手足口病实验室检测专项方案.doc

手足口病试验室检测方案
为规范手足口病标本采集、运输及试验室检测操作程序，提升检测正确性，从而为手足口病明确诊疗和相关试验研究提供可靠依据，特制订本方案。

手足口病试验室检测标准和程序
手足口病诊疗通常是经过采集合适临床标本后进行病毒分离和病毒判定，假如没有采到适宜临床标本，或无法进行病毒分离，也能够经过血清学检测（如中和试验）来检测血清中中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒核酸来诊疗（见下图：手足口病试验室诊疗步骤图）。
通常是由省级病毒试验室进行病毒分离，爆发疫情范围较大时，国家参比试验室也能够提供技术支持。病毒分离成功后，送至国家参比试验室进行判定或复核，同时对全国手足口病病原进行病毒学监测。国家参比试验室接到标本后，在30日内将结果反馈给省级试验室。
很多血清型肠道病毒能引发手足口病，不一样细胞系对不一样病毒敏感性是有所不一样，而不一样时期肠道病毒流行株也不一样。通常见于肠道病毒分离细胞系为RD细胞（对CA16和EV71敏感）、HEp-2细胞（对一些柯萨奇B组病毒敏感）等，联合使用上述两种或更多细胞（如Vero细胞）有利于分离到更多肠道病毒。
使用血清型特异性中和抗血清进行中和试验是肠道病毒判定基础方法，假如使用了合适抗血清，试验结果是比较可靠。因为肠道病毒包含若干个血清型，通常使用组合抗血清进行判定，有些组合抗血清已经商品化。
当无法进行病毒分离或得不到适适用于病毒分离用标本时，血清学检测能够为肠道病毒感染提供一个间接证据。通常见急性期血清和恢复期血清检测结果进行比较，抗体滴度呈四倍或以上增高证实有急性感染。不过，无症状肠道病毒感染也是常见，所以对检测结果解释要慎重部分。
为了提升检测速度，也为了辅助中和试验法进行毒株判定，最近很多试验室全部使用分子生物学方法。现在，用分子生物学方法对肠道病毒进行定型还没有统一标准，而且要依据检测目标选择使用适用方法。

检测结果评价
假如从临床标本中分离到肠道病毒，尤其是分离自脑脊液、疱疹液，那么很可能该病毒就是病因病原。当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊疗方法能够作为病毒感染间接证据。对于难以分离到肠道病毒，分子生物学方法如RT-PCR是很有用。肠道病毒有时引发无症状感染，所以试验结果实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。

试验室诊疗标准
依据手、足、口等部位经典皮疹即可作出HFMD临床诊疗，流行病学接触史有利于诊疗，临床诊疗病例中符合下列之一，即为试验室诊疗病例：
1，患者粪便标本、咽拭子标本中病毒分离阳性率远高于对照人群；
2，肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256；或恢复期血清中肠道病毒型特异性中和抗体较急性期有4倍或4倍以上增高；
3，在病变组织中如疱疹液或脑脊液中分离到病毒；
4，自患者血清、疱疹液或脑脊液等标本中检测到病原体核酸。

一、标本采集对象
标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病临床诊疗病例和病例发病所在小区（村）临近无病例小区（村）或托幼机构5岁以下儿童（作为健康对照人群）。
用于病毒分离标本包含粪便、咽拭子和疱疹液，假如患者出现神经系统症状，能够采集脑脊液标本。对于血清学诊疗，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，假如不能确保-20℃条件，应该在0~8℃运输和保留。标本应冷冻运输，运输时要附有必需信息，如标本编号、发病日期和标本采集日期。
二、标本种类及采集、运输
（一）粪便标本
采集病人发病7日内粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达试验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长久保留标本存于－70℃冰箱。
（二）咽拭子标本
采集病人发病3日内咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；快速将棉签放入装有3~5ml保留液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达试验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长久保留标本存于－70℃冰箱。
（三）血清标本
采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保留。
（四）疱疹液
在手足口病试验室诊疗中，从疱疹液中分离到病毒含有很高诊疗价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%酒精对疱疹周围皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，快速将棉签放入内装有3~5ml保留液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达试验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长久保留标本存于－70℃冰箱。
（五）脑脊液标本
出现神经系统症状病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也含有很高诊疗价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达试验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长久保留标本存于－70℃冰箱。
（六）病例亲密接触者标本采集
选择经典病例所在托幼机构、或所在村，以新发病例亲密接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。
（七）健康对照标本采集
选择患儿发病所在小区（村）临近无病例小区（村）或托幼机构。采集5岁以下儿童单份粪便和血清标本。
三、标本采集注意事项
在手足口病试验室诊疗中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒含有很高诊疗价值，但对于不一样血清型肠道病毒，脑脊液中病毒分离率是大不相同。用于采集咽拭子无菌拭子要放在合适保留液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。用于分子生物学诊疗标本采集和病毒分离标本采集方法一样。为了确保检测结果正确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，立即检测。不能立即检测标本应冷冻保留。对于血清学诊疗，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。
四、试验室检测操作步骤
（一）病毒分离
1.试剂配置
（1）细胞生长液、维持液配制见下表

