芥菜全基因组中Hsf基因家族鉴定与分析_杨巍.pdf

第 41 卷 第 2 期2023 年 4 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.2Apr.2023芥菜全基因组中Hsf基因家族鉴定与分析杨巍1，2，唐兵1，2，谭国飞1，2，付文苑1，2，王青青1，2，曾庆鸿3，王洪亮3，马建云4，张睿4，施绍斌5，邓英1，2*（1.贵州省农业科学院园艺研究所，贵阳 550006；2.贵州省园艺工程技术研究中心，贵阳 550006；3.贵州省农业科技发展中心，贵阳 550006；4.威宁县农业农村局，贵州 威宁 553100；5.威宁县大西北种养殖专业合作社，贵州 威宁 553100）摘要：【目的】通过鉴定与分析芥菜基因组中Hsf转录因子家族成员，为芥菜Hsf基因功能研究与遗传改良提高抗逆性提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法分析芥菜Hsf热激转录因子家族成员的功能结构、保守基序、启动子顺式作用元件、系统进化、共线性及采用RNA-seq验证Hsf低温胁迫的基因表达。【结果】芥菜基因组中鉴定出71个Hsf基因家族成员，分布于18条染色体上，归类为3个亚家族，蛋白均含有DBD和HR-A/B结构域。BjuHsf启动子区域包含与逆境胁迫、激素、生长发育等相关顺式作用元件。系统进化与共线性分析表明，芥菜Hsf家族成员与大白菜Hsf家族成员具有更近的亲缘关系。在低温胁迫下，BjuHsf基因表达分析表明8个BjuHsf基因显著上调表达。【结论】这些显著差异表达BjuHsf基因与芥菜抗寒性极其相关，可作为芥菜耐寒性遗传改良的候选基因。关键词：芥菜；热激转录因子；生物信息学；表达分析中图分类号：S637 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）02-0295-12Genome-Wide Identification and Analysis of the Heat Shock Transcription Factor Family in Brassica juncea L.YANG Wei1，2，TANG Bing1，2，TAN Guofei1，2，FU Wenyuan1，2，WANG Qingqing1，2，ZENG Qinghong3，WANG Hongliang3，MA Jianyun4，ZHANG Rui4，SHI Shaobin5，DENG Ying1，2*（1.Institute of Horticulture，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550006，China；2.Guizhou Horticultural Engineering Technology Research Center，Guiyang 5500006，China；3.Guizhou Agricultural Science and Technology Development Center，Guiyang 550006，China；4.Agricultural and Rural Bureau of Weining County，Weining 553100，Guizhou，China；5.Weining County Northwest Breeding Professional Cooperative，Weining 553100，Guizhou，China）Abstract:【Objective】This paper aims to identify and analyze the members of Hsf transcription factor family in Brassica juncea L.genome，hoping to provide a theoretical basis for the functional research of Brassica juncea L.Hsf gene and genetic improvement to improve stress resistance.【Method】Bioinformatics methods were used to analyze the functional structure，conserved motifs，promoter cis acting elements，phylogeny，collinearity of BjuHsf family members，and RNA-seq was also used to verify the gene expression of BjuHsf under low temperature stress.