连翘苷抗番鸭呼肠孤病毒增殖及对炎症因子表达的抑制作用_许泽锴.pdf

收稿日期:20220419修回日期:20220621基金项目:福建省自然科学基金项目(2021J01080);福建农林大学科技创新项目(CXZX2020066A);福建省中青年教师教育科研项目(JAT200108)作者简介:许泽锴(1997)，男研究方向:基础兽医学Email:1293761176 qqcom通信作者黄小红(1966)，女，教授，博士生导师研究方向:基础兽医学Email:984158392 qqcom连翘苷抗番鸭呼肠孤病毒增殖及对炎症因子表达的抑制作用许泽锴1，郑钰1，张凯照1，2，胡会1，沈沛津1，吴异健1，2，黄小红1，2 1福建农林大学动物科学学院(蜂学学院);2中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室，福建 福州 350002摘要:探讨连翘苷对番鸭呼肠孤病毒(MDV)增殖及对炎症相关细胞促炎因子和趋化因子基因表达水平的影响采用噻唑蓝(MTT)法检测连翘苷对鸡胚成纤维细胞 DF-1 的安全质量浓度为 012500 gmL1，并筛选出最佳的给药方式为:先感染病毒再给药连翘苷采用半数组织培养感染剂量(TCID50)检测 MDV 在 DF-1 细胞中的增殖情况，结果表明，给药2448 h时，连翘苷能使 MDV 滴度极显著下降(P001)采用实时荧光定量 PC 检测连翘苷对 DF-1 细胞促炎因子和趋化因子基因表达水平的结果表明:与对照组相比，MDV 攻毒组促炎因子基因 IFN-、TNF-、IL-1、IL-6 和趋化因子基因CCL20、IL8L1、IL8L2、K203、SCYA4 在给药 2448 h 时的表达量显著升高(P005);与 MDV 攻毒组相比，连翘苷处理组促炎因子基因 IFN-、TNF-、IL-1、IL-6 和趋化因子基因 CCL20、IL8L1、IL8L2、K203、SCYA4 在给药 2448 h 时的表达量显著下降(P005)综上，连翘苷能抑制 MDV 在 DF-1 细胞中的增殖，并降低细胞炎症因子基因的表达水平，具有良好的抗病毒和抗炎的双活性开放科学(资源服务)标识码(OSID)关键词:连翘苷;番鸭呼肠孤病毒;病毒增殖;炎症因子中图分类号:S85265+94文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0337-07DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303008Inhibitory effect of phillyrin on the proliferation of Muscovy Duck eovirusand the expression of inflammatory factorsXU Zekai1，ZHENG Yu1，ZHANG Kaizhao1，2，HU Hui1，SHEN Peijin1，WU Yijian1，2，HUANG Xiaohong1，2 1College of Animal Sciences(College of Bee Science)，Fujian Agriculture and Forestry University;2University Key Laboratory for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicineand Animal Healthcare in Fujian Province，Fuzhou，Fujian 350002，ChinaAbstract:This study investigated the effect of phillyrin on the proliferation of Muscovy Duck eovirus(MDV)and the expressionof inflammatory cytokines and chemokines in cells Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay showed that the safe concentration ofphillyrin for chicken embryo fibroblast DF-1 was 012500 gmL1，based on which the best administration method for DF-1 cellswas verified to be MDV infection before phillyrin-treatment After administration，the proliferation of MDV in DF-1 cells was mo-nitored by 50%tissue culture infection dose(TCID50)method The results showed that the titers of MDV were significantly