生物切片技术市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

电子显微镜生物超薄切电子显微镜生物超薄切片制备技术片制备技术第1页一、超薄切片技术理论超薄切片技术理论及操作实践及操作实践第2页超薄切片概念超薄切片概念w因为电子显微镜电子束穿透能力限制因为电子显微镜电子束穿透能力限制,大多大多数标本在自然状态下太厚数标本在自然状态下太厚,而无法观察而无法观察,必须必须将各类材料如将各类材料如;生物样品生物样品,合成材料合成材料,塑料塑料,纤纤维维,骨骼骨骼,矿石矿石.金属等切成厚度金属等切成厚度10-100 nm 10-100 nm 超薄片超薄片.才可进行观察才可进行观察.w超薄切片术超薄切片术(The Techniques of Ultrathin(The Techniques of Ultrathin Section)Section)是最基本透射电镜样品制备技术是最基本透射电镜样品制备技术,需要借助超薄切片机制备样品，切片厚度小需要借助超薄切片机制备样品，切片厚度小于于100nm(100nm(普通普通303070nm).70nm).第3页超薄切片应用超薄切片应用w超薄切片术超薄切片术被广泛用于揭示样品超微结被广泛用于揭示样品超微结构。构。w超薄切片术也是超薄切片术也是电镜细胞化学、免疫电电镜细胞化学、免疫电镜镜,电镜放射自显影、电镜放射自显影、X-X-射线微区元素射线微区元素分析分析等技术基础，是硕士物医学样品超等技术基础，是硕士物医学样品超微结构及其功效有力工具。它分为普通微结构及其功效有力工具。它分为普通超薄切片术和冷冻超薄切片术两大类。超薄切片术和冷冻超薄切片术两大类。第4页超薄切片分类w普通超薄切片:不需要特殊不需要特殊冷冻条件和装置常规包埋冷冻条件和装置常规包埋切片技术。切片技术。w冷冻超薄切片:样品快速冷冻,用冷冻超薄切片机进行切片.而不需要常规繁琐固定与包埋程序.第5页普通超薄切片术普通超薄切片术w取材取材-固定固定-脱水脱水-渗透渗透-包埋包埋-聚合聚合-切片切片-染色等几大部分。染色等几大部分。w其中每一部分都是主要步骤，都直接与其中每一部分都是主要步骤，都直接与样品质量相关，而样品质量优劣又与观样品质量相关，而样品质量优劣又与观察结果亲密相关，所认为了得到可靠和察结果亲密相关，所认为了得到可靠和满意结果，需要步步慎重认真。满意结果，需要步步慎重认真。第6页第7页第8页取材和固定标准w取材应遵照取材应遵照准确准确;快速快速;体积小体积小;低温低温;防防损伤损伤，操作标准，操作标准.w优质固定是关键步骤之一优质固定是关键步骤之一;材料体积大材料体积大于于1立方毫米时立方毫米时,因为固定液渗透速率限因为固定液渗透速率限制制,样本中心部位固定效果会受到影响样本中心部位固定效果会受到影响.第9页w超薄切片样品块比石蜡切片小得多，普通约超薄切片样品块比石蜡切片小得多，普通约为为1mm1mm立方毫米；这就要求取材部位一定要准立方毫米；这就要求取材部位一定要准确：以免花费大量劳作，却观察不到所需结确：以免花费大量劳作，却观察不到所需结构。构。w动物被处死之后：机体内组织细胞就脱离了动物被处死之后：机体内组织细胞就脱离了正常生存环境，细胞自溶作用会造成其坏死，正常生存环境，细胞自溶作用会造成其坏死，致使超微结构发生改变而影响研究结果；为致使超微结构发生改变而影响研究结果；为了把这种损伤减到最小，处死动物后，要争了把这种损伤减到最小，处死动物后，要争取在取在1-21-2分钟内完成取材用分钟内完成取材用)，并马上把样品，并马上把样品浸入固定液中浸入固定液中.w样品超微结构极脆弱，为预防各种人为损伤，样品超微结构极脆弱，为预防各种人为损伤，在操作过程中要格外小心，最好选取新尖锐在操作过程中要格外小心，最好选取新尖锐解剖工具解剖工具,操作尽可能轻巧，以防止挤压。操作尽可能轻巧，以防止挤压。第10页取材操作方法w(1)动物组织：用乙醚使动物轻微麻醉，快动物组织：用乙醚使动物轻微麻醉，快速解剖，准确地取下材料；马上浸入速解剖，准确地取下材料；马上浸入2 2一一5 5戊二醛进行戊二醛进行前固定前固定，并用尖锐双面刀片：，并用尖锐双面刀片：将样品切成将样品切成1mm1mm碎块碎块,于于44固定固定1 1小时以上。小时以上。(假如需要更长时间前固定，需适时更换新鲜假如需要更长时间前固定，需适时更换新鲜固定液固定液,并尽可能在；并尽可能在；44冰箱中保留。冰箱中保留。)