【Result】Seventy-one members of the Hsf gene family were identified in the Brassica juncea L.genome，distributed on eighteen chromosomes and grouped into three subfamilies.all BjuHsf proteins contain DBD and HR-A/B domains.The BjuHsf promoter region contains cis-acting elements related to stress，hormones，and growth and development.The phylogedoi：10.16036/j.issn.1000-2650.202208163收稿日期：2022-07-25基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合支撑【2020】1Y090号）；国家自然科学基金（31960595）；贵州省基层农技推广体系改革与建设补助项目（GZNJTG-WN-2022-01）；贵州省蔬菜现代农业产业技术体系项目（GZCYTX2022-01）；贵州省农科院资源专项（黔农科院种质资源【2022】03号）；贵阳市蔬菜种质资源研究中心建设项目（筑科合同【2021】5-1号）。作者简介：杨巍，硕士，助理研究员，主要从事蔬菜分子育种与栽培研究，E-mail：。*责任作者：邓英，博士，研究员，硕士生导师，主要从事蔬菜分子育种与栽培研究，E-mail：。四川农业大学学报第 41 卷 netic and collinearity analysis indicated that the Hsf family members of Brassica juncea L.were more closely related to those of chinese cabbage.Under low temperature stress，BjuHsf gene expression analysis showed that eight BjuHsf genes were significantly up-regulated.【Conclusion】These differentially expressed BjuHsf genes are related to cold tolerance of Brassica juncea L.and can be used as candidate genes for genetic improvement of cold tolerance of Brassica juncea L.Keywords:Brassica juncea L；heat shock transcription factor（Hsf）；bioinformatics；expression analysis芥菜（Brassica juncea(L.)Czern.et Coss，2n=36，AABB）是一种重要的十字花科类经济作物，由白菜类（Brassica rapa，2n=20，AA）与 黑 芥 类（Brassica nigra，2n=16，BB）杂交后加倍形成的异源四倍体，可用作油籽、蔬菜和调味品1。菜用芥菜可根据其食用器官分为叶用芥菜、茎用芥菜、薹用芥菜、根用芥菜和芽用芥菜等，芥菜具有喜冷凉温润、耐寒抗冻、抗旱耐热以及耐贫瘠的特点，在我国长江流域及西南地区广泛栽培2。热激转录因子（heat shock transcription factor，Hsf）是植物应激反应中重要的调控因子，通过识别并特异性结合热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）基因启动子的热激元件（HSE）的保守基序来调控热激蛋白表达，响应各种生物与非生物胁迫，并在植物生长发育中发挥重要作用3-4。Hsf蛋白进化出多个功能保守域，其中以N端的DNA结合域（DNA-binding domain，DBD）和寡聚化结构域（oligomerization domain，OD，或七肽疏水氨基酸残基重复区域HR-A/B）最为保守，DBD结构域特异性识别并结合靶基因的热激元件 HSE 的回文保守基序（5-AGAAnnTTCT-3），激 活 抗 逆 基 因 的 表 达5-6。HR-A/B具有卷曲螺旋结构的特征，通过可变长度柔性连接体连接到DBD，在转录因子活性中起作用7，根据DBD距离OD的长度及HR-A与HR-B之间的氨基酸残基数量将Hsf基因家族分为3类：A、B和C8。此外，Hsf蛋白还包含核输出信号（nuclear export signal，NES）、核定位信号（nuclear localization signal，NLS）以及 C 端转录激活结构域（C-terminal activation domain，CTAD）9。目前，人们已在拟南芥8、二穗短柄草9、水稻10、菜豆11、棉花12、矮牵牛13、黑麦14和玉米15等多种植物中对Hsf基因家族进行系统性鉴定与分析，Hsf基因家族在不同物种中数量存在显著差异，且发挥多种生物学功能，如响应受热16-17、氧化与干旱18、盐19、低温和重金属20-21等逆境胁迫，参与生物合成13,22及生长发育23。