基于结肠癌癌变基因识别诊断分子标志_何明.pdf

第 43 卷 第 3 期2023 年 03 月Vol.43 NO.3MAR.2023赣南医学院学报JOURNAL OF GANNAN MEDICAL UNIVERSITY投稿网址：http：/基于结肠癌癌变基因识别诊断分子标志何明，蔡浩，罗芸，郭有（赣南医学院第一附属医院医药大数据与生物信息研究中心，江西 赣州 341000）摘 要：目的：通过生物信息学方法筛选结肠癌癌变相关基因，以期发现可用于临床诊断的结肠癌分子标志物。方法：基于GEO数据库筛选活检组织中正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌随肿瘤进展差异表达的基因，采用GO、KEGG进行功能通路富集分析，通过STRING数据库和Cytoscape软件挖掘结肠癌癌变特征基因（CRCCG），基于独立数据集和GEPIA数据库验证其表达水平并进行生存分析。GSVA计算CRCCG-GSVA评分，ROC曲线分析并验证GSVA评分的诊断价值。结果：在数据集GSE37364筛选出183个随结肠癌进展呈显著差异表达的基因。进一步分析发现差异基因主要参与肿瘤相关的多个生物过程和信号通路。差异基因构建蛋白质互作网络利用cytoHubba 插 件 筛 选 出 11 个 CRCCG（ANLN、CXCL11、CXCL3、CXCL8、GZMB、IL1B、MMP3、SHCBP1、TIMP1、TRIP13、UBE2C）。手术组织样本和GEPIA数据库验证CRCCG与活检组织样本中表达趋势一致，均随着肿瘤进展表达水平显著升高。ROC曲线分析揭示CRCCG-GSVA评分具有很高的诊断价值并在手术组织样本数据集中得到验证，预后分析发现CXCL3、IL1B和TIMP1基因的表达水平与患者总体生存期显著相关。结论：本研究通过生物信息学分析得到CRCCG可能是潜在的结肠癌诊断分子标志，为结肠癌的临床诊断和治疗提供新方向。关键词：结肠癌；癌变；生物信息学分析；差异表达基因；分子标志中图分类号：R735 文献标志码：A 文章编号：1001-5779（2023）03-0219-09 DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2023.03.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Identification of diagnosis biomarkers based on the colorectal cancer carcinogenesis genesHE Ming，CAI Hao，LUO Yun，GUO You（Medical Big Data and Bioinformatics Research Centre，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000）Abstract :Objective :To explore the genes of colorectal cancer carcinogenesis by using bioinformatics approaches in order to discover potential biomarkers for diagnosis of colorectal cancer.Methods :First，the differentially expressed genes of normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal cancer with tumor progression were screened from biopsy tissue dataset of GEO database，functional and pathway enrichment analysis of differentially expressed genes were performed using GO and KEGG database.Subsequently，the colorectal cancer carcinogenesis genes（CRCCG）were identified by STRING database and Cytoscape software analysis.Then，the expression levels of CRCCG were validated by the surgical resection tissue dataset and GEPIA web-based tool.Finally，Gene set variation analysis（GSVA）was used to score individual samples against the carcinogenesis signature genes set and ROC curve analysis was used to evaluate the diagnostic ability of CRCCG-GSVA score.The associations between CRCCG and overall survival were analyzed using GEPIA web-based tool.Results :A total of 183 genes were identified from the dataset