re-duced at 2448 h after phillyrin-treatment(P001)The mNA expressions of cytokine genes(IFN-，TNF-，IL-1 and IL-6)and chemokine genes(CCL20，IL8L1，IL8L2，K203 and SCYA4)were analyzed by real-time quantitative PC Compared with thecontrol group，the mNA expression levels of these genes in the MDV infection group were significantly increased at 2448 h(P005)In contrast，their expressions in the phillyrin-treatment groups were significantly down-regulated at 2448 h in comparisonto the MDV infection group(P005)In conclusion，phillyrin can inhibit the proliferation of MDV in DF-1 cells and the ex-pression of inflammatory factors caused by MDV，showing good antiviral and anti-inflammatory activitiesKey words:phillyrin;Muscovy Duck eovirus;viral proliferation;inflammatory cytokines福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月番鸭呼肠孤病毒(Muscovy Duck eovirus，MDV)属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的双链 NA 病毒1，可通过垂直传播和水平传播，引起雏番鸭和半番鸭发生免疫抑制性传染病2 研究表明，雏番鸭感染MDV 后，其免疫器官、呼吸道和消化道局部免疫组织中的免疫细胞大量死亡34 番鸭呼肠孤病在多个国家均有报道，并表现出较高的发病率和死亡率5 自 1997 年传播至中国以来6，番鸭呼肠孤病的致死率不断提高，已成为影响番鸭养殖的重要疾病之一，给番鸭养殖业造成严重的经济损失7，因此深入研究该病的预防和控制措施十分重要目前，防控番鸭呼肠孤病的方式以疫苗和抗生素为主，但近年来 MDV 不断产生变异，病毒传染性逐渐增强，使现有的疫苗不能起到显著的防治效果8;而长期滥用抗生素，产生药物残留和耐药性等一系列问题也日益严重，给畜禽食品安全和人体健康造成隐患9 因此亟需寻找新型抗 MDV 的药物中药及其有效成分具有无污染和低耐药性的独特优势10，目前已大量应用于畜禽生产中大量研究表明，黄芪多糖11、猴头菇多糖12 和绿原酸13 等多种中药提取物具有良好的抗病毒及提高机体免疫力的作用连翘苷是连翘的主要活性成分之一，具有抗病毒、抗炎、抗菌和抗氧化等多种药理作用14;对 SAS 冠状病毒15 和甲型流感16 等病毒有明显的抑制效果但连翘苷对 MDV 的作用鲜有报道感染病毒后，宿主的先天性免疫信号通路首先被激活病毒主要通过宿主的模式识别受体对病原相关模式分子进行特异性识别，从而启动下游信号级联反应，诱导产生干扰素、促炎因子和趋化因子等17 研究表明:MDV 感染能诱导宿主炎症因子的异常表达，对宿主肠道黏膜造成损伤，导致局部免疫缺陷18;在 MDV 感染严重时，趋化因子 CC 和 CXC 亚家族显著富集19 据此，本研究以鸡胚成纤维细胞 DF-1 为模型，选取促炎因子基因 IFN-、TNF-、IL-1、IL-6 及禽类趋化因子 CC、CXC 亚家族基因 CCL20、IL8L1、IL8L2、K203、SCYA4 为研究对象，对连翘苷抗 MDV 增殖和抗炎作用进行评估，旨在为进一步开发和筛选抗 MDV 的药物提供参考1材料与方法11材料111病毒和细胞MDV-YB 株由福建农林大学动物科学学院预防兽医学实验室分离鉴定并保存;鸡胚成纤维细胞 DF-1(商品代码:CL-12203)购于武汉普诺赛生命科技有限公司112主要试剂连翘苷(纯度98%)购于成都曼思特生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM 细胞培养基、PBS 和青霉素-链霉素购于美国 Hyclone 有限公司;025%胰酶-EDTA 购于 Life Technologies 公司;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)购于北京索莱宝科技有限公司;总细胞 NA 提取 Trizol 试剂购于美国 Ambion 有限公司;反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司12连翘苷对 