生长液（GM）
维持液（MM）
Eagle`s液(MEM)
86.5ml
92.5ml
L-谷氨酰胺200mM
1.0ml
1.0ml
胎牛血清
10.0ml
2.0ml
7.5%NaHCO3溶液
2.5ml
3.5ml
P.S溶液*(青霉素及链霉素)
1.0ml
1.0ml
（2）粪便标本处理液
完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500μg/ ml。
2．病毒分离细胞系
很多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CA16）生长。
对于检测手足口病病原来说，提议全部怀疑含EV71、CA16标本均需接种到以下两种细胞系：
Ø RD细胞，起源于人横纹肌肉瘤细胞。
Ø HEp-2细胞，起源于人喉癌上皮细胞。
3．标本处理
（1）粪便标本处理
操作步骤：
1.1在离心管上标识标本号
1.2每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；
1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标识好离心管中（确保离心管上标号和原始标本标号一致）；
1.4剩下原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；
1.5确保拧紧离心管，用机械震荡器猛烈震荡20min；
1.6在确保离心机盖子盖好和离心桶密封情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；
1.7在生物安全柜中将每一份标本上清液分别吸入2个有外螺旋盖冻存管中（假如上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）；
1.8一管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另一管存于4~8℃以备接种。
（2）疱疹液标本处理
疱疹液标本通常直接用于病毒分离。
（3）脑脊液标本处理
脑脊液标本通常直接用于病毒分离。
（4）咽拭子标本处理
咽拭子要在标本运输（保留）液中充足搅动（最少40下），以洗下拭子上粘附病毒及含有病毒细胞等，然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上，假如发觉有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
4．接种和观察（病毒分离）
（1）显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康。一个健康单层细胞会在传代后3d左右形成；
（2）倒掉生长液（GM），换上1~1.2ml维持液（MM）；
（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标识每支细胞培养管（包含标本编号、日期、传代数）；
（4）每一个细胞最少标识一管作为阴性对照；
（5）每支试管接种0.2ml标本悬液，培养温度要求36℃（对于AHC标本病毒分离，尤其是EV70分离培养，强烈提议降低培养温度，通常可为34~35℃）；
（6）使用倒置显微镜天天观察细胞培养管，以观察有特征性肠道病毒致细胞病变效应（CPE）出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；
（7）统计接种管和对照管细胞所发生改变最少一周，统计CPE（1+~4+）、提醒细胞受毒性反应、老化或污染影响而发生改变（1+，<25%; 2+, 25%~50%; 3+, 50%~75%; 4+, 75%~100%）；
（8）假如有特征性肠道病毒CPE出现，要如实统计，并观察直到75%细胞发生改变（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代。同一病例二次传代病毒分离物能够放到一起用于深入判定；
（9）第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；
（10）一代阳性分离物再传二代，假如又有显著CPE出现，将病毒保留在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以选择二代病毒进行判定。
（11）假如7d以后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本细胞培养物不能混在一起再传代，比如：不一样细胞培养物应单独传代）；
（12）盲传2代后，仍然没有出现CPE，则判定为阴性；
（13）注意：假如接种后24h内出现CPE，很可能是标本中非特异性成份造成毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应。
（14）多个概念：
A：毒性反应：假如在接种后1~2d内细胞快速地调亡，这可能是因为标本中含有毒性物质而造成非特异性毒性反应。这些已接种标本试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。假如又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。
B：微生物污染：因为细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡常常使病毒造成CPE无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。
C：盲传：有时一周以后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型新鲜单层细胞中，再观察7~10d。假如盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性。
5．病毒分离结果解释：
RD细胞支持HFMD关键病原体——CA16和EV71复制，CA16和EV71均能在RD细胞培养中引发特殊肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最终细胞自管壁脱落。但相同滴度CA16和EV71在RD细胞中生长速度不一样，EV71生长速度要快于CA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE时间比CA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CA16通常要经过2次以上传代才出现显著CPE。
若在使用RD细胞分离同时再增加HEp-2细胞，可提升肠道病毒分离率（分离出其它可能致HFMD病原体，如部分柯萨奇B组病毒）。但CA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。
从HFMD患儿脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊疗价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者咽拭子或粪便中反复分离到同一型病毒，且从周围患一样疾病者中也检出相同病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊疗参考价值。
（二）测定人双份血清标本中和抗体滴度
比较患者急性期血清和恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染血清学诊疗方法，最常见是中和试验，即用微量板法测定抗体滴度，是现在人肠道病毒抗体检测最常见方法，该方法正确且含有型特异性。
作为肠道病毒感染诊疗方法之一，能够测定血清（或脑脊液）中肠道病毒中和抗体滴度，通常见急性期血清和恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证实病毒感染。不过，不显著肠道病毒感染（隐性感染）也很常见，所以在评定检测结果时就要小心部分。在中和试验中，通常要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CA16原型株为G-10株），有时同时（或单独）使用临床分离株会有利于得到更正确检测结果。
使用对肠道病毒敏感细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中C液，可用维持液替换）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清（CSF）中抗体滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到毒株（临床分离株）有利于得到更正确检测结果，当然，分离株滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先测定。
中和试验检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引发细胞形态学改变，出现致细胞病变效应（CPE），特异性中和抗体和病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE出现。
1．液体配制
A液：血清处理液：（100ml中含下列液体）
MEM 85ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
胎牛血清 2ml
青、链霉素（各10000U/ml） 10ml