w用缓冲液处理用缓冲液处理1010一一3030分钟，以洗去前固定液，分钟，以洗去前固定液，然后在然后在44下，用下，用1-21-2四氧化锇四氧化锇(即锇酸即锇酸)进进行行后固定后固定1212小时小时.第11页(2)细菌、单细胞：琼脂包埋法细菌、单细胞：琼脂包埋法w培养细胞：培养细胞：(包含悬浮或贴壁生长包含悬浮或贴壁生长)，对贴壁，对贴壁生长细胞需要先用生长细胞需要先用0 05 5胰酶处理若干分钟，胰酶处理若干分钟，或用薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落，先离或用薄橡胶刷轻轻刮下，使细胞脱落，先离心，心，510510培养液中有机成份，提升样品质量。培养液中有机成份，提升样品质量。)马上马上2 25 5戊二醛，在戊二醛，在44下固定下固定10106060分钟，离心分钟，离心(条件同前条件同前)，弃上清液。先用，弃上清液。先用40405050恒温水浴使恒温水浴使2 2琼脂熔化，并向离心管琼脂熔化，并向离心管中注入适量埋没细胞团，中注入适量埋没细胞团，(离心套管中亦加入离心套管中亦加入温水温水),),离心离心(3 000g(3 000g，1 1分钟分钟)，使其凝固成含，使其凝固成含有细胞团小块，冷却后取出，用尖锐双面刀有细胞团小块，冷却后取出，用尖锐双面刀片切成约片切成约lmmlmm立方毫米碎块即可立方毫米碎块即可.第12页(3)植物材料w植物材料比其它材料稳定,离体后改变稍慢;植物叶片切取宽X长=1X3-4毫米细条,茎和根可切成细条或1毫米立方小块;w表面有毛刺材料,需用酶处理进行软化;w表面有蜡质材料,可在50%乙醇在浸泡数秒钟进行脱蜡.第13页固定目标及良好固定标准固定目标及良好固定标准w因为在电镜下普通不可能观察活细胞，因为在电镜下普通不可能观察活细胞，所以，在电镜观察之前，必须先把细胞所以，在电镜观察之前，必须先把细胞固定固定(杀死杀死)。固定目标，首先是把细胞。固定目标，首先是把细胞可动动态系统转变成不可动、稳固胶体，可动动态系统转变成不可动、稳固胶体，第14页固定概念w用化学法和物理法快速杀死细胞过程第15页固定目标和要求w固定目标是在分子水平上真实保留细胞超微结构每一细节.第16页固定液作用固定液作用w破坏细胞酶系统破坏细胞酶系统,阻止细胞自溶阻止细胞自溶;w稳定细胞物质成份稳定细胞物质成份,核酸核酸,核蛋白核蛋白,糖类糖类,脂类脂类,使它们发生交联使它们发生交联,保留组织成份保留组织成份;w在一些组分分子间以化学和物理反应建立交在一些组分分子间以化学和物理反应建立交联联,提供骨架结构来稳定各种细胞器空间构型提供骨架结构来稳定各种细胞器空间构型;w提供一定电子反差提供一定电子反差.第17页固定剂固定剂w化学固定剂化学固定剂w凝聚固定剂：凝聚固定剂：w此种固定剂能使蛋白质发生不可逆转、永久变性，凝此种固定剂能使蛋白质发生不可逆转、永久变性，凝聚成大块沉淀。聚成大块沉淀。w这类固定剂包含乙醇、丙酮、醋酸、苦味酸及一些重这类固定剂包含乙醇、丙酮、醋酸、苦味酸及一些重金属，它们不适合固定电镜样品，而只适适用于光学金属，它们不适合固定电镜样品，而只适适用于光学显微镜样品固定。显微镜样品固定。w非凝聚固定剂非凝聚固定剂:w此种固定剂使蛋白质交联成稳定凝胶，而蛋白质分子此种固定剂使蛋白质交联成稳定凝胶，而蛋白质分子结构不发生显著改变结构不发生显著改变,.w这类固定剂包含四氧化锇醛类、高锰酸钾、重铬酸这类固定剂包含四氧化锇醛类、高锰酸钾、重铬酸钾等。钾等。第18页固定种类固定种类w按固定液成份划分，可分为单固定、双固定和多重固定等。w单固定是只用戊二醛或四氧化饿固定，普通用于单细胞样品或易渗透样品。w双固定指先用戊二醛或多聚甲醛作前固定，再用四氧化锇作后固定，这种方法效果好，应用广泛。w多重固定指联合使用三种以上固定剂以到达取长补短目标。第19页四氧化锇四氧化锇w能能与与各各种种氨氨基基酸酸、肽肽及及蛋蛋白白质质反反应应，在在蛋蛋白白质分子之间形成交联，使蛋白质固定；质分子之间形成交联，使蛋白质固定；w能与不饱和脂肪酸反应能与不饱和脂肪酸反应,使脂肪得以固定；使脂肪得以固定；w能能够够固固定定脂脂蛋蛋白白，使使生生物物膜膜结结构构主主要要成成份份磷磷脂蛋白稳定；脂蛋白稳定；w能够与变性能够与变性DNA及核蛋白反应及核蛋白反应;w但不能固定天然但不能固定天然DNA,RNA及糖元；及糖元；w含有电子染色效应。含有电子染色效应。第20页醛类固定剂醛类固定剂w这这类类固固定定剂剂优优点点是是穿穿透透力力强强，不不轻轻易易使使酶酶失失活活;w能能够够固固定定糖糖元元及及保保留留微微管管结结构构,长长时时间间固固定定不不会使组织变脆。