随着芥菜基因组测序工作的完成24-25，本文利用生物信息学鉴定与分析芥菜Hsf基因家族成员的序列特征、进化关系、共线性关系以及表达模式分析，从而为研究芥菜Hsf基因家族的生物学功能提供理论基础。1材料和方法1.1BjuHsf基因家族成员鉴定与理化性质分析从拟南芥基因组数据库 TAIR（https：/www.arabidopsis.org/）获取拟南芥基因组数据及Hsf基因家族蛋白序列，从十字花科植物基因组资源综合数据库BRAD（http：/）下载茎瘤芥基因组数据 Braju_tum_V2.0（B.juncea cv.tumida T84-66 V2.0）、大白菜基因组数据 Brara_Chiifu_V3.5（B.rapa cv.Chiifu V3.5）26，然后利用TBtools27软件本地化Blast获取芥菜Hsf基因家族成员蛋白序列，运用NCBI 数据库Blastp 与CCD 在线工具分析芥菜Hsf蛋白功能与保守结构域（pfam00447、smart00415和cl12113，筛选阈值 E0.000 01 且氨基酸长度大于100 aa）进行初步筛选，以 HEATSTER28数据平台（https：/applbio.biologie.uni-frankfurt.de/hsf/heatster/home.php）进行序列分析进一步筛选Hsf基因家族成员与分类；利用Expasy数据库在线工具protparam（https：/web.expasy.org/protparam/）进行 Hsf 蛋白序列的氨基酸序列长度、等电点和相对分子质量等理化性质分析。运用WoLF PSORT在线工具（https：/wolfpsort.hgc.jp/）预测Hsf蛋白的亚细胞定位。1.2BjuHsf基因染色体定位利用TBtools对BjuHsf基因进行染色体定位。1.3BjuHsf基因结构、保守基序分析利用TBtools分析BjuHsf基因结构，运用在线程序 MEME Suit5.4.1（https：/meme-suite.org/meme/tools/meme）分析BjuHsf基因家族成员保守基序（参数设置：最大基序数 20；其他为默认参数），运用MEGA11与TBtools软件绘制系统进化树与保守基序组成图。1.4BjuHsf蛋白保守结构域分析使用MEGA11与Genedoc对BjuHsf蛋白的DBD与HR-A/B保守结构域进行聚类分析。296第 2 期杨巍，等：芥菜全基因组中Hsf基因家族鉴定与分析1.5BjuHsf基因GO功能富集与蛋白互作分析通过 EggNOG5.0 数据库（http：/eggnog5.embl.de/#/app/home）进行GO功能富集分析，根据与大白菜序列同源性，利用STRING11.5数据库分析BjuHsf蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI），并使用Cytoscape3.9.1进行蛋白互作网络可视化。1.6BjuHsf启动子-顺式作用元件分析通过提取芥菜71个Hsf在基因组数据中上游2 000 bp的启动子区域序列，基于在线数据库Plantcare（https：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测BjuHsf基因启动子的顺式作用元件，并使用TBtools绘图。1.7多物种Hsf蛋白进化树的构建以71个芥菜Hsf蛋白、36个大白菜Hsf蛋白及21个拟南芥Hsf蛋白的氨基酸序列为研究对象，使用MEGA11（参数设置：最佳氨基酸替代模型JTT+G，最大似然法)构建系统进化树，Bootstrap 值为1 000。运用Evolview在线软件（https：/www.evolgenius.info/evolview/#/）进行进化树美化。1.8BjuHsf家族基因共线性分析利用TBtools对BjuHsf基因进行种内与种间的共线性分析，并计算BjuHsf重复基因对的Ka/Ks值。1.9BjuHsf基因低温胁迫的表达分析基于本实验室完成叶用芥菜 黔青6 号在低温胁迫（9，48 h）的试验组与对照组（22，48 h）的叶片组织RNA-seq数据，进行BjuHsf基因家族的表达分析，利用TBtools绘制基因表达热图。2结果与分析2.1BjuHsf基因家族成员鉴定与理化性质通过本地Blast检索、NCBI-CCD结构域及氨基酸保守序列分析验证，最终获得71个BjuHsf基因家族成员（表1）。并根据HEATSTER数据平台的分类结果将各基因家族成员进行重新命名。71 个BjuHsf蛋白的氨基酸长度在214494 aa之间，分子量在24.6255.39 kDa之间，蛋白等电点介于4.659.16之间，其中64个BjuHsf蛋白为酸性蛋白，7个BjuHsf蛋白为碱性蛋白，不稳定系数均大于40，表明 BjuHsf 为不稳定的蛋白。脂肪系数在 57.5179.37之间，总平均亲水性均为负值，表明BjuHsf蛋白有较好的亲水性。