GSE37364，which showed significantly different expression with tumor progression.Further analysis showed that the differentially expressed genes were mainly involved in multiple biological processes and signal pathways associated with carcinogenesis.They were mostly enriched in extracellular matrix.In addition，in the protein-protein interaction network，11 CRCCG（ANLN，CXCL11，CXCL3，基金项目：国家自然科学基金资助项目（82060618）；江西省重点研发计划项目（20203BBGL73184）；江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ211544，GJJ211549）；赣南医学院校级课题（YB201928，YB201804）作者简介：何明，女，硕士，助理实验师，研究方向：肿瘤标志物研究。E-mail： 2192023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/CXCL8，GZMB，IL1B，MMP3，SHCBP1，TIMP1，TRIP13，UBE2C）were identified using the cytoHubba plugin.The expression trends of these 11 CRCCG in surgical tissue samples and GEPIA web-based tool were consistent with those in biopsy tissue samples，which were significantly increased with tumor progression.ROC curve analysis indicated CRCCG-GSVA score had high diagnostic value and was validated in the surgical resection tissue dataset.The expression levels of three genes CXCL3，IL1B and TIMP1 were significantly associated with the overall survival of colorectal cancerpatients.Conclusion :In this study，CRCCG may be potential biomarker for diagnosis of colorectal cancer by bioinformatics analysis，which is helpful to further understand the carcinogenic process of colorectal cancer and provide new directions for clinical diagnosis and treatment of colorectal cancer.Key words :Colorectal cancer；Carcinogenesis；Bioinformatics analysis；Differentially expressed genes；Biomarkers结肠癌是我国发病率第四、死亡率第五的恶性肿瘤1。随着生活方式和饮食结构变化，结肠癌发病率逐年上升并呈年轻化趋势，患者早期无明显症状，大多数确诊已处于晚期，该肿瘤病死率高且预后差。1975年研究者提出结肠癌发展遵循“正常黏膜腺瘤腺癌”的顺序2，结肠腺瘤是结肠癌最主要的癌前疾病3。超过80%结肠癌是由结肠腺瘤癌变而来，76%90%的结肠癌可通过肠镜下腺瘤摘除进而降低发病率4。因此精准识别癌前疾病可有效抑制结肠癌发展，探索结肠癌的发病机制以及结肠癌变前诊断的分子标志迫在眉睫，以便患者尽早诊断、开展治疗，降低结肠癌发病率和死亡率。普遍认为，结肠癌癌变是正常结肠黏膜在基因突变、表观遗传和基因表达变化逐渐积累发展的过程5-9。随着分子生物学技术发展，微阵列技术因可同时对样本的数万个基因表达水平进行检测，极大丰富了相关肿瘤的数据，已广泛应用于肿瘤致癌过程、诊断治疗、预后预测等研究。FEARON E R等5研究认为APC、KRAS、TP53和DCC基因在结肠癌发展中承担着重要角色。KITA H等6首次通过微阵列技术确定了在正常结肠黏膜发展为结肠腺瘤过程中显著差异表达的180个基因，这些基因证实与结肠病变有密切关联。FONSECA A S等7利用微阵列技术研究10例配对结肠腺瘤和结肠腺癌基因表达谱，发现ETV4在腺癌中显著高表达并参与细胞增殖和迁移过程。研究表明 COX-2从结肠腺瘤到结肠癌的发展中表达显著增加8-9。KANAOKA S等10研究发现，COX-2 mRNA表达水平可有效区分结肠癌和无肿瘤患者，揭示可作为结肠癌检测的潜在标志物。但临床实践中活检组织才是结肠癌诊断治疗的重要组织类型，又因活检组织样本取材的限制，基于结肠活检组织的高通量基因表达研究极少，至今尚未发现应用于临床结肠癌分子诊断的生物标志物或特征。因此，基于活检组织的基因表达谱研究结肠癌癌变过程的关键基因及分子机制将有助于结肠癌诊断分子标志的挖掘。