会使组织变脆。缺点缺点w不能保留脂肪，无电子染色作用不能保留脂肪，无电子染色作用w对细胞膜染色较差。对细胞膜染色较差。w本本组组染染色色剂剂主主要要有有；戊戊二二醛醛、甲甲醛醛、多多聚聚甲甲醛、丙稀醛。醛、丙稀醛。第21页高锰酸钾高锰酸钾w可固定脂蛋白；可固定脂蛋白；w神经髓鞘神经髓鞘;w叶绿体叶绿体;w各种膜结构。各种膜结构。第22页固定方法固定方法w浸泡固定法浸泡固定法;w血管灌注固定法血管灌注固定法;w植物材料固定法植物材料固定法;w培养细胞及细菌固定培养细胞及细菌固定 因为各种固定剂穿透能力不一样因为各种固定剂穿透能力不一样,材料材料材质不一样材质不一样,固定时间亦不一样固定时间亦不一样,普通是普通是用用2-5%2-5%醛类前固定醛类前固定1-31-3小时小时,再用再用1%1%四氧四氧化锇后固定化锇后固定1-21-2小时小时.第23页固定注意点固定注意点w固定剂种类固定剂种类;固定剂浓度固定剂浓度;w固定液固定液PH,PH,渗透压渗透压,离子强度等离子强度等1.1.固定温度固定温度,渗透效率渗透效率;2.2.样品种类样品种类,特点特点,块大小块大小;3.3.固定之后缓冲液充分清洗固定之后缓冲液充分清洗,防止固定液之间、防止固定液之间、固定液与脱水剂之间反应或产生沉淀固定液与脱水剂之间反应或产生沉淀;4.4.特殊材料预处理特殊材料预处理,植物有气泡而漂浮植物有气泡而漂浮,真菌孢真菌孢子与水溶液不亲和性子与水溶液不亲和性.利用抽真空利用抽真空,加辅助剂加辅助剂以帮助固定液渗透以帮助固定液渗透.第24页良好固定细胞成份超微结构形态良好固定细胞成份超微结构形态细胞壁和细胞膜细胞质基质内质网(粗糙型)膜内质网(光滑型)膜w致密并基本分层,无断裂w微细颗粒沉淀,无空白空间w扁平腔,两侧均匀排列核糖蛋白体颗粒w完整分叉管,无核糖蛋白体颗粒高尔基体高尔基体线粒体线粒体核膜核膜核内容物核内容物质膜质膜w完整膜,扁平曩池成叠排列w无膨胀,无收缩,双层膜与内膜完整,基质致密w双层膜平行,无损伤w密度均匀,染色质团分散在核膜附近w完整,低倍时为单层,高倍为三层结构质体质体w外层双层结构,片层结构相互联接,基质致密第25页脱脱 水水w脱水是用适当有机溶剂取代细胞中游离水脱水是用适当有机溶剂取代细胞中游离水,组组织结构中水分在电镜高真空状态下急聚收缩织结构中水分在电镜高真空状态下急聚收缩而遭到破坏而遭到破坏;同时惯用包埋剂是非水溶性同时惯用包埋剂是非水溶性,细细胞中游离水影响包埋剂浸透胞中游离水影响包埋剂浸透,所以必须用一个所以必须用一个和水及渗透均能互溶惰性液体完全取代之。和水及渗透均能互溶惰性液体完全取代之。w惯用脱水剂惯用脱水剂:乙醇乙醇,丙酮丙酮,环氧丙烷环氧丙烷.聚乙二醇聚乙二醇及环氧丙烷等及环氧丙烷等w选取脱水剂与包埋剂相关选取脱水剂与包埋剂相关,彼此应是互溶彼此应是互溶.第26页组织块脱水步骤组织块脱水步骤30%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,450%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,470%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,4,可延长或过夜可延长或过夜90%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟,室温进行室温进行100%乙醇或丙酮乙醇或丙酮1015分钟分钟X X2次次第27页浸透与包埋浸透与包埋w浸透：用某种液体介质（包埋剂）渗透浸透：用某种液体介质（包埋剂）渗透组织块取代脱水剂，这种液体介质能聚组织块取代脱水剂，这种液体介质能聚合、硬化成固体，并提供足够弹性方便合、硬化成固体，并提供足够弹性方便进行超薄切片。进行超薄切片。第28页浸透与包埋浸透与包埋w浸透与包埋目标是使包埋剂逐步渗透入组织浸透与包埋目标是使包埋剂逐步渗透入组织内部内部,方便与细胞外包埋剂同时聚合方便与细胞外包埋剂同时聚合,确保样确保样品有均匀硬度品有均匀硬度,利于切片操作利于切片操作.w浸透浸透：用脱水剂与包埋剂按一定百分比混合：用脱水剂与包埋剂按一定百分比混合.将样品在将样品在25-3725-37时与样品反应时与样品反应1-51-5小时小时.w包埋包埋：在浸透后使用纯包埋剂：在浸透后使用纯包埋剂.将温度逐步升将温度逐步升高至高至60,60,使包埋剂发生聚合反应使包埋剂发生聚合反应,聚合不少聚合不少于于4848小时小时.