DF-1 细胞安全质量浓度的测定将 DF-1 细胞按每孔 5104的个数接种至 96 孔板中，待细胞生长至每孔面积的 70%80%后，吸去孔中培养液各连翘苷试验组每孔分别加入 100 L 由 DMEM(含 2%血清)配制的 781、1563、3125、6250、12500、25000、50000 gmL1连翘苷，每组设 8 个复孔，同时设未加入药物的对照组及孔中未接种细胞的空白组将各组细胞置于细胞培养箱(37、5%CO2)中培养 24 h 后，每孔加入 10 L MTT 溶液，于37 避光培养 4 h 后吸出上清液，每孔再加入 150 L 二甲基亚砜(DMSO)，充分吹打溶解采用酶标仪测定各孔溶液在 490 nm 处的光密度(D)，计算细胞存活率细胞存活率/%=D490 nm(试验组)D490 nm(对照组)(D490 nm(空白组)D490 nm(对照组)10013连翘苷给药方式的筛选根据测定的连翘苷对 DF-1 细胞的安全质量浓度，将连翘苷(781、1563、3125、6250、12500 gmL1)和100 TCID50(半数组织培养感染剂量)MDV 病毒液(每毫升 TCID50为1046)以3 种给药方式分别感作 DF-1 细胞给药方式(连翘苷与病毒共同感作):将各质量浓度连翘苷与病毒的混合液以每孔833福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷100 L加入到 96 孔板的细胞中感作 2 h;给药方式(先感染病毒再给药连翘苷):每孔先加入 100 L 病毒液于 96 孔板的细胞中感作 2 h 后弃去，再加入 100 L 各质量浓度的连翘苷感作 2 h;给药方式(先给药连翘苷再感染病毒):每孔先加入 100 L 各质量浓度的连翘苷于 96 孔板的细胞中感作 2 h 后弃去，再加入 100 L 病毒液感作 2 h2 h 后换成细胞维持液继续培养细胞每组均设 8 个复孔，并设置孔中未加入药物的对照组及孔中未接种细胞的空白组，24 h 后采用 MTT 法测定各孔溶液在 490 nm 处的 D，计算病毒抑制率病毒抑制率/%=D490 nm(试验组)D490 nm(对照组)D490 nm(空白组)D490 nm(对照组)10014连翘苷对 MDV 增殖影响的检测根据筛选出的最佳给药方式，将 DF-1 细胞以每孔 5104的个数接种至 96 孔板中，待细胞生长至每孔面积的 70%80%后，吸去孔中培养液，加入 1 000 TCID50病毒液感作 DF-1 细胞，2 h 后吸去病毒液，再加入 6250 gmL1连翘苷感作细胞，2 h 后换成细胞维持液培养细胞每组均设 8 个复孔，并设置对照组，分别在 12、24、36、48 h 时间点收集细胞上清液，使用 eed-Muench 法测定不同时间点病毒的 TCID5015连翘苷对 DF-1 细胞炎症因子基因表达水平影响的实时荧光定量 PC 检测细胞接板和药物处理方法与“14”中的相同在 12、24、36、48 h 时间点收集细胞，使用 Trizol 法提取总NA，并反转录获得 cDNA以 cDNA 为模板，采用实时荧光定量 PC 检测促炎因子基因(IFN-、TNF-、IL-1、IL-6)和趋化因子基因(CCL20、IL8L1、IL8L2、K203、SCYA4)mNA 的表达水平PC 引物序列20 如表 1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成以-actin 为内参基因，采用 2Ct法计算基因 mNA 的表达水平表 1实时荧光定量 PC 引物序列Table 1Primers for T-qPC基因名称引物序列(53)上游引物下游引物产物长度bp基因登录号IFN-CCAAAACACTGGATTGACCGCGTTGTGCCGTAGGAAGTTGTG180GU1198971TNF-TATCCTCACCCCTACCCTGTCCTCTGGTTACAGGAAGGGCAAC139NM2047251IL-1CACTGGGCATCAAGGGCTACAAGGTCCAGGCGGTAGAAGATGAAGC156DQ3932671IL-6GAAATCCCTCCTCGCCAATCTGAAGGCCCTCACGGTCTTCTCCATAAAC167HM1796401IL8L1AGTTGTTCTCGCTCTTCTCATCGCCTTTGTGATGAAGATGATGGCAGG213NM_2050181CCL20ATGCCATCATTTTCCACACCGTCAAGATGCTTCTTCACCCAGTCTTCCT176NM_2044382IL8L2CTGCTCTGTCGCAAGGTAGGACCCAAGCACACCTCTCTTCCATCC186NM_2054981K203CTCGCTCTTCTCATCGCATCCTTCTGTTATGTAAGTGGTGCAGCAGGTC181Y186921SCYA4TGCTGCTTCACCTACATCTCCCGATGAGGGCACTGGCTGTTGGTCT81AJ2430341-actinCCCCATGCCATCCTCCGTCTGCCTCGGGGCACCTGAACCTCTC265NM-20551816数据处理试验数据以“平均值标准差”表示，采用 