B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列液体）
MEM 85ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
HEPES 1ml
胎牛血清 10ml
青、链霉素（各10000U/ml） 1ml
C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）
MEM 93ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
HEPES 1ml
胎牛血清 2ml
青、链霉素（各10000U/ml） 1ml
2．攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备
（1）将增殖后病毒悬液冻融3次，然后在4℃、1rpm条件下离心10min，取上清液分装于2支冻存管中，每管1.5ml，通常每管应在一次试验中用完，有剩下者应废弃；
（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；
（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液+50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变；
（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株CCID50；
log CCID50 = L-d (S -0.5 )，其中：
L = 试验中使用最低稀释度log值；
d = 稀释梯度log值；
S = 终判时阳性部分总和（即出现CPE细胞孔所占百分比之和）。
（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2~3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50病毒载量；
（6）根据计算好稀释百分比配制攻击病毒，求出试验所需病毒总量（即100 CCID50/0.05ml）；
（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中C液）0.9ml；
（8）用带滤芯吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好攻击病毒液（即10 CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并根当地混匀，避免产生大量气溶胶，根据此方法依次稀释至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

3．稀释血清
（1）发病1~3d内采取患者急性期血清，发病后2~4周采取恢复期血清，分别－20℃冻存备检。
（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。
（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取处理过血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8~10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释过程中无须换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。
（4）每份血清标本每个稀释度全部要平行做两孔。
4．病毒中和抗体测定操作步骤：
（1）取一块96孔板横向使用，每块板能够做8份（4对）待测血清，版面设计以下图所表示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度待测血清0.05ml，无须换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4H3-H4）中每孔加入1:256稀释度待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀释度待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；
（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID50/0.05ml）；
（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；

（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度核实（每次试验全部必需做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，无须更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；