第29页浸透剂配制及浸透时间浸透剂配制及浸透时间脱水剂脱水剂:包埋剂包埋剂动物材料动物材料植物材料植物材料体外培养体外培养细胞细胞3:11小时10.51:1141120.511:3122120.5第30页包埋剂性质包埋剂性质w包埋剂要求包埋剂要求;1.1.有适当硬度和良好切割性能有适当硬度和良好切割性能;2.2.较低粘度较低粘度,利于自由渗透入样品利于自由渗透入样品;3.3.能溶于脱水剂能溶于脱水剂;4.4.透明度好透明度好,有一定反差有一定反差;5.5.聚合前后体积不发生大改变聚合前后体积不发生大改变,能经受电子速轰能经受电子速轰击击;6.6.高倍镜下不显示本身任何细微结构高倍镜下不显示本身任何细微结构.7 7 起源丰富，无毒无害。起源丰富，无毒无害。第31页惯用包埋剂及配方惯用包埋剂及配方w环氧树脂是通惯用包埋剂环氧树脂是通惯用包埋剂,其含有对细其含有对细胞细微结构有很好保留性能胞细微结构有很好保留性能,聚合后体聚合后体积收缩改变不大积收缩改变不大(2-5%),(2-5%),在真空中能经在真空中能经受较长时间轰击受较长时间轰击.w缺点缺点:操作不太方便操作不太方便;电子反差较弱电子反差较弱.第32页环氧树脂聚合原理环氧树脂聚合原理w环氧树脂为热朔性树脂环氧树脂为热朔性树脂,呈淡黄色半液体呈淡黄色半液体,与与一定百分比硬化剂、加速剂在一定温度下形一定百分比硬化剂、加速剂在一定温度下形成不可朔交联黄色固体成不可朔交联黄色固体.其反应实质其反应实质:它有两它有两种化学反应基团种化学反应基团,结构链两端是还氧基结构链两端是还氧基,中间中间有羟基有羟基,还氧末端打开后与胺类结合还氧末端打开后与胺类结合,所以所以,一一但胺基结合上去但胺基结合上去,头尾相接头尾相接.聚会成长链聚会成长链;同时同时中间羟基易与酸酐联合中间羟基易与酸酐联合,形成树脂分子间横桥形成树脂分子间横桥,故将树脂、胺、酸酐混合加热故将树脂、胺、酸酐混合加热,便发生三维聚便发生三维聚合合,形成稳定含聚酯、聚醚、抗热溶惰性物质形成稳定含聚酯、聚醚、抗热溶惰性物质.第33页wEpon812Epon812包埋剂包埋剂:组成组成:Epon812-环氧树脂环氧树脂DDSA-十二烷基琥珀酸酐十二烷基琥珀酸酐(软性固化剂软性固化剂)MNA-六甲酸酐六甲酸酐(硬性固化剂硬性固化剂)DMP-30-2,4,6-三三(二甲基氨基甲基苯酚二甲基氨基甲基苯酚)(加速剂加速剂)w甲基丙稀酸脂甲基丙稀酸脂组成组成:甲基丙稀甲脂甲基丙稀甲脂(硬性固化剂硬性固化剂)甲基丙稀丁脂甲基丙稀丁脂(软性固化剂软性固化剂)氧化苯甲脂氧化苯甲脂(催化剂催化剂)w聚酯树脂聚酯树脂w水溶性包埋剂水溶性包埋剂)第34页包埋方式包埋方式w常规包埋法常规包埋法;w定向包埋法定向包埋法;w倒扣胶囊包埋法倒扣胶囊包埋法;w细胞原位包埋法细胞原位包埋法第35页徕卡超薄切片机徕卡超薄切片机第36页超超薄薄切切片片机机模模式式图图第37页修修块块方方法法示示意意图图第38页LKB 7800 B LKB 7800 B 型型 制制 刀刀 机机第39页优质刀和劣质刀模式图优质刀和劣质刀模式图第40页玻璃刀水槽制作过程玻璃刀水槽制作过程第41页载网和支持膜载网和支持膜载网载网w（一）（一）.载网选择载网选择 w 1 1）材质）材质w 2 2）载网直径尺寸）载网直径尺寸w 3 3）孔形）孔形第42页第43页载网清洗载网清洗w新网清洗新网清洗-去油污去油污 无水乙醇无水乙醇(3(3次次)-)-丙酮丙酮-无尘烘干无尘烘干w旧网清洗旧网清洗 1 1）酸碱法酸碱法H H2 2SOSO443 3分钟分钟H H2 2O 3O 3次次-NH-NH3 3OH3OH3分钟分钟CC2 2H H5 5OHOH烘干烘干1:1=1:1=蒸馏水蒸馏水:冰醋酸冰醋酸数次数次-蒸馏水蒸馏水100%100%乙醇乙醇2 2次次烘干烘干10%NaOH10%NaOH煮数分钟煮数分钟-100%-100%乙醇乙醇2 2次次烘干烘干 2 2）超声波清洗法超声波清洗法第44页样品支持膜制备样品支持膜制备w（一）（一）福尔莫瓦膜福尔莫瓦膜w（二）（二）火棉胶膜火棉胶膜w（三）（三）帕罗丁支持膜帕罗丁支持膜w（四）（四）碳膜碳膜w（五（五）微筛膜微筛膜w1）哈气法）哈气法2）甘油法）甘油法3）气压法）气压法第45页样品支持膜特点样品支持膜特点w支持膜本身没有结构，薄而透明，易被电子支持膜本身没有结构，薄而透明，易被电子穿透，有足够机械强度，经得住电子束轰击；穿透，有足够机械强度，经得住电子束轰击；不与样品发生化学反应。其厚度在不与样品发生化学反应。