BjuHsf 蛋白亚细胞定位，除BjuHsfA8a（叶绿体）与BjuHsfB1b（细胞质）之外，其余均位于细胞核中。表1BjuHsf基因家族理化性质Table 1Physical and chemical properties of BjuHsf gene familyBjuHsfA1aBjuHsfA1bBjuHsfA1cBjuHsfA1dBjuHsfA1eBjuHsfA1fBjuHsfA1gBjuHsfA1hBjuHsfA1iBjuHsfA1jBjuHsfA1kBjuHsfA1lBjuHsfA1mBjuHsfA1nBjuHsfA1oBjuHsfA2aBjuHsfA2bBjuHsfA3aBjuHsfA3bBjuVB07G38990.1BjuVA09G34100.1BjuVB05G18320.1BjuVA01G09990.1BjuVB05G21920.1BjuVB02G34400.1BjuVB04G42470.1BjuVA10G22660.1BjuVB07G25030.1BjuVA03G32510.1BjuVA02G07230.1BjuV_Contig00969G00060.2BjuV_Contig00855G00140.1BjuV_Contig00645G00050.1BjuVB07G01300.2BjuVB08G26980.2BjuVA03G26650.1BjuVA10G32900.1BjuVB02G44580.149448743943341946249248745345344245445845946334734738642255.3954.6148.6548.2346.7451.1654.8353.8250.1950.1249.2450.2551.0950.8751.2939.2038.9743.5447.554.674.694.965.024.725.084.674.885.475.454.825.165.075.075.055.145.034.905.0861.8961.8663.4667.5457.855.7962.3254.1848.3156.9262.3253.0350.2348.7252.3147.6248.9951.5955.9865.8965.6567.7464.1869.2167.2365.1869.4073.9569.6570.0570.5374.8375.1271.9270.4669.6365.1664.67-0.760-0.768-0.614-0.614-0.706-0.655-0.715-0.557-0.558-0.601-0.651-0.643-0.571-0.557-0.593-0.585-0.588-0.653-0.662细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核基因名称Gene name基因IDGene ID氨基酸数量Number of amino acid分子量Molecular weight/kDa理论等电点Theoretical isoelectric point不稳定系数Instability index脂肪系数Aliphatic index总平均亲水性Total average hydrophilicity亚细胞定位Subcellular localization297四川农业大学学报第 41 卷 BjuHsfA4aBjuHsfA4bBjuHsfA4cBjuHsfA4dBjuHsfA4eBjuHsfA4fBjuHsfA4gBjuHsfA4hBjuHsfA5aBjuHsfA5bBjuHsfA6aBjuHsfA6bBjuHsfA6cBjuHsfA6dBjuHsfA6eBjuHsfA6fBjuHsfA6gBjuHsfA6hBjuHsfA7aBjuHsfA7bBjuHsfA7cBjuHsfA7dBjuHsfA7eBjuHsfA7fBjuHsfA7gBjuHsfA7hBjuHsfA8aBjuHsfA8bBjuHsfA8cBjuHsfB1aBjuHsfB1bBjuHsfB1cBjuHsfB1dBjuHsfB2aBjuHsfB2bBjuHsfB2cBjuHsfB2dBjuHsfB2eBjuHsfB2fBjuHsfB2gBjuHsfB2hBjuHsfB3aBjuHsfB3bBjuHsfB4aBjuHsfB4bBjuHsfB4cBjuHsfB4dBjuHsfB4eBjuHsfC1aBjuHsfC1bBjuHsfC1cBjuHsfC1dBjuVA09G21840.1BjuVA03G50890.1BjuVB04G15110.2BjuVB05G17340.1BjuVA01G11200.2BjuVB07G34130.1BjuVA08G14170.1BjuVB02G58250.2BjuVB06G57030.1BjuVA04G08640.2BjuVB03G23490.1BjuVA03G42180.1BjuVA01G33900.1BjuVB07G11910.1BjuVA02G33540.1BjuVA05G26050.1BjuVB04G12360.1BjuVB01G31370.1BjuVB08G59320.1BjuVA03G