临床基因扩增检验质量保证.ppt

临床基因扩增检验质量保证质量保证质量保证()l为一产品或效劳满足特定质量为一产品或效劳满足特定质量要求提供充分可信性所必要的要求提供充分可信性所必要的有方案的和系统的措施。有方案的和系统的措施。l 2021/1/122室内质量控制室内质量控制 )的概念的概念l由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精细度，进步本监测和控制本实验室工作的精细度，进步本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。一项工作。l可概括为可概括为:(1):(1)执行者：实验室技术人员；执行者：实验室技术人员；(2)(2)目的：监测实验室测定的重复性；目的：监测实验室测定的重复性；(3)(3)功能：功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。是对实验室测定的即时性评价。2021/1/123室间质量评价室间质量评价 ,l为为客客观观比比较较一一实实验验室室的的测测定定结结果果与与靶靶值值的的差差异异，由由外外单单位位机机构构，采采取取一一定定的的方方法法，连连续续、客客观观地地评评价价实实验验室室的的结结果果，发发现现误误差差并并校校正正结结果果，使使各各实实验验室室之之间间的的结结果果具具有有可可比比性性。这这是是对对实实验验室室操操作作和和实实验验方方法法的的回回忆忆性性评评价价，而而不不是是用用来来决决定定在在实实时时的的测测定定结结果果的的可可承承受受性性。当当用用来来为为执执业业答答应应或或实实验验室室认认证证的的目目的的而而评评价价实实验验室室操操作作时时，常常描描绘绘为为实实验验室室才能验证才能验证,。在以前的文献中，常描绘室间质量控制。在以前的文献中，常描绘室间质量控制。2021/1/124批批()()l在一样条件下所获得的一组测定。在一样条件下所获得的一组测定。2021/1/125定 义l正态分布正态分布()当一质控物用同一方法在当一质控物用同一方法在不同的时间重复屡次测定，当测定数据不同的时间重复屡次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的有测定值的均值，左右对称的“钟形钟形曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。2021/1/126正态分布的根本统计学含义可用均数X、标准差s和概率来说明。2021/1/127临床基因扩增检验实验室常规测定步骤l标本搜集：选择测定工程、标本搜集和保存。标本搜集：选择测定工程、标本搜集和保存。l实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。值。l报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。2021/1/128质量保证、室内质控和室间质评之间的关系2021/1/129临床标本搜集、运送、保存临床标本搜集、运送、保存及其质量控制及其质量控制 l标本搜集 l标本保存l标本运送 2021/1/1210标本搜集l标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集时间对扩增检测结果的影响 l标本采集部位的准备标本采集部位的准备 l标本的类型和采集量标本的类型和采集量 l采样质量的评价采样质量的评价 l采样及运输容器采样及运输容器 l标本采集中的防污染标本采集中的防污染 2021/1/1211标本采集时间对扩增检测结果的影响l在疾病开展过程中，标本采集过早或过在疾病开展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。晚都可能会给出假阴性结果。2021/1/1212标本采集部位的准备l血液标本采集血液标本采集l分分泌泌物物标标本本:采采集集部部位位的的清清洁洁消消毒毒可可去去掉掉污污染染的的微微生生物物或或其其它它杂杂物物,但但应应适适度度,过过度度清清洁洁消消毒毒有有可可能能会会去去掉掉或或破破坏坏靶靶微微生生物物,故故标标本本采采集集部部位位的的准准备备应应由由训训练练有有素素的的人人员员进展。进展。2021/1/1213标本的类型和采集量l标本的类型标本的类型:血清血清(浆浆)、分泌物、痰、分泌物、痰、粪便、尿和脑脊液等。粪便、尿和脑脊液等。l标本的采集量标本的采集量:应根据所测病原体而定。应根据所测病原体而定。一般来说，假如标本的量对病原体培一般来说，假如标本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。提取及其后的扩增检测。l对于定量测定来说，对标本的搜集要对于定量测定来说，对标本的搜集要求更为准确。求更为准确。2021/1/1214采样质量的评价l血清血清(浆浆)标本标本:溶血、脂血等；溶血、脂血等；l分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，分泌物、痰：评价内容包括细胞组成，所需类型细胞的数量和核酸总量。所需类型细胞的数量和核酸总量。l 评价方法：包括肉眼观察评价方法：包括肉眼观察,显微镜下观显微镜下观察和化学分析等。察和化学分析等。