（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液浓度为2×105个/ml，每块96孔板最少需要准备10ml；
（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育培养；
（7）使用倒置显微镜天天观察CPE，并统计病毒滴定结果，以不产生细胞病变血清最高稀释度倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml病毒对照孔出现完全病变时，判定最终止果（约5~7d）；
（8）注意：假如病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml范围内，试验无效，就要反复试验。
5．结果判定：
当最高稀释度血清2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度倒数计即为该血清标本中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则二者平均稀释度倒数即为该血清标本中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则二者平均稀释度倒数即为该血清标本中和抗体效价。
对于HFMD双份血清中和试验结果来说，假如恢复期血清较急性期血清EV71或CA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；假如恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关试验证实；假如单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊疗意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。
（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
1．RNA提取
可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA；
（1），向一支1.5ml离心管中加入560μlAVL缓冲液（含Carrier RNA）；
（2），再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充足混匀最少15s；
（3），室温下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬时离心；
（4），加入560μl纯酒精，充足混匀最少15s，瞬时离心；
（5），小心加入约630μl混合溶液至QIAamp柱中（试剂盒附带），将QIAamp柱套在搜集管上，然后8000 rpm离心5s，使液体经过滤膜；
（6），弃去搜集管中液体，反复第6步骤；
（7），弃去搜集管中液体，小心加入750μlAW1缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体经过滤膜；
（8），弃去搜集管中液体，小心加入750μlAW2缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体经过滤膜；
（9），弃去搜集管中液体，13000 rpm再次离心1min；
（10），将QIAamp柱放入一支洁净1.5ml离心管中；
（11），向膜上加入40μlEB缓冲液，然后室温下静置2~5min；
（12），在离心机中以8000 rpm速度离心1min，离心下来液体即为所需核酸溶液。
2．RT-PCR扩增
（1）引物序列合成
1）人肠道病毒（包含EV71、CA16）核酸检测通用引物序列：
PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`
PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`
EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

3）CA16核酸检测引物序列：
Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

（2）试验设计
1）在PCR统计纸（试验统计纸）上统计此次试验操作者姓名，试验日期，所判定标本名称和标本次序，和PCR仪排列次序一致。
2）标识好加标本和对照PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。
A：阳性对照：无感染性对照RNA。
B：细胞对照：使用未接种病毒细胞悬液，最好使用和扩增病毒所用细胞类型和代数相同细胞。每一次试验设2个细胞对照。
C：试剂对照：用去离子水替换标本。
（3）RT-PCR扩增
1）在冰面上融化病毒标本和多种PCR试剂；
2）配下列试剂主溶液：
10×PCR Buffer···································································5.0μl
dNTPs（2.5mM each）·······················································2.0μl
上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl
下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl
RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································0.5μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl
AMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl
模板RNA··········································································3.0μl
RNase Free dH2O···························································36.0μl
50.0μl
3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤以下：
42℃························45min
95℃························3min
95℃························20s
45℃························25s ×32个循环
72℃························30s
72℃························10min
4℃························Soak
3．电泳分析
1）将已经聚合3%琼脂糖凝胶放在电泳装置上；
2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μlPCR反应产物和之混合；
3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品和载样缓冲液混合溶液加到孔中；
4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35~40min，直到溴酚蓝跑到凝胶底部时候，停止电泳；
5）将胶取出，并注意保持凝胶方向；
6）在1μg/ml溴化乙锭溶液中染色15min，——注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、而且致肿瘤物质，操作时要加小心，并戴双层手套。假如储存在避光容器中，溴化乙锭溶液能够反复使用；
7）在蒸馏水中涮一下凝胶；
8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并摄影作统计。
4．结果解释
经过比较标本PCR产物和阳性对照PCR产物在凝胶上位置和大小来解释结果。
RT-PCR试验结果解释表
待检标本RT-PCR结果
判定结果
全部引物（－）
非肠道病毒（NEV）
EV（＋），EV71（－），CA16（－）
非EV71、CA16其它肠道病毒
EV（＋），EV71（＋），CA16（－）
EV71
EV（＋），EV71（－），CA16（＋）
CA16
五、生物安全
依据1月11日卫生部制订《人间传染病原微生物名目》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒 71型和现在分类未定其它肠道病毒均属于危害程度第三类病原微生物。所以在确保安全前提下，对临床和现场未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护等级试验室进行，包含病毒分离培养操作，应加强个体防护和环境保护。
操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要尤其注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒判定，无脊灰疫苗免疫史人员要进行脊灰疫苗免疫。
灭活后血清抗体检测和PCR检测可在生物安全I级试验室进行。
全部操作应遵守国家相关法律法规。