47990.1BjuVA09G55060.1BjuVB02G60800.1BjuVA04G07690.1BjuVB02G60810.1BjuVA03G47980.1BjuV_Contig00683G00290.1BjuVA02G19590.1BjuVB03G40550.1BjuVA07G34810.1BjuVA03G64140.1BjuVB02G74640.1BjuVA01G01810.1BjuVB05G01630.1BjuVB04G02320.1BjuVB06G11240.1BjuVA06G27460.1BjuVA02G47080.2BjuVB08G30080.1BjuVA03G28840.1BjuVA09G26730.1BjuVB08G40330.1BjuVA03G22930.1BjuVB08G22500.1BjuVB07G43030.1BjuVB04G52890.1BjuVA10G06680.1BjuVA08G05850.1BjuVB06G30860.2BjuVB01G28970.1BjuVA07G07950.1BjuVB03G24260.1BjuVA03G43070.134039033838738637536839345847740639139839828140728340427226928426926529027026935237938427128028628226629630026433631636137123621433432832933530831431431030839.0344.9638.7844.4344.3543.2542.1645.2750.9053.0246.7344.5445.8746.1133.3346.7933.4646.4831.7931.3633.2631.5530.8934.2131.2931.1140.4142.7743.6830.1331.1931.4330.9729.6033.1533.7329.6436.5034.3838.3439.0027.6224.6237.8537.1437.4238.1535.4535.8835.7935.3235.075.745.345.705.095.185.515.175.315.976.014.914.905.135.105.414.906.074.996.175.455.795.875.807.145.725.434.704.814.826.046.136.566.986.147.036.566.555.164.864.664.655.335.889.057.838.719.168.335.715.875.725.7257.1962.1255.5062.3463.5866.8665.2868.8662.1860.9659.8563.3662.7164.8556.2161.7856.7962.6360.2553.6264.6655.9459.5050.1552.9161.0547.8746.4643.9238.2340.3440.5439.9161.6957.0856.2468.8552.3059.2355.3654.3049.0947.4749.1053.5651.4645.3851.8049.3147.0049.1848.9971.0963.9272.9364.6861.5862.1161.1762.7263.3063.2360.9661.2861.4357.5175.9460.2974.0357.8764.5279.3762.8272.1669.1777.6276.9368.8878.6178.9276.6461.5163.6866.4365.6463.7264.8062.3063.1467.8968.5165.7166.0459.4161.4065.6965.6466.3864.0366.7262.3663.5764.0665.13-0.822-0.931-0.825-0.920-0.918-0.965-0.927-0.959-0.786-0.805-0.924-0.834-0.930-0.991-0.695-0.884-0.724-0.901-0.729-0.543-0.794-0.624-0.727-0.625-0.628-0.697-0.627-0.681-0.720-0.769-0.697-0.629-0.617-0.676-0.645-0.686-0.649-0.677-0.633-0.534-0.501-1.020-0.822-0.611-0.606-0.639-0.656-0.689-0.730-0.743-0.676-0.688细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核叶绿体细胞核细胞核细胞核细胞质细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核（续 表 1）基因名称Gene name基因IDGene ID氨基酸数量Number of amino acid分子量Molecular weight/kDa理论等电点Theoretical