2021/1/1215采样及运输容器 l标本的采集材料如棉签应为一次性使标本的采集材料如棉签应为一次性使用；用；l采样及运输容器应为密闭的一次性无采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置；菌装置；l采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。成干扰。2021/1/1216标本采集中的防污染标本采集中的防污染 l采集中要特别注意污染，防止混入采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等；操作者的头发、表皮细胞、痰液等；l 如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的失活。以使可能存在的失活。2021/1/1217标本保存标本保存 l靶核酸靶核酸(尤其是尤其是)易受核酸酶的作易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为对于核酸扩增测定的有效性极为重要。重要。l使用作为稳定剂保存标本，标本使用作为稳定剂保存标本，标本可在室温下稳定约可在室温下稳定约7天。天。2021/1/1218标本保存标本保存l临床体液标本长期保存应在-70下。l如为提取核酸后用于扩增分析的样本，可于10 ,1(7.58.0)缓冲液中4 下保存。l用于扩增分析的样本，则应于上述缓冲液中-80或液氮下保存。l核酸的乙醇沉淀物则可于-20下保存。2021/1/1219标本运送标本运送 l样本一经采集，则应尽可能快的送至检样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。测实验室。l样本中如参加了适当的稳定剂样本中如参加了适当的稳定剂,如用于测如用于测定参加的血清定参加的血清(浆浆)样本和用于测定的抗样本和用于测定的抗凝血等凝血等,则可在室温下运送或邮寄。则可在室温下运送或邮寄。l实验室应根据待测靶核酸的特性，对各实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。种临床样本的运送条件作出相应的规定。2021/1/1220临床基因扩增检验的室内质量控制临床基因扩增检验的室内质量控制l测定前的质量控制测定前的质量控制l核酸样本的制备及其质量控制核酸样本的制备及其质量控制 l统计学质量控制统计学质量控制l质量控制的评价质量控制的评价2021/1/1221测定前质量控制l实验室设施、仪器设备及管理实验室设施、仪器设备及管理l理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法 l人员培训人员培训2021/1/1222实验室设施、仪器设备及管理l临床基因扩增检验实验室应有充分合理临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备的空间、良好的照明和空调设备 ；l实验室仪器设备应保养良好，实验用品实验室仪器设备应保养良好，实验用品要到达相应的要求。加样器的校准？带要到达相应的要求。加样器的校准？带滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循滤塞吸头的使用及质检？离心机？热循环仪？水浴箱和环仪？水浴箱和/或恒温干浴仪？酶标或恒温干浴仪？酶标仪和洗板机？仪和洗板机？2021/1/1223理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计A产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区2021/1/1224产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区理想的核酸扩增实验室设计理想的核酸扩增实验室设计B2021/1/1225核酸扩增检测实验室设计的一般原则核酸扩增检测实验室设计的一般原则l各区独立l注意风向l因地制宜l方便工作“十六字口诀十六字口诀2021/1/1226门门试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩增区扩增区产物分析区产物分析区外走廊外走廊门门门门门门门门试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩扩增增及及产产物物分析区分析区外走廊外走廊门门门门门门门门AB2021/1/1227试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩扩 增增 及及 产产物分析区物分析区门门门门门门门门空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向2021/1/1228走廊走廊走廊走廊试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩增和产扩增和产物分析区物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室2021/1/1229门试剂准备区试剂准备区标本制备区标本制备区扩扩增增及及产产物分析区物分析区门门门空气流向空气流向空气流向空气流向+空气流向空气流向+走廊走廊试试 剂剂 准准 备备区区标标 本本 制制 备备区区扩增和产扩增和产物分析区物分析区空气流向空气流向+空气流向+其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室空气流向2021/1/1230产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗2021/1/1231“无基因或无基因或“无核酸概念的重要性无核酸概念的重要性2021/1/1232基因扩增仪器设备的质控基因扩增仪器设备的质控2021/1/1233带滤芯吸头的使用及质检带滤芯吸头的使用及质检l首先制备一个含12%甘油及色素如甲基橙的水溶液，假如吸头的最大体积为100l，则将加样器汲取体积调至110120l，再套上吸头后汲取上述有色液体。