其厚度在150A150A左右左右为宜，太厚会增加电子散射，降低分辨率和为宜，太厚会增加电子散射，降低分辨率和反差。反差。w惯用支持膜有福尔艾瓦惯用支持膜有福尔艾瓦(Formvar)膜、火棉胶膜、火棉胶膜、帕罗丁膜、帕罗丁(Parlodion)膜、碳膜。膜、碳膜。前几个是有机膜，能满足普通分辨率要求，对于高分辨率研究，需用纯碳膜。有时为了增强有机膜强度，可再喷度一层碳作为加固膜。第46页制备膜条件及要求制备膜条件及要求w1）膜厚度；）膜厚度；150Aw2)膜强度；膜强度；w3）制制作作时时环环境境如如温温度度，湿湿度度，空气含尘度空气含尘度等等第47页样品支持膜制备w1 1福尔瓦膜：福尔莫瓦化学名称是聚福尔瓦膜：福尔莫瓦化学名称是聚乙烯醇缩甲醛，特点是机械强度高。乙烯醇缩甲醛，特点是机械强度高。w常配成常配成0.2-0.50.2-0.5氯仿氯仿(或二氯乙烯或二氯乙烯)溶液，用洁净玻片浸入溶液后取出，表溶液，用洁净玻片浸入溶液后取出，表而形成一层薄膜，然后利用水表面张力而形成一层薄膜，然后利用水表面张力作用，将膜剥离到水面上。作用，将膜剥离到水面上。w 第48页1.1.沾取膜溶液沾取膜溶液 2.2.膜形成膜形成 3.3.膜剥离膜剥离 4.4.漂膜浮漂膜浮 5.5.放置铜网放置铜网 6.6.捞膜捞膜第49页w2火棉胶膜：火棉胶机械强度比福火棉胶膜：火棉胶机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作较轻易。尔莫瓦膜弱，但制作较轻易。w常配成常配成12醋酸异戊酯醋酸异戊酯(或醋酸戊或醋酸戊酯酯)溶液，采取漏斗法或贴附法制膜。溶液，采取漏斗法或贴附法制膜。火棉胶溶液滴在水面上后，能自行火棉胶溶液滴在水面上后，能自行散开形成薄膜，然后排除或吸去水散开形成薄膜，然后排除或吸去水溶液，膜自然降到铜网上溶液，膜自然降到铜网上。第50页a.漏斗法漏斗法b.平皿法平皿法1.火棉胶火棉胶2.蒸馏水蒸馏水3.漏斗漏斗4.铜网铜网5.吸吸管管6.水阀水阀7.滤纸滤纸8.平皿平皿第51页w3帕罗丁支持膜：帕罗丁支持膜：当前国外较多用当前国外较多用帕罗丁支持膜。帕罗丁支持膜。w普通配制普通配制3030左右帕罗丁醋酸戊酯溶液左右帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法和火棉胶膜制法相同，其强制膜，方法和火棉胶膜制法相同，其强度优于火棉胶膜。度优于火棉胶膜。第52页w4.碳膜碳膜:碳膜机械性能及化学稳定性好，碳膜机械性能及化学稳定性好，适合高分辨率样品观察。通常是利用真适合高分辨率样品观察。通常是利用真空喷镀仪，采取碳升华喷镀法制备空喷镀仪，采取碳升华喷镀法制备.w复合支持膜复合支持膜:为增强有机膜机强度为增强有机膜机强度,在在有机膜上再喷度有层有机膜上再喷度有层50100A碳膜碳膜.使之使之有良好透明度有良好透明度.第53页1.真空罩2.碳棒3.对照白磁板4.铜网第54页w5 5微孔支持膜微孔支持膜(微筛微筛)：采取特殊方：采取特殊方法在有机膜上形成大量微筛孔法在有机膜上形成大量微筛孔,因为因为穿孔处无支持膜背景影响，切片样穿孔处无支持膜背景影响，切片样品反差和分辨率更加好。适合高分品反差和分辨率更加好。适合高分辨率样品观察辨率样品观察.其制备方法有哈气法、其制备方法有哈气法、甘油法及气压法。甘油法及气压法。w (1)(1)哈气法：哈气法：w (2)(2)甘油法：甘油法：w (3)(3)气压法气压法第55页w(1)哈气法：当玻片从福尔莫瓦溶液中哈气法：当玻片从福尔莫瓦溶液中慢慢提出后，在溶剂慢慢提出后，在溶剂(氯仿等氯仿等)，还未挥，还未挥发发之前，对着玻片上薄膜轻轻哈气，便会之前，对着玻片上薄膜轻轻哈气，便会形成大量微筛孔，待干后剥落在水面即形成大量微筛孔，待干后剥落在水面即成微孔支持膜。成微孔支持膜。第56页w(2)甘油法：仅在福尔艾瓦膜溶液中甘油法：仅在福尔艾瓦膜溶液中加入少许甘油，按常规福尔莫瓦膜加入少许甘油，按常规福尔莫瓦膜制备方即可制得微筛孔约制备方即可制得微筛孔约0.0525um之间支持膜。之间支持膜。第57页w(3)(3)气压法：将一洁净新玻片浸入福气压法：将一洁净新玻片浸入福尔莫瓦溶液，取出后放到另一个充尔莫瓦溶液，取出后放到另一个充痛二氯乙烯饱和蒸汽密闭器皿内痛二氯乙烯饱和蒸汽密闭器皿内10102020分钟，待多出溶液流掉后，将分钟，待多出溶液流掉后，将盖打开马上向玻片上喷温湿空气盖打开马上向玻片上喷温湿空气,未未干玻片上凝集了湿气后干玻片上凝集了湿气后,大量水滴将大量水滴将薄福尔莫瓦破开成很多微孔薄福尔莫瓦破开成很多微孔.