isoelectric point不稳定系数Instability index脂肪系数Aliphatic index总平均亲水性Total average hydrophilicity亚细胞定位Subcellular localization298第 2 期杨巍，等：芥菜全基因组中Hsf基因家族鉴定与分析2.2BjuHsf基因家族成员染色体定位除BjuHsfA1l、BjuHsfA1m、BjuHsfA1n和BjuHsfA7h组装到scoffold外，其余67个基因家族成员均定位到染色体，且所有染色体上均有Hsf基因分布，特别是AA-Chr03分布基因的基因数量最多，多达10个Hsf基因，其次为BB-Chr02与BB-Chr07染色体，均含有6个Hsf基因，而AA-Chr05与AA-Chr06染色体最少，均仅有1个Hsf基因（图1）。2.3BjuHsf基因结构、保守基序分析BjuHsf基因家族成员蛋白共鉴定出20个motif，其中motif1、motif2和motif3属于DBD结合域，所有的 BjuHsf 蛋白均含有 DBD 结合域的 3 个 motif。motif4、motif5属于HR-A/B 区域，motif14属于核定位序列（NLS），motif6属于AHAmotif，motif7属于核外运信号（NES）。在芥菜A、B和C三大类Hsf家族成员中，蛋白质保守基序呈现出组间特异性，BjuHsf基因进化过程相对保守（图2b）。BjuHsf基因结构分析表明，72%的BjuHsf基因基因含有 2 个外显子和 1 个内含子，BjuHsfA7a、BjuHsfA7c及BjuHsfA8a含有3个外显子和2个内含子，BjuHsfC1c与BjuHsfC1d不含内含子，亲缘关系相近的家族成员的基因结构相似，这表明亲缘关系较近的基因的结构具有较强的保守性（图2c）。2.4BjuHsf蛋白结构域分析通过对BjuHsf蛋白进行多序列比对发现DBD与HR-A/B结构域极为保守，BDB结构域由3个螺旋（1、2、3）和4个折叠组成(1-1-2-2-3-3-4)，包含9394个氨基酸，而BjuHsfA7a和BjuHsfA7c在3-3之间多出16个氨基酸，这可能与这些蛋白发挥的特异性功能有关（图3a）。HR-A/B与DBD的C端相邻，包含2个疏水7肽重复区域，它在Hsf-Hsf互作中起着至关重要的作用28。71个BjuHsf基因家族成员的HR-A/B保守域序列比对，结果表明此保守域包含HR-A区域、HR-B区域及两者之间的Insert区域，通常将Insert区域的氨基酸数量将Hsf家族成员归类为A、B、C三大类29，A类与C类Hsf相比B类Hsf分别多出了21个、7个氨基酸残基。所有的BjuHsf蛋白的HR-A区域显示出3处非常保守的疏水性氨基酸位点，其中第1、2处位点为亮氨酸（L），第三处B类仍为亮氨酸（L）、C类替换为甲硫氨酸（M），A类不同亚组替换为多个不同氨基酸，而在HR-B区域不同亚组间的氨基酸种类差异相对较大（图3b）。2.5BjuHsf基因GO功能富集与蛋白互作分析BjuHsf基因GO功能分析结果表明，BjuHsf参与了含核碱基化合物代谢过程的调控，有机物生物合成过程、代谢过程的调控、有机环状化合物代谢过程、细胞芳香化合物代谢过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程的调控、RNA生物合成过程、温度刺激响应和热刺激反应等生物学过程。细胞成分主A类BjuHsf基因标记为红色；B类BjuHsf基因标记为绿色；C类BjuHsf基因标记为蓝色。Class A BjuHsf gene was marked red；Class B BjuHsf gene is marked green；Class C BjuHsf gene is labeled blue.图1BjuHsf基因家族成员基因染色体定位Figure 1Chromosome location of BjuHsf gene family members299四川农业大学学报第 41 卷 要位于细胞核、细胞内膜结合细胞器、膜结合细胞器和胞内细胞器等。主要分子功能涉及转录调控活性、DNA结合转录因子活性、相同蛋白结合和蛋白质同源二聚化活性等（图4a）。BjuHsf家族成员a：BjuHsf蛋白的DBD结构域多序列比对；b：BjuHsf蛋白的HR-A/B结构域多序列比对。a：multiple sequence alignment of DBD domain of BjuHsf protein；b：multiple sequence alignment of HR-A/B domain of BjuHsf protein.图3BjuHsf蛋白序保守域序列比对Figure 3Sequence alignment of BjuHsf protein conservative domaina：BjuHsf系统进化树；b：BjuHsf蛋白保守基序；c：BjuHsf基因结构；d：保守基序logo。