假如吸头质量好，则有色液体不应出如今滤芯之上，否则说明滤芯不严。2021/1/1234核酸提取用离心管质检l离心管抑制物质检离心管抑制物质检l其他其他2021/1/1235扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法l一是使用一种热电偶探针、微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统，当孔间温度变异超出1时，其可测出来。l详细做法是将装有缓冲液并上加石蜡油的扩增反响管放置于扩增仪各孔中，热电偶探针透过扩增反响管盖插至缓冲液中，然后按程序进展一个常规的扩增，加热模块如为96孔，则至少要测定12孔不同位置孔内的温度，在整个扩增过程中，可挪动热电偶探针至上述不同孔中监测温度，但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期。2021/1/1236扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法l第二种方法并非直接测定孔内温度，而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性，即将加有一的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反响管置于扩增仪各孔中按常规进展扩增检测，观察结果的一致性程度，假如有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，假如是，则说明相应孔的热传导有损坏。2021/1/1237理想的试剂和操作方法理想的试剂和操作方法 l试剂盒的质检l定量测定的精细度是测定组成步骤的变异和的平方根()=l 上式中、是步骤a、b、c等例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等的标准差 2021/1/1238理想的试剂和操作方法l改善测定精细度的措施必须首先着重在最不精细的步骤上，应对试剂准备、标本搜集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序()2021/1/1239实验室质量管理体系的建立l质量手册质量手册l质量体系程序文件质量体系程序文件l标准操作程序标准操作程序()l (相关记录表格、相关记录表格、报告报告)2021/1/1240存在问题存在问题l：形式，缺乏可操作性l记录：检查型。多而杂。l质控：形式或没有l分析：缺乏。2021/1/1241实验室质量管理的内涵实验室质量管理的内涵l写你所应做的l做你所写的l记录你已做的l分析你已做的2021/1/1242l看得见的l看不见的2021/1/12432021/1/12442021/1/1245l好习惯是消费力l习惯即命运l思维习惯与行为习惯l罗马不是一天建成的l(a )2021/1/1246质量体系文件的三大特性质量体系文件的三大特性l法规性、唯一性和适用性。法规性、唯一性和适用性。l法规性法规性:是指文件一旦制定完成并批准施行，就必须认真是指文件一旦制定完成并批准施行，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面执行，按照相应的文件去完成日常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进展。定的程序进展。l唯一性唯一性:则是指则是指1 1一个实验室只能有一个质量体系文件一个实验室只能有一个质量体系文件系统；系统；2 2一项检验活动只能有唯一的操作程序；一项检验活动只能有唯一的操作程序；3 3一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；4 4只能使只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能使用。使用。l适用性适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不合适情况时，则应立即按规定程序对文件当发现文件有不合适情况时，则应立即按规定程序对文件进展修改。进展修改。2021/1/1247等于试剂盒说明书吗？等于试剂盒说明书吗？2021/1/1248怎样编写？XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第 页 共 页一目的：二适用范围：三职责或责任人：四（方法原理）五（检测设备和试剂）六（所需的环境条件）七操作步骤：1 2 3 五、本操作程序变动程序：六、相关的文件七、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人2021/1/1249 5W和和1Hl谁来做()：责任人l做什么()：适用范围l何时：适用范围l何地：适用范围l为什么做：目的l如何做：操作步骤2021/1/12502021/1/12512021/1/12522021/1/12532021/1/12542021/1/12552021/1/12562021/1/12572021/1/12582021/1/12592021/1/12602021/1/12612021/1/12622021/1/12632021/1/12642021/1/12652021/1/12662021/1/12672021/1/12682021/1/12692021/1/1270 实验记录表格的设计实验记录表格的设计2021/1/1271存在问题存在问题l表格种类繁多l重复记录l表格无实用性，用于检查的痕迹很重2021/1/12722021/1/12732021/1/12742021/1/1275记录表格设计的根本原则记录表格设计的根本原则l信息充分l简单明了l临床标本的检测信息能有机联络起来l融入系统？2021/1/1276 临床检验流程记录表临床检验流程记录表 检检验验日日期期 检检验验工工程程：扩扩增增仪仪中中保保存存文文件件名：名：使用说明：使用说明：1 1本本记记录录表表须须严严格格遵遵循循试试剂剂准准备备区区 标标本本制制备备区区 扩扩增增区区产产物物分分析区单一流向挪动，严禁逆向挪动。析区单一流向挪动，严禁逆向挪动。2 2各项工作执行后，在相应表达前的各项工作执行后，在相应表达前的“内打内打“。3 3本本记记录录表表最最后后与与相相应应的的标标本本接接收收记记录录等等归归档档保保存存于于扩扩增增区区的的专专用文件柜内，以备查找。用文件柜内，以备查找。实验前准备实验前准备 试剂在有效期内试剂在有效期内 扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内 生物平安柜的滤膜在使用有效期内生物平安柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内消毒溶液在有效期内 洗眼器内无菌生理盐水在有效期内洗眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管、带滤芯吸头已经过质检合格离心管、带滤芯吸头已经过质检合格 操操 2021/1/1277 试剂准备区试剂准备区1 1区区实实验验前前 ：翻翻开开通通风风设设备备 实实验验台台面面清清洁洁水水或或70%70%酒酒精精擦擦拭拭 冰冰箱箱温温度度：冷冷藏藏室室2828 ；冷冷冻冻室室181822 实实验验室室温温度度：允允许许范范围围：10301030；相相对对湿湿度度：允允许许范范围：围：3080%3080%试剂来源：试剂来源：可直接列出有关厂家名称可直接列出有关厂家名称 批号：批号：检检验验工工程程：本本次次实实验验用用量量：人人份份，剩剩余余量量：人份。人份。其他有关试剂配制：其他有关试剂配制：按将有关编号列出配制按将有关编号列出配制1%1%含氯消毒液含氯消毒液 毫升；毫升；按将有关编号列出配制按将有关编号列出配制4 4溶液溶液 毫升；毫升；按将有关编号列出配制按将有关编号列出配制0.1%0.1%焦磷酸二乙酯焦磷酸二乙酯 毫升；毫升；按将有关编号列出配制按将有关编号列出配制 毫升；毫升；其他：其他：仪器设备使用：仪器设备使用：离离心心机机：正正常常 不不正正常常 振振荡荡器器：正正常常 不不正正常常 超净台：超净台：正常正常 不正常不正常实实验验后后：按按将将有有关关编编号号列列出出清清洁洁实实验验室室台台面面、地地面面、加加样样器器和和离离心心机，并进展紫外照射机，并进展紫外照射3030分钟以上。分钟以上。按将有关编号列出处理实验废弃物。按将有关编号列出处理实验废弃物。操操 2021/1/1278 标本制备区标本制备区2 2区区实验前：实验前：翻开通风设备翻开通风设备 实验台面清洁水或实验台面清洁水或70%70%酒精擦拭酒精擦拭 冰冰箱箱柜柜温温度度：冷冷藏藏室室2828 ；冷冷冻冻室室181822 实实验验室室温温度度：允允许许范范围围：10301030；相相对对湿湿度度：允允许许范范围围：3070%3070%阳性室内质控物来源：阳性室内质控物来源：浓度及批号：浓度及批号：扩增位置：扩增位置：阴性室内质控物来源：阴性室内质控物来源：批号：批号：扩增位置：扩增位置：所取理的标本对应标本接收的唯一编号及拟扩增位置：所取理的标本对应标本接收的唯一编号及拟扩增位置：1 19 9171725 3325 33414149 49 2 21010181826 3426 34424250503 31111191927 3527 35434351514 41212202028 3628 36444452525 51313212129 3729 37454553536 61414222230 3830 3846 5446 547 7151523233131393947 5547 558 8161624243232404048 5648 56核酸提取及加样过程：按列出编号进展。核酸提取及加样过程：按列出编号进展。仪器设备使用：仪器设备使用：生物平安柜：生物平安柜：正常正常 不正常不正常 恒温仪温度校准：恒温仪温度校准：离心机：离心机：正常正常 不正常不正常 振荡器：振荡器：正常正常 不正常不正常实验后：实验后：按将有关编号列出清洁实验室台面、地面及仪器设备。按将有关编号列出清洁实验室台面、地面及仪器设备。按将有关编号列出处理实验废弃物。按将有关编号列出处理实验废弃物。