第58页第59页修修块块w修块是成功切出完美切片带关键。通修块是成功切出完美切片带关键。通常经过手工或机器将包埋块修成金字塔常经过手工或机器将包埋块修成金字塔形形(四面锥体形四面锥体形)，块面为梯形或长方形，块面为梯形或长方形，其上下底边一定要平行。块面不宜太宽，其上下底边一定要平行。块面不宜太宽，不然会造成切片过程阻力增大，在切片不然会造成切片过程阻力增大，在切片上形成波纹材颤痕。上形成波纹材颤痕。第60页第61页第62页对刀w切片对刀过程是按一定要求逐步缩短标切片对刀过程是按一定要求逐步缩短标本块顶面与刀口间距离使之尽可能靠近，本块顶面与刀口间距离使之尽可能靠近，但绝不触挨着。这一步非常主要，操作但绝不触挨着。这一步非常主要，操作时应格外小心和耐心。很多钻石刀是因时应格外小心和耐心。很多钻石刀是因对刀操作不慎而遭损伤。尽管钻石刀可对刀操作不慎而遭损伤。尽管钻石刀可切很硬标本，但从刀口侧面来力极易损切很硬标本，但从刀口侧面来力极易损坏刀口坏刀口第63页第64页第65页w对于对于REICHERT，RMC，LKBNOVA以后各型切片机，对刀时一定要使用其以后各型切片机，对刀时一定要使用其暗视野光源暗视野光源(刀座下光源刀座下光源)，这时经修整，这时经修整包埋顶面会有良好干涉反光，利用它可包埋顶面会有良好干涉反光，利用它可清楚、准确地判断刀口与它清楚、准确地判断刀口与它埋块之间距埋块之间距离，实现快速、安全对刀，有效地降低离，实现快速、安全对刀，有效地降低损坏刀口损坏刀口危险性。危险性。第66页w对于对于LKB、N、V型等无这种光型等无这种光源切片机，可经过在刀座上粘一源切片机，可经过在刀座上粘一铝箔纸或自己加装一简单光源铝箔纸或自己加装一简单光源(可可用手电光源改装用手电光源改装)，以方便对刀操，以方便对刀操作。作。第67页w对刀时务必锁住切片机标本臂。尤其是对刀时务必锁住切片机标本臂。尤其是对于对于REICHERT各种切片机，一定要将各种切片机，一定要将右边手轮锁住后再对刀，不然极易发生右边手轮锁住后再对刀，不然极易发生损坏钻石刀意外事故。损坏钻石刀意外事故。第68页注意w为了切片顺利、确保钻石刀经久耐用，请一为了切片顺利、确保钻石刀经久耐用，请一定：定：w 不要将有机溶剂不要将有机溶剂(如丙酮等如丙酮等)加到槽液里，因加到槽液里，因为它们：为它们：w 可能会软化或侵蚀刀口两旁封槽树脂，造可能会软化或侵蚀刀口两旁封槽树脂，造成漏水；成漏水；w 会降低水表面张力，造成切片展开不匀；会降低水表面张力，造成切片展开不匀；w 会损伤标本细微结构。会损伤标本细微结构。第69页第70页第71页第72页第73页切片w正确对刀：包埋块顶面各边应与刀口平行正确对刀：包埋块顶面各边应与刀口平行显微镜调至高倍操作。显微镜调至高倍操作。w旋紧刀台、标本夹头、标本臂上相关螺旋紧刀台、标本夹头、标本臂上相关螺w将双筒显微镜仔细查对随刀质控检测卡，按将双筒显微镜仔细查对随刀质控检测卡，按要求调整好各项参数要求调整好各项参数(切片速度、切片速度、间隙角、切间隙角、切片厚度片厚度)。w调整刀槽里水平面，直至浸湿刀口、又有良调整刀槽里水平面，直至浸湿刀口、又有良好反光面。好反光面。钉。钉。第74页w切片厚度应控制在各种钻石刀所限范围切片厚度应控制在各种钻石刀所限范围内：超薄内：超薄200nm200nm，半薄片，半薄片1um1um，冷冻超薄，冷冻超薄1um1um，光镜切片，光镜切片5um5um。w包埋块应聚合完全，切片不宜过宽；包埋块应聚合完全，切片不宜过宽；w捞片时应防止手指、镊子、载网、白金捞片时应防止手指、镊子、载网、白金耳环等硬物碰触刀口；耳环等硬物碰触刀口；第75页w通常切片过程中，在即将切到标本时，通常切片过程中，在即将切到标本时，标本会带水，此时可适当降低液面，用标本会带水，此时可适当降低液面，用滤纸条吸干标本上水，待切到标本时再滤纸条吸干标本上水，待切到标本时再提升液面至既浸湿刀口又有良好反光。提升液面至既浸湿刀口又有良好反光。w若刀口后面脏若刀口后面脏(如粘有残片如粘有残片)，也会造，也会造成标本带水。成标本带水。第76页问题：问题：颤痕颤痕w原因：切片出现波纹状颤痕原因：切片出现波纹状颤痕,可能是：可能是：w 外界震动外界震动(人员走动、建筑工地、人员走动、建筑工地、机器等机器等)，w 切片机未放稳或机器本身有问题；切片机未放稳或机器本身有问题；第77页切片震颤切片震颤w相关部件相关部件(标本夹、刀子、刀架等标本夹、刀子、刀架等)固定固定不紧：不紧：w切片太宽、切片过程阻力太大；切片太宽、切片过程阻力太大；w对刀时标本相对刀口高低位置不妥；对刀时标本相对刀口高低位置不妥；w包埋块聚合不好或块太软；包埋块聚合不好或块太软；w间隙角太小、造成标本面与钻石刀面摩间隙角太小、造成标本面与钻石刀面摩擦。