基于此，本研究采用GEO数据库的基因表达谱数据，分析活检组织中正常结肠黏膜结肠腺瘤结肠癌转变中表达差异基因，筛选从正常组织到肿瘤组织逐渐高表达或低表达的基因，通过生物信息学方法挖掘结肠癌癌变特征基因（Colorectal Cancer Carcinogenesis Genes，CRCCG）和分子机制，利用另一组织类型手术切除组织和在线数据库验证癌变特征基因表达水平，GSVA 计算单个样本CRCCG-GSVA评分，ROC曲线评价CRCCG-GSVA评分的诊断价值，最后对CRCCG进行生存分析，为开发临床诊断治疗结肠癌生物标志物提供新思路。1 材料与方法 1.1数据集来源 本研究在GEO数据库中下载两组基于GPL570平台检测的基因表达谱数据集：（1）GSE37364为活检组织的数据包含38例正常结肠黏膜、29例结肠腺瘤和27例结肠癌11；（2）GSE20916为手术切除组织的数据包含24例正常结肠黏膜、45例结肠腺瘤和36例结肠癌12。1.2数据预处理 对于affymetrix平台下载的CEL格式的原始表达谱数据，在R语言（版本3.6.1）中采用affy软件包的RMA算法对其背景校正、分位数校正和以2为底log转换，下载GPL570平台的CDF文件，将探针ID对应至基因ID。去除数据中没有基因 ID 对应或同一探针 ID 对应多个基因 ID 的探针ID，对于多个探针ID对应同一个基因ID，则取它们的信号均值作为此基因的表达值。1.3筛选差异基因 使用 R语言中 limma软件包设置筛选条件为FDR0.05且差异变化倍数（Fold Change，FC）1.5，获得正常结肠组织与结肠腺瘤、结肠腺瘤与结肠癌的差异表达基因，差异倍数1.5为上调基因，差异倍数0.67 为下调基因。利用 2203 期何明，等 基于结肠癌癌变基因识别诊断分子标志投稿网址：http：/VennDiagram软件包分别对上调基因和下调基因绘制韦恩图，上调基因的交集和下调基因的交集定义为结肠癌癌变的差异基因。1.4分析差异基因参与的生物功能和通路 利用clusterProfiler、enrichplot软件包对结肠癌癌变的差异基因进行 GO功能注释13-14和 KEGG通路富集分析 并 作 图15-16。GO 功 能 注 释 包 括 生 物 过 程（Biological process，BP）、细 胞 成 分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3 部分。显著富集筛选标准：P0.05 且 FDR0.05。1.5构建蛋白质互作网络及筛选特征基因将结肠癌癌变的差异基因导入 STRING 在线数据库（https：/cn.string-db.org/），选择multiple proteins，物种选择homo sapiens，构建差异基因的蛋白质互作网络（Protein-protein interaction networks，PPI），置信分数设置为0.7，下载TSV文件将其输入Cytoscape软件（版本3.9.0）绘制可视化的网络图，通过cytoHubba插件17，采用 MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress、ClusteringCoefficient 12种分析方法筛选前30个基因，挑选均出现的基因构建蛋白质互作网络并定义为CRCCG。1.6计算 GSVA 评分与绘制 ROC 曲线 基因集变异分析（Gene set variation analysis，GSVA）可以计算单个样本中特定基因集的富集评分。为评估CRCCG的诊断性能，使用GSVA软件包对每个样本计算 CRCCG 的 GSVA 评分。基于 ROC 曲线，采用pROC软件包根据GSVA评分计算ROC曲线下面积（Area Under Curve，AUC）分析CRCCG-GSVA评分的诊断价值，AUC0.9表明 CRCCG-GSVA评分具有很高的诊断价值，AUC0.8表明 CRCCG-GSVA评分具有较高的诊断价值。1.7 基 因 表 达 水 平 的 验 证 GSE20916 验 证CRCCG在3种结肠组织类型中的表达情况。GEPIA数据库（http：/gepia.cancer- TCGA 数据库和GTEx数据库中349例癌旁正常结肠样本和275例结肠癌组织样本18，验证CRCCG在癌旁正常结肠样本和结肠癌样本的表达情况，并对其进行生存分析。生存分析根据结肠癌患者基因表达值的中位数将样本分为高表达组和低表达组。Log-rank检验基因高表达组与低表达组的总体生存率是否存在差异。COX 比例风险计算风险比（Hazard Ratio，HR）。P0.05代表基因高表达组与低表达组的结肠癌患者生存率差异有统计学意义。2 结果 2.1差异表达基因 本研究利用limma算法分析了数据集 GSE37364的基因表达谱，结果显示正常结肠黏膜与结肠腺瘤有1 845个差异表达基因，838个上调基因，1 007个下调基因；结肠腺瘤与结肠癌有1 061个差异表达基因，714个上调基因，347个下调基因。韦恩图发现，正常结肠黏膜和结肠腺瘤、结肠腺瘤和结肠癌的两组上调基因交叠了76个基因（图1A），正常结肠黏膜和结肠腺瘤、结肠腺瘤和结肠癌的两组下调基因交叠了107个基因（图1B），得到183个结肠癌癌变的差异基因。这183个基因表达从正常结肠黏膜结肠腺瘤结肠癌发展过程中，呈逐渐升高或降低趋势。热图聚类显示，183个基因可以将正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌组织进行分类（图1C）。