操操 2021/1/1279 扩增及产物分析区（扩增及产物分析区（3 3区）区）实验前实验前 打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%70%）扩增仪操作：开机自检及运行正常 按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数设定标准曲线计算值：标准曲线计算值：Slope值值：（）Intercept值值：（）r值值：（）室内质控结果：室内质控结果：结果：填写室内质控记录、描质控图 是否失控：是否失控：否 是 实验结果：实验结果：见所附扩增仪打印结果实验后：实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：操作者：失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按XXXSOP进行）2021/1/1280另外两个存在较多问题的档案记录另外两个存在较多问题的档案记录l人员的技术档案：一人一个档案包括个人根本情况；学历、学位、任职资格、培训证、上岗证、荣誉证书等的复印件；论文、著作、成果等的目录和必要的证明文件复印件；培训考核的记录等。l仪器设备的技术档案：一台仪器一个档案包括仪器根本情况，如仪器设备名称、型号、序列号、消费厂家、购置日期、启用日期、目前放置地点、责任人等；仪器校准的记录本次校准日期和下次应校准的日期、校准证书或数据；维修维护的历史记录；仪器使用说明书、注册证等的复印件；合格证书；装备的小配件如保险丝、灯泡等2021/1/1281人员培训 l方法原理l核酸扩增检测的关键环节l仪器设备使用、维护和校准l结果的分析、报告及进一步处理l质控的分析l知其然又知其所以然。2021/1/1282实验室人员内部培训的重要性实验室人员内部培训的重要性l外部培训提供的是“理念，是被动的，更多的是“学习l内部培训是主动的，源于理论，高于理论，更多的是“考虑2021/1/1283人员培训人员培训2021/1/1284如何培训的举例：新购仪器设备如何培训的举例：新购仪器设备的操作培训的操作培训l在仪器购置合同中，参加培训的内容：厂家提供培训方案l培训方案应包括：培训教材含详细培训内容，如仪器操作及维护校准的、平安性、培训者资质证明、培训所需时间与次数、需要承受培训方准备的条件人员、用具和场地等、培训合格的考核方法及判断标准等。l培训后保存所有有关记录。2021/1/1285核酸样本的制备、扩增检测核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制及其质量控制l一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理l核酸的别离纯化l靶核酸提取的质量 l临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 l核酸样本制备及扩增检测的质控 l产物检测的质控 2021/1/1286核酸的别离纯化 l核酸的别离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。l经典方法l硅吸附法l对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进展评价。2021/1/1287临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 l临床标本中：血清或血浆中的血红素及临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份份、降解靶核酸的核酸酶等。、降解靶核酸的核酸酶等。l核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸()、去垢剂如十二烷基硫酸盐、去垢剂如十二烷基硫酸盐()和试剂和试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂乙醇等有机溶剂。2021/1/1288对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施l质控措施：质控措施：采用内质控采用内质控,通常称为内标的方法通常称为内标的方法 l内标有两种内标有两种,即竞争性的和非竞即竞争性的和非竞争性的内标。争性的内标。2021/1/1289核酸提取及扩增有效性的质控核酸提取及扩增有效性的质控 l弱阳性质控样本基质与待测标本一样：弱阳性质控样本基质与待测标本一样：至少带至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。提取和扩增检测的有效性的综合反映。l阴性质控样本基质与待测标本一样：阴性质控样本基质与待测标本一样：至少带至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。提取过程中是否发生污染。2021/1/1290室内质控方法室内质控方法l非统计学方法l统计质控方法2021/1/1291非统计学方法非统计学方法l在检测血液标本的同时，检测一定数量与临床样本的数量相适应的弱阳性与试剂声称的测定下限相适应和阴性的质控样本l检测有效的质控判断方法：阳性检测为阳性反响性，阴性检测为阴性非反响性。