擦。w将切片机移位，避开震源；将切片机移位，避开震源；第78页切片不能连成带切片不能连成带w包埋块太软；包埋块太软；w刀角太大；刀角太大；w刀口变钝；刀口变钝；w间隙角太大；间隙角太大；w切片速度太快切片速度太快w用烘烤用烘烤冷冻法使标本变硬冷冻法使标本变硬第79页切片缺痕切片缺痕w因刀口有缺口造成切片上有缺痕外，还有：因刀口有缺口造成切片上有缺痕外，还有：w标本聚合不好；或软硬度不均匀标本聚合不好；或软硬度不均匀;w树脂对标本渗透不佳；树脂对标本渗透不佳；w换另一包埋块。换另一包埋块。第80页捞捞片片w捞片前请先用滤纸条蘸三氯甲烷或二甲捞片前请先用滤纸条蘸三氯甲烷或二甲苯置切片上方熏片，这么得到切片更薄、苯置切片上方熏片，这么得到切片更薄、更平整。更平整。w用睫毛笔将切片带轻轻拨开，使切片带用睫毛笔将切片带轻轻拨开，使切片带34个为宜。个为宜。w选取铜网，以膜面朝下，轻轻粘取切片，选取铜网，以膜面朝下，轻轻粘取切片，一个铜网上可粘取一个铜网上可粘取12排切片带。排切片带。第81页切片厚度判断切片厚度判断w理想状态下，水槽液面上漂浮一条厚度均匀理想状态下，水槽液面上漂浮一条厚度均匀连续切片带，在实际操作中干扰原因造成片连续切片带，在实际操作中干扰原因造成片厚薄相差较大。经过切片机上干涉光判断切厚薄相差较大。经过切片机上干涉光判断切片厚薄。片厚薄。干涉颜色干涉颜色暗灰色暗灰色灰色灰色银白色银白色金黄色金黄色紫色紫色切片厚度切片厚度A400以下 400500500700700900900以上第82页切片染色切片染色w染色意义：组成生物样品原子序数较低，散射电子能染色意义：组成生物样品原子序数较低，散射电子能力都较弱，相互无显著电子散射差异，切片需要染色力都较弱，相互无显著电子散射差异，切片需要染色后方可提升样品电子反差后方可提升样品电子反差,利于观察。利于观察。w电子染色：即用铀、铅、锇、钨等重金属盐类中重金电子染色：即用铀、铅、锇、钨等重金属盐类中重金属与样品中一些成份结合或被吸附，不一样结构上吸属与样品中一些成份结合或被吸附，不一样结构上吸附不等数量重金属原子附不等数量重金属原子,结合较多区域（结构致密，原结合较多区域（结构致密，原子序数较高），含有强电子散射能力，在电镜下为致子序数较高），含有强电子散射能力，在电镜下为致密黑色，结合较少区域为浅灰色、灰黑色，没有结合密黑色，结合较少区域为浅灰色、灰黑色，没有结合区域为电子透明；所以经过染色提升样品电子反差，区域为电子透明；所以经过染色提升样品电子反差，增加图像清楚度。增加图像清楚度。第83页电子染色剂w醋酸双氧铀醋酸双氧铀：提升核酸，蛋白质，组织纤维反差，：提升核酸，蛋白质，组织纤维反差，对膜结构染色效果不理想。配制对膜结构染色效果不理想。配制135070乙醇溶液或水饱和溶液。乙醇溶液或水饱和溶液。缺点：对光不稳定，含有放射性和化学毒性缺点：对光不稳定，含有放射性和化学毒性w铅盐染色剂：铅盐染色剂：密度大，对各种细胞结构有亲和作密度大，对各种细胞结构有亲和作用，提升细胞膜系统及脂类物质反差。在高用，提升细胞膜系统及脂类物质反差。在高PH（1112）条件适用。）条件适用。缺点：毒性较大，易与空气中缺点：毒性较大，易与空气中CO2结合在样品上产结合在样品上产生沉淀生沉淀第84页染色方法w单染色：醋酸铀单染样品单染色：醋酸铀单染样品w双染色：醋酸铀双染色：醋酸铀柠檬酸铅柠檬酸铅w块染色块染色：双固定后，脱水前用含醋酸铀：双固定后，脱水前用含醋酸铀5070乙醇溶液染色乙醇溶液染色2030分钟分钟第85页第86页第87页冷冻超薄切片技术w冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切片和电镜超薄切片基础上发展技术。片和电镜超薄切片基础上发展技术。w冷冻超薄切片技术不需常规超薄切片固冷冻超薄切片技术不需常规超薄切片固定、脱水、渗透、包埋等程序。定、脱水、渗透、包埋等程序。第88页分类（一）（一）w样品样品不经任何处理不经任何处理直接进行冷冻固定直接进行冷冻固定，再进行冷冻切片再进行冷冻切片。适用橡胶，朔料等弹性材料及高分子材适用橡胶，朔料等弹性材料及高分子材料。以及生物材料中进行放射自显影和料。