菌株与文献中的菌株降解苯胺的能力有明显差异，结果如图第2泳道（Lane2）所示。 1 2 3 kb 2 1 0.75 0.5 0.25 0.1 图 2 - 4 PCR扩增Lph与LmPHs基因的电泳图谱 Lane1: DL2kb Lane, lane 2: tdnQ (退火58℃),lane3: fre (退火56℃)
42、 同理，大肠杆菌黄素还原酶具有偶氮还原酶的功能，在测定WM120S-1具有对苯胺的脱色能力之后，采用fre基因特异性引物对菌株进行了扩增，可扩增出大小约为480bp的基因特异条带（lane3），下面后续工作是将扩增的目标条带分别进行克隆测序，并将序列进行Blast比对。 4.结论与展望 苯胺在当今社会上仍是工农业最广泛的有机污染物，但由于其本身的化学性质会引起生物细胞癌变，因此找到一种合适的处理方法对人类生存和自然界的生态平衡至关重要。 通过本次试验可以得到以下结论： 1、 在最适温度和最适PH分别为30℃、7.0条件下，该菌株能够最大耐受的苯胺浓度为3000mg
43、/L。 2、 对初始浓度500mg/L的苯胺，在72h内菌株AN1在摇床好氧条件下的苯胺降解率为11.8%,在静置培养条件下，菌株的苯胺降解率为6.6%。表明实验菌在摇床好氧条件下或静置培养条件下都显示出一定的苯胺降解能力。 3、 在静置培养条件下实验菌具有较强的脱色能力 ,该菌株可在 4h内将初始浓度为 50 mg/L的偶氮染料酸性大红脱色94%以上，而在摇床振荡培养条件该实验菌不具有脱色能力。 4、 tdnQ基因是在苯胺脱胺氧化过程中起作用的基因，据前人报道不同实验方法证实不同苯胺或3-氯苯胺降解菌中tdnQ基因的多样性。本研究采用tdnQ基因特异性引物成功地在WM120S-1菌株中
44、检测到了tdnQ基因的存在，虽然扩增片段大小与文献中报道的基因大小稍有差异，但也表明tdnQ基因在不同的苯胺降解菌中广泛存在的方式。 实验结果表明苯胺降解菌的筛选及其应用仍然有很大的前景，需要更多的科研工作者做出更具体更深入的研究，以筛选出具有特定功能的苯胺降解菌。这对于目前出现的许多有关问题，如苯胺污染的水体、破坏土壤环境及影响人类生活等方面都有积极的促进作用和重要的意义。 地球母亲以其宽容的胸怀给予我们清澈的河流，嫩绿的草地，肥沃的土壤，还有那万万不可缺少的氧气。在茫茫的宇宙中，又有哪颗行星能与您媲美。您用自己的心血孕育着我们
45、我们真的该对您说一声：“谢谢!”道完了谢，便要道歉了，我想对您说一句“对不起。”您给了我们生活的乐土，我们却没有好好的珍惜。一次性筷子，泡沫饭盒，塑料袋……这一切都使您变得肮脏不堪。树木被大量砍伐，水土大量流失，溪水变得不再清澈，您的容颜已被弄得一团糟。近几年，人们的环保意识渐渐增强，也意识到了环境的重要。古人曰：“知错能改，善莫大焉。”我们也了解到了自己的错误。植树造林，河道清理，提倡使用布袋购物……这一切都是我们的悔悟。我们要用实际行动告诉您：“我们知道错了!”“地球，这位人类的母亲，这个生命的摇篮，这我们无私地贡献出了多少?而我们却是怎样回报她的呢? 地球，这位人类的母亲，这个生命
46、的摇篮，您现在已经伤痕累累。不过从今以后，我们一定会好好地保护您，决不让您再流泪、生气。我相信，通过我们的努力，您会慢慢康复，越变越美，露出独特的笑颜。 作为当代大学生我们更应该以身作则增强能源忧患意识和节约环保意识，弘扬中华民族勤俭节约的传统美德，养成良好的生活习惯，建立健康、文明、简约、环保的生活方式；学习、掌握节能环保知识，遵守环保法律法规，形成节约光荣、浪费可耻的良好风尚；扩大宣传，组织节能活动，在校园形成建设节约型校园的浓厚氛围。 “苯胺知多少”问卷调查 您的性别：1.男 2. 女 一．您对环境污染的关注程
47、度如何？ 1.知道 很少关注 2.偶尔关注 3很关注 二．您知道环境污染包括哪些吗？ 1.水污染 2.大气污染 3.土壤污染 4.白色污染 三．您知道苯胺是什么吗？ 1.知道 2.不清楚 3.不知道 四．您认为苯胺的主要来源有哪些？ 1.化工厂废水 2.制药厂 3.橡胶厂 五．您知道苯胺对环境的污染吗？ 1.知道 2.不清楚
48、 3.不知道 六．苯胺能致癌吗? 1.能 2.不清楚 3.不能 七．您认为下列哪项减少环境污染最有效？ 1.物理吸附萃取 2.化学光催化氧化联合治理 3.生物菌降解 第1题 您对环境污染的关注程度如何？ [单选题] 选项 小计 比例 知道，很少关注 13 24.07% 偶尔关注 27 50% 很关注 14 25.93% 本题有效填写人次 54
49、 第2题 二．您知道环境污染包括哪些吗？ [多选题] 选项 小计 比例 水污染 52 96.3% 大气污染 53 98.15% 土壤污染 50 92.59% 白色污染 48 88.89% 本题有效填写人次 54 第3题 您知道苯胺是什么吗？ [单选题] 选项 小计 比例 知道 15 27.78% 不清楚 31 57.41% 不知道 8 14.81% 本题有效填写人次 54 第4题 您认为苯胺的主要来源有哪些？ [多选题] 选项
50、 小计 比例 化工厂废水 46 85.19% 制药厂 32 59.26% .橡胶厂 36 66.67% 本题有效填写人次 54 第5题 您知道苯胺对环境的污染吗？ [单选题] 选项 小计 比例 知道 11 20.37% 不清楚 34 62.96% 不知道 9 16.67% 本题有效填写人次 54 第6题 苯胺能致癌吗? [单选题] 选项 小计 比例 能 30 55.56% 不清楚 23 42.59% 不能 1 1.85% 本题有效填写人次 54
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