2021/1/1292统计学质量控制 l理想的室内质控样本的条件l测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 l统计学质控的特点 l统计质控方法2021/1/1293理想的室内质控样本的条件l基质与待测样本一致；l所含待测物浓度接近试验的决定性程度；l稳定；l靶值或预期结果已定；l无的生物传染危险性；l单批可大量获得；l价廉2021/1/1294测定中质控样本的设置、数量及排列顺序l标本量不大，如少于30份，定性测定有1份接近的弱阳性和1份阴性质控样本应可以满足要求。样本量大，则可按比例增加。l定量测定则要根据试验的测定范围，采用高、中、低三种浓度的质控样本。l核酸提取时，质控样本要随机放在临床标本中间。l至于在测定中的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。2021/1/1295临床基因扩增检验室内质控的独特性l即监测污染发生的阴性质控的设置。l可包括1份阴性原血清样本、1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反响混合液的管。2021/1/1296阴性原血清质控样本的功能阴性原血清质控样本的功能 l监测实验室的以前扩增产物的污染；l由实验操作所致的标本间的穿插污染；l扩增反响试剂的污染。2021/1/1297在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能l监测实验操作过程中的实验室污染和标本间穿插污染.l不能取代原血清阴性样本。2021/1/1298仅含扩增反响混合液的管的功能仅含扩增反响混合液的管的功能l监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污染鉴别性。2021/1/1299实验室是否发生污染的鉴别实验室是否发生污染的鉴别l可将一个或多个空管翻开静置于标本制备区3060分钟，然后参加扩增反响混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反响混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。2021/1/12100统计学质控的特点 l检验误差有两类，一是系统误差，一是随机误差。l系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移，是由操作者所使用的仪器设备、试剂、标准品或校准物出现问题而造成的，这种误差可以通过前述的措施方法加以控制，是可以排除的。l随机误差则表现为测定的增大，主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致，其出现难以完全防止和控制。2021/1/12101统计学质控的功能l统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因，采取措施予以防止。l开展统计质量控制前，应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制，这不但是做好室内质控的前提，也是保证常规检验工作质量的先决条件。2021/1/12102统计质控方法 l基线测定l质控规则的表达方式及定义 l质控图方法 l质控图结合多规则质控方法 l累积和()质控方法 l“即刻法质控方法 2021/1/12103基线测定l最正确条件下的变异 ,和常规条件下的变异 ,；l当与接近，或小于2 时，则是可以承受的。以上为批间变异。l批内变异的测定；l室内质控物的测定准确度的评价。2021/1/12104临床基因扩增检验统计计算问题l可使用质控样本扩增后的来进展统计计算，也可用其对数值进展。l由于基因扩增结果的原始数据通常很大，故使用其对数值来进展质控统计分析可能要更为方便一些。2021/1/12105质控规则的表达方式及定义 l质控规则的表达方式 l质控规则的功能 l常用质控规则的符号及定义 2021/1/12106质控规则的表达方式质控规则的表达方式l通常质控规则以符号来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13来表示。l当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。l常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，假如有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。2021/1/12107质控规则的功能 l简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。2021/1/12108常用质控规则的符号及定义 符符 号号 定定 义义12S 一个质控测定值超出一个质控测定值超出2s控制限。控制限。13S 一个质控测定值超出一个质控测定值超出3s控制限。控制限。22S 两个连续的质控测定值同时超出两个连续的质控测定值同时超出+2s或或2s控制限。控制限。R4S 同同一一批批测测定定中中，两两个个不不同同浓浓度度质质控控物物的的测测定定值值之之间的间的 差值超出差值超出4s控制限。控制限。41S 四个连续的质控测定值同时超出四个连续的质控测定值同时超出+1s或或1s控制限。控制限。7T 七七个个连连续续的的质质控控测测定定值值呈呈现现一一个个向向上上或或向向下下的的趋趋势势变变 化。化。10X 十十个个连连续续的的质质控控测测定定值值同同时时处处于于均均值值X的的同同一一侧。侧。