SPSS 250 软件对数据进行单因素方差分析，P005 表示差异显著，具有统计学意义2结果与分析21连翘苷对 DF-1 细胞的安全质量浓度采用 MTT 法检测连翘苷对 DF-1 细胞的安全质量浓度结果(图 1)显示:当连翘苷质量浓度为 12500gmL1以下时，DF-1 细胞活力无显著变化(P005)，表明该范围质量浓度的连翘苷对细胞正常生长无影响;当连翘苷质量浓度为 12500 gmL1以上时，DF-1 细胞活力极显著下降(P001)表明连翘苷对DF-1 细胞的安全质量浓度为 012500 gmL1933第 3 期许泽锴等:连翘苷抗番鸭呼肠孤病毒增殖及对炎症因子表达的抑制作用 表示差异极显著(P001)图 1连翘苷对 DF-1 细胞的安全质量浓度Fig1Safe concentration of phillyrin for DF-1 cells22连翘苷的最佳给药方式根据连翘苷的安全质量浓度筛选最佳的给药方式结果(图 2)显示:给药方式、对病毒的抑制率均低于 15%，对病毒无明显的抑制作用(P005);给药方式对病毒的抑制率与对照组的差异极显著(P001)表明先感染病毒再给药连翘苷的方式对病毒有明显的抑制作用，其中以 6250 gmL1连翘苷的抑制作用最强，病毒抑制率为7141%因此，最佳的给药方式为先感染病毒再给药连翘苷，并选取6250 gmL1连翘苷进行后续试验23连翘苷对 MDV 增殖的影响采用 TCID50检测连翘苷对 MDV 增殖的影响结果(图 3)显示，与对照组相比，连翘苷处理组在 2448 h 的病毒滴度极显著低于对照组(P001)，而在 12 h 的病毒滴度与对照组无显著差异(P005)表示差异极显著(P001)图 2连翘苷不同给药方式的病毒抑制率Fig2Virus inhibition rates under differentphillyrin-administration methods 表示差异极显著(P001)图 3连翘苷对 MDV 增殖的影响Fig3Effect of phillyrin on the proliferation of MDV24连翘苷对 DF-1 细胞炎症因子基因表达水平的影响采用实时荧光定量 PC 检测连翘苷对 DF-1 细胞促炎因子基因(IFN-、IL-1、TNF-、IL-6)和趋化因子基因(IL8L1、IL8L2、CCL20、SCYA4、K203)mNA 的表达水平结果(图 45)显示:与对照组相比，MDV攻毒组 IFN-、IL8L1、IL8L2 和 CCL20 mNA 的表达量在 1248 h 时显著升高(P005);TNF-和 SCYA4mNA 的表达量在 1224 h 时显著升高(P005)，在 2448 h 时下降;IL-6 和 K203 mNA 的表达量在 1236 h 时急剧并持续上升，在36 h 时达到最大值，随后开始下降;IL-1 mNA 的表达量在 1236 h 时呈先升高后下降的趋势，并在 48 h 达到最大值(P005)总体来看，MDV 攻毒组促炎因子和趋化因子在每个时间段 mNA 的表达量均显著高于对照组(P005)与 MDV 攻毒组相比，连翘苷处理组 IFN-、TNF-、043福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷IL-1、IL-6、IL8L1、IL8L2、CCL20、K203 和 SCYA4 mNA 的表达量在不同时间点均显著下降(P005);IFN-、IL-1、IL8L2、CCL20 和 SCYA4 mNA 的表达量在 48 h 时与对照组的差异不显著(P005)不同字母表示差异显著(P005)，相同字母表示差异不显著(P005)图 4连翘苷对 DF-1 细胞促炎因子基因 mNA 表达水平的影响Fig4Effect of phillyrin on the mNA expression level of cytokine gene in DF-1 cells不同字母表示差异显著(P005)，相同字母表示差异不显著(P005)图 5连翘苷对 DF-1 细胞趋化因子基因 mNA 表达水平的影响Fig5Effect of phillyrin on the mNA expression level of chemokine gene in DF-1 cells3讨论连翘作为我国的传统中药，具有清热解毒、消肿散结和疏散风热的功效连翘苷是连翘主要的活性成分之一，主要发挥着抗病毒和抗炎的临床作用目前，连翘苷对 MDV 增殖和抗炎活性仍缺乏系统研究因此，本研究在连翘苷对 DF-1 细胞安全质量浓度的基础上，选择 3 种给药方式初步探究连翘苷抗 MDV 增殖及抑制炎症因子的作用结果显示，先感染病毒再给药连翘苷的方式，连翘苷能显著抑制 MDV 在 DF-1143第 3 期许泽锴等:连翘苷抗番鸭呼肠孤病毒增殖及对炎症因子表达的抑制作用细胞中的增殖，并具有时间依赖效应，这表明连翘苷在 MDV 增殖的过程中发挥了抗病毒作用，具有良好的抗病毒活性此结果与赵冰倩等21 