a：BjuHsf phylogenetic tree；b：BjuHsf protein conservative motif；c：BjuHsf gene structure，d：conservative motif logo.图2BjuHsf基因家族成员Motif与基因结构Figure 2Motif and gene structure of BjuHsf gene family members300第 2 期杨巍，等：芥菜全基因组中Hsf基因家族鉴定与分析蛋白互作分析表明BjuA3b、BjuA2b、BjuA5b、BjuA1d和BjuA2h为关键核心蛋白与多个家族成员存在相互作用（见图4b）。2.6BjuHsf启动子-顺式作用元件分析利用PlantCARE数据库预测BjuHsf基因启动子区顺式元件，共发现109种顺式作用元件，包含光响应元件、脱落酸响应元件、生长素响应元件、赤霉素响应元件、水杨酸响应元件、防御与压力响应元件、干旱胁迫响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、低温响应元件、创伤响应元件、厌氧胁迫响应元件、类黄酮类合成元件、昼夜节律调控元件、分生组织表达相关顺式元件和胚乳表达调控顺式元件等，表明BjuHsf基因在芥菜应答逆境胁迫、生物合成等方面执行多种生物学功能（图5）。2.7多物种Hsf蛋白系统进化树分析利用芥菜、大白菜和拟南芥Hsf蛋白的全长序列构建了系统性进化树（图6），将BjuHsf蛋白分为A、B、C3个大类，其中A类分为9个亚组A1-A9，B类分为4个亚组B1-B4亚组，C类仅有1个C1亚组，上述进化树聚类结果与HEATSTER数据库的分类结果相一致，同时，3个物种均缺失B5、C2亚组家族成员，这显示出物种进化的特异性。此外，进化树Hsf家族成员的A、C组与B组分别聚类成2个大组，C1亚组属于A2、A7、A6、A1、A8和A3亚组聚类大分枝的外枝，不同亚组家族成员表现出差异的进化关系，如A2与A7，A1与A6、A6与A7、B3与B1、B2与B4分别聚在一起，显示出趋同与趋异的进化趋势。2.8BjuHsf基因家族共线性分析芥菜基因组共线性分析表明，67个BjuHsf基因共产生105个片段重复事件（图7a）。BjuHsf旁系同源基因对Ka/Ks比值均小于1，表明BjuHsf基因受纯化选择压力（图7b）。进一步分析拟南芥、芥菜、大白菜Hsf基因的共线性关系，结果显示芥菜与拟南芥之间共鉴定出68个直系同源基因对，而芥菜与大白菜之间共鉴定出133个直系同源基因对（图7c），这表明芥菜和大白菜的Hsf基因家族具有更近的同源性进化关系。2.9BjuHsf基因在低温胁迫下的表达模式分析叶用芥菜叶片组织中的BjuHsf基因在低温组（9，48 h）与对照组（22，48 h）表达模式如图8所示。从RNA-seq数据中获取了43个BjuHsf家族成员的基因表达量，另外28个BjuHsf基因表达数据未能获取，这可能与基因的表达组织特异性，叶用芥菜与茎瘤芥的遗传差异等因素有关。BjuHsf基因a：BjuHsf 基因功能富集分析，包括生物学过程（biological process，BP）、细胞定位（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF），其中生物学过程仅显示前10项；b：BjuHsf蛋白互作网络分析（protein-protein interaction，PPI），颜色越深表示互作关系越复杂。a：BjuHsf gene function enrichment analysis，including biological process（BP），cellular component（CC）and molecular function（MF），of which biological process only displays the top 10 items；b：BjuHsf protein-protein interaction（PPI），the darker the color，the more complex the interaction.图4BjuHsf基因GO功能富集及蛋白互作分析Figure 4GO function enrichment and protein interaction analysis of BjuHsf gene301四川农业大学学报第 41 卷 在低温胁迫下的表达模式可分为3类，第一类：有8个 BjuHsf 基 因：BjuHsfA1a、BjuHsfA1i、BjuHsfA1m、BjuHsfA1n、BjuHsfA1o、BjuHsfA3b、BjuHsfA4g和BjuHsfA7f，在低温胁迫下的表达量显著上调表达，推测这些基因参与了芥菜低温胁迫应答反应；第二类：有 6 个 BjuHsf 基 因：BjuHsfA1e、BjuHsfA2a、BjuHsfB2b、BjuHsfB2c、BjuHsfB2e 和 BjuHsfB2h，在低温胁迫下的表达量显著下调表达，可能低温胁迫在一定程度上抑制这6个BjuHsf基因的表达；第三类为其他差异表达不显著29个BjuHsf基因。从显著性差异表达的BjuHsf基因分布情况，可