2021/1/12109质控图方法质控图方法 l也称质控图，是由美国的 于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。l二十世纪五十年代初，将其引入临床检验的质量控制。经和的改进，即为目前常用的质控图。2021/1/12110质控图2021/1/121112021/1/12112质控图质控图根本的统计学含义根本的统计学含义l稳定条件下，在20个结果中不应有多于1个结果超过295.5%可信限限度；在1000个测定结果中超过399.7%可信限的结果不多于3个。l如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。2021/1/121132021/1/12114“假阳性的统计学室内质控方假阳性的统计学室内质控方法法l基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布)l直接概率计算方法不呈正态分布2021/1/12115“即刻质控方法 l“即刻法 的本质是一种统计学方法,即异常值取舍法 l只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。2021/1/12116室内质控数据的评价 l为一集体活动，除实际测定者外，还应有另外一人对测定数据进展质检。l不能将作为一个监察方法，当发现一次测定未到达质量标准时，应以建立性的而非批评的方式去探查失控的原因。l除了将数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。l评价应定期进展。2021/1/12117分析你已做的分析你已做的l每次实验结果的分析l 表象与真象l屡次实验结果的综合分析l 趋势的内在含义l仪器设备的使用情况分析l 维护与校准周期的有效性2021/1/12118弱阳性质控样本常见的失控原因 l核酸提取中的随机误差。如核酸提取核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丧失、有机溶剂的去除不彻底、中的丧失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。标本中扩增抑制物的残留等。l仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。致性等。l试剂的问题。如酶和试剂的问题。如酶和/或逆转录酶的或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。提取试剂的效率等。2021/1/12119阳性质控样本测定结果偏低或为阴性阳性质控样本测定结果偏低或为阴性结果偏低结果偏低阴性阴性临临床床标标本本中中无强阳性无强阳性临临床床标标本本中中有较强阳性有较强阳性临临床床标标本本中有阳性中有阳性临临床床标标本本全为阴性全为阴性观察临床标本情况观察临床标本情况所所用用离离心心管管含含抑制物抑制物Taq酶酶活活性性降降低低核核酸酸提提取取试试剂剂效率低效率低更更换换进进口口离离心心管管更更 换换Taq酶酶再检测再检测更更换换核核酸酸提提取取试剂试剂所有标本重新检测所有标本重新检测核核酸酸提提取取中中靶靶核核酸酸丢丢失失核核酸酸提提取取中中抑抑 抑抑物物残残留留核核酸酸提提取取试试剂剂混入混入扩扩增增仪仪孔孔间间温温度差异度差异随机误差检检测测质质控控样样本本及及35份份已已知阳性样本知阳性样本质质控控样样本本测测定定正正常常且且阳阳性性样样本本有有些些值值增加增加质质控控及及已已知知阳阳性性样样本本测测定定仍仍异常异常按按系系统统误误差差途途径径分分析析重重新新提提取取或或已已知知浓浓度度DNA在同一孔内扩增在同一孔内扩增结果正常结果正常结果仍低结果仍低进进行行扩扩增增仪仪孔孔温温度度校校准准后后再再检测检测Taq酶酶 或或逆逆转转录录酶酶失活失活2021/1/12120阴性质控样本的失控原因阴性质控样本的失控原因 l主要为扩增产物的主要为扩增产物的“污染和污染和/或临床标本的核酸提取过程中发或临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的穿插生的标本间的穿插“污染污染 2021/1/12121阴性质控样本测定为阳性阴性质控样本测定为阳性临床标本亦全为阳性临床标本亦全为阳性临床标本中有阳性也有阴性临床标本中有阳性也有阴性扩扩 增增 产产 物物“污染污染”试试 剂剂“污污 染染”同时检测的标本情况同时检测的标本情况扩扩增增产产物物轻轻度度“污染污染”标标本本间间交交叉叉“污染污染”35空空管管室室内静置内静置58份份水水样样本检测本检测试试剂剂直直接接扩增检测扩增检测验证验证验证验证58份份 水水样本检测样本检测暂暂停停日日常常检检验验，实实验室清洁、通风验室清洁、通风更换试剂更换试剂措施措施有有阳阳性性，则则确确认认有有实实验验室室“污污染染”无无阳阳性性，说说明明为为标标本本交交叉叉“污污染染”改善操作改善操作措施措施2021/1/12122 一个临床实验室对全年室一个临床实验室对全年室内质控结果的分析举例内质控结果的分析举例2021/1/121232021/1/121242021/1/121252021/1/121262021/1/121272021/1/12128的局限性l可能测不出的误差可能测不出的误差l l 测定前测定前 测定中测定中 测定后测定后l 样本鉴定不对样本鉴定不对 样本汲取不对样本汲取不对 结果记录错误结果记录错误l 样本贮存中变质样本贮存中变质 试剂参加不对试剂参加不对l此类误差的发生率在不同的实验