以及生物材料中进行放射自显影和X X射线微区分析新鲜样品，利于保留材射线微区分析新鲜样品，利于保留材料中可溶性物质及生物大分子活性和天料中可溶性物质及生物大分子活性和天然然分布。分布。第89页（二）（二）w用醛固定和冷冻保护剂处理，再进行冷用醛固定和冷冻保护剂处理，再进行冷冻固定和超薄切片。冻固定和超薄切片。适合进行形态学、细胞化学、免疫化学适合进行形态学、细胞化学、免疫化学研究研究第90页冷冻超薄切片程序冷冻超薄切片程序1.1.醛固定醛固定 2.2.冷冻保护处理冷冻保护处理 3.3.快速冷冻固定快速冷冻固定 4.4.冷冻差异切片冷冻差异切片 第91页醛固定w戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛等用戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛等用0.1M0.1M二甲砷酸钠配成二甲砷酸钠配成2.52.5溶液，对溶液，对样品固定样品固定15156060分钟。分钟。第92页冷冻保护处理冷冻保护处理w其作用是提升细胞内溶液浓度。降低其作用是提升细胞内溶液浓度。降低冷冻点，缩小冷冻点与再晶点温差，冷冻点，缩小冷冻点与再晶点温差，防止冰晶形成，保护样品超微结构。防止冰晶形成，保护样品超微结构。w惯用冷冻保护剂：惯用冷冻保护剂：1.2030甘油溶液，甘油溶液，2.0.62.3M蔗糖溶液蔗糖溶液3.20二甲基亚碸，二甲基亚碸，4.5聚乙稀醇。聚乙稀醇。第93页冷冻固定原理（94）w富含水分新鲜生物材料，在降温冷冻过程中，常规发富含水分新鲜生物材料，在降温冷冻过程中，常规发生如图生如图A A，B B，C C改变。结果在细胞内外产生大量大小改变。结果在细胞内外产生大量大小不一冰晶，造成超微结构改变，这就是常见冰晶损伤。不一冰晶，造成超微结构改变，这就是常见冰晶损伤。w冰晶形成是因为生物体大都含有丰富水分冰晶形成是因为生物体大都含有丰富水分(约占其重约占其重量量7070一一9090)，在冷冻过程中，水分子结合生成一定，在冷冻过程中，水分子结合生成一定大小晶核，晶核逐步长大形成冰晶。大小晶核，晶核逐步长大形成冰晶。w冷冻固定冷冻固定目标是使样品在冷冻处理过程中快速冻结、目标是使样品在冷冻处理过程中快速冻结、硬化，保持样品原有超微结构和化学成份，改进一些硬化，保持样品原有超微结构和化学成份，改进一些物理特征，利于断裂、蚀刻、切片、干燥等深入处理物理特征，利于断裂、蚀刻、切片、干燥等深入处理。第94页细胞冷冻过程中产生冰晶损伤细胞冷冻过程中产生冰晶损伤第95页冷冻速度影响冷冻速度影响w样品以慢速度冷冻时，细胞外部水分首先形成样品以慢速度冷冻时，细胞外部水分首先形成冰晶，造成细胞脱水收缩，伴随温度降低，细冰晶，造成细胞脱水收缩，伴随温度降低，细胞内水分也形成冰晶，影响细胞器分布并造成胞内水分也形成冰晶，影响细胞器分布并造成超微结构破坏。冷冻速度不一样，形成冰晶大超微结构破坏。冷冻速度不一样，形成冰晶大小也不一样。从观察角度讲，考虑到电镜分辨小也不一样。从观察角度讲，考虑到电镜分辨率高，应尽可能预防产生大于率高，应尽可能预防产生大于100A100A冰晶，从冰晶，从细胞结构角度看，冰晶颗粒只要小于细胞结构角度看，冰晶颗粒只要小于20nm20nm就就不会对细胞造成严重影响。不会对细胞造成严重影响。300秒秒500秒秒800秒秒0.1um0.05um0.03um第96页冷冻温度影响冷冻温度影响w水分结冰时，温度与形成冰形关系。样品水分结冰时，温度与形成冰形关系。样品在进行冷冻处理过程中，若使样品快速降在进行冷冻处理过程中，若使样品快速降低到低到-160-160以下，细胞内水分来不及逸出，以下，细胞内水分来不及逸出，而细胞外水分几乎在同时冻结成而细胞外水分几乎在同时冻结成玻璃态冰玻璃态冰，很好地保留了细胞生活时状态和超微结构，很好地保留了细胞生活时状态和超微结构，这就是理想冷冻固定过程。这就是理想冷冻固定过程。-70-70-70-70-130-130-130-130-120-120-120-120-140-140-140-140 -160 -160 -160 -160六角形六角形立方形立方形立方形立方形玻璃态玻璃态六角形六角形立方形立方形无定形无定形有序有序有序有序无序无序第97页冷冻点与再结晶点温差关系冷冻点与再结晶点温差关系w在冷冻情况下，当细胞内液开始凝固时温度称为冷冻点，在冷冻情况下，当细胞内液开始凝固时温度称为冷冻点，此时冰晶开始形成，但极微小而且固、液共存，对细胞此时冰晶开始形成，但极微小而且固、液共存，对细胞结构