的研究结果“连翘水提液对 H5N1 和 H9N2 禽流感病毒有直接的抑制作用”一致炎症是机体对病原体感染及各种组织损伤等产生的一系列应答反应，它出现在机体识别损伤或免疫稳态扰动的起始阶段宿主感染病毒可激活炎性细胞产生高水平的促炎因子、趋化因子和其他抗病毒效应因子，而持续性感染会造成过度的炎症反应22，可能会导致组织损伤，对宿主机体造成严重损害型干扰素是参与细菌和病毒感染的内源性免疫反应的中枢细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性23 IL-1、IL-6 和 TNF-作为机体重要的促炎因子，具有调节促炎和抗炎、免疫细胞分化和激活的作用，在抑制和清除病毒的过程中发挥着重要作用24 本研究中，MDV 感染 DF-1 细胞后，促炎因子和趋化因子基因的表达水平均出现不同程度的上调，表明 MDV 感染激活了宿主细胞内源性免疫反应和炎症反应，细胞持续处于抗病毒状态此结果与大量体内研究结果11，2526 一致研究表明:MDV 感染初期，在番鸭脾脏 TL 基因网中检测出 IFN-、IL-1 和 IL-6 等 20 个基因表达水平上调25;MDV 入侵肠道后，诱导番鸭机体产生 IFN-和 IFN-等相关炎症因子26;在感染中期，MDV 能促进感染组番鸭血清中 IL-1、IL-6 和 TNF-的分泌，导致肝损伤11 此外，CCL20、K203 和 SCYA4 属于趋化因子 CC 亚家族成员，具有典型的 CC 类结构，能够趋化嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和 T 淋巴细胞;IL8L1 和 IL8L2 属于趋化因子 CXC 亚家族成员，IL8L1 对嗜异性细胞有特异趋化性，IL8L2 对单核细胞和巨噬细胞有趋化性，而对嗜异性细胞不具有趋化性27 MDV 感染细胞后，激活趋化因子招募巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞，免疫细胞激活 PI3K/Akt/NF-B 和 STAT3 信号通路，刺激信号通路下游炎症因子高表达，引起宿主发生炎症反应，对机体造成损伤28 本研究中，连翘苷处理组 DF-1 细胞促炎因子和趋化因子基因的表达均显著下降，表明连翘苷可通过调节炎症相关的信号通路，降低促炎因子和趋化因子基因的表达水平，进而干预 MDV 在 DF-1 细胞中的增殖研究表明:连翘苷通过调节 NF-B 信号通路上调促炎因子基因的表达水平，在体外显著抑制 SAS-CoV-2 病毒的增殖15;此外，MDV 可入侵宿主巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞，侵害肝脏和脾脏等免疫器官，而连翘苷具有保护免疫细胞和器官的作用2930，发挥抗炎和抗病毒功能，对 MDV 的复制起到抑制作用本研究仅探讨连翘苷对感染细胞促炎因子和趋化因子基因表达水平的影响，未对具体抗炎通路进行验证，对此还需进一步探讨本研究结果表明，连翘苷能抑制 MDV 在 DF-1 细胞中的增殖，降低感染细胞促炎因子和趋化因子基因的表达水平，具有良好的抗病毒和抗炎活性本研究结果为筛选独特的抗 MDV 的候选药物提供参考，也为 MDV 的预防和治疗提供新的思路参考文献 1CHEN S L，LIN F Q，CHEN S Y，et al Development of a live attenuated vaccine against Muscovy duck reovirus infection J Vaccine，2018，36(52):80018007 2李明慧，廖吕燕，刘珍妮，等CFSE 标记法分析番鸭呼肠孤病毒感染对番鸭回肠淋巴细胞归巢的影响 J 畜牧兽医学报，2020，51(1):159169 3LI M H，YAN P，SHEN X，et al Muscovy duck reovirus promotes virus replication by inhibiting autophagy-lysosomal degrada-tion pathway J Veterinary Microbiology，2021，253:108945 4MA G M，WANG D，SHI J J，et al Complete genomic sequence of a reovirus isolate from Pekin ducklings in China J Jour-nal of Virology，2012，86(23):13137 5LIAO L Y，LI J，LI J，et al Effects of astragalus polysaccharides on intestinal morphology and intestinal immune cells of Mus-covy ducklings infected with Muscovy duck reovirus J Poultry 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