2.2差异基因的功能分析 为进一步研究183个结肠癌癌变差异基因的分子机制，基于GO富集分图 1GSE37364中差异表达基因的韦恩图及热图A：GSE37364数据集中两组上调基因的韦恩图；B：GSE37364数据集中两组下调基因的韦恩图；C：GSE37364数据集中183个结肠癌癌变差异基因热图。2212023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/析，差异基因主要参与白细胞迁移、类固醇激素反应、细胞趋化、白细胞趋化、细胞外基质分解、锌离子反应、白细胞聚集等生物过程；主要富集于受体配体活性、受体调控活性、G蛋白偶联受体结合、细胞因子活性、趋化因子受体结合、趋化因子活性等分子功能（图2A）。通过KEGG信号通路富集分析发现，差异基因主要参与10条信号通路：细胞因子受体相互作用、白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路、TNF信号通路、NF-B信号通路等信号通路（图2B）。2.3PPI 网络的建立及关键基因的挖掘 基于STRING在线数据库利用Cytoscape软件对183个结肠癌癌变相关的差异基因进行PPI网络分析，得到差异基因之间有着显著的交互作用（图3A）。采用12种分析方法筛选前 30个基因，取共有基因作为CRCCG，最 后 得 到 11 个 基 因：ANLN、CXCL11、CXCL3、CXCL8、GZMB、IL1B、MMP3、SHCBP1、TIMP1、TRIP13、UBE2C。这些基因重新构建PPI网络，结果11个CRCCG之间联系密切（图3B）。2.4CRCCG的表达验证 在活检组织样本数据集GSE37364数据集中，CRCCG在正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌中的表达值逐渐增大（图4A）。在手术组织样本数据集GSE20916中进一步验证CRCCG的表达情况，结果显示CRCCG在正常结肠黏膜、结图 2差异基因GO注释和KEGG信号通路分析A：差异基因的GO注释分析；B：差异基因的KEGG信号通路分析。2223 期何明，等 基于结肠癌癌变基因识别诊断分子标志投稿网址：http：/肠腺瘤、结肠癌中的表达值也逐渐增大（图4B）。另外，应用 GEPIA 在线数据库研究 CRCCG 的表达情况，结果相比于正常结肠，CRCCG在结肠癌中均显著高表达（图5）。2.5CRCCG-GSVA评分的分类效果 利用GSVA计算单个样本中CRCCG的GSVA评分。结果显示GSE37364数据集中CRCCG-GSVA评分随着肿瘤进展逐渐增大（图 6A），ROC 曲线得到 CRCCG-GSVA评分对正常结肠、结肠腺瘤和结肠癌进行分类的AUC 值为 0.922，其中区分结肠癌与正常组织的AUC 为 0.984，结 肠 腺 瘤 与 正 常 组 织 的 AUC 为0.929，结肠腺瘤与结肠癌的AUC为0.823（图6B）。基于ROC曲线选择最佳CRCCG-GSVA评分分类阈值：0.56判定为正常结肠，0.560.3之间判定为结肠腺瘤，0.3判定为结肠癌。CRCCG-GSVA评分的分类效果在GSE20916数据集中也得到了验证，CRCCG-GSVA评分也随着结肠癌发展逐渐增加（图6C），基于最佳分类阈值识别结肠腺瘤与正常结肠的准确率为84.06%，敏感性为79.17%，特异性为86.67%；识 别 结 肠 癌 与 正 常 结 肠 的 准 确 率 为93.33%，敏感性为91.67%，特异性为95.83%；识别结肠腺瘤与结肠癌的准确率为 87.65%，敏感性为84.44%，特异性为 91.67%。CRCCG-GSVA 评分可以很好区分正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌。2.6基因生存分析 对CRCCG进行生存分析，发现3个基因的表达与结肠癌患者的生存率相关。CXCL3图 3差异基因蛋白互作网络及特征基因蛋白互作网络A：183个差异基因的蛋白互作网络；B：11个特征基因的蛋白互作网络。2232023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/和IL1B高表达组的总体生存期（Overall Survival，OS）显著高于低表达组（CXCL3：HR=0.62，P=0.047；IL1B：HR=0.61，P=0.043），TIMP1高表达组的OS显著低于低表达组（HR=1.7，P=0.034）（图7）。3 讨论 结肠癌癌变的过程是个涉及多种基因变化的复杂过程。当下，临床上对结肠癌仍缺乏有效的治疗手段，因而深入探索结肠癌病变过程的分子机制图 4两组数据集CRCCG表达水平的箱线图A：CRCCG在GSE37364数据集中正常结肠黏膜（Normal）、结肠腺瘤（Adenoma）、结肠癌（Carcinoma）的表达水平；B：CRCCG在GSE20916数据集中正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌的表达水平；*FDR0.05，*FDR0.01，*FDR0.001，*FDR0.0001。图 5GEPIA数据库验证CRCCG在癌旁正常结肠（灰色）和结肠癌（红色）表达水平注：*P0.05。2243 期何明，等 基于结肠癌癌变基因识别诊断分子标志投稿网址：http：/尤为重要，对早期诊断、靶向治疗和预后评估具有指导作用。典型的结肠癌癌变过程就是从正常结肠黏膜结肠腺瘤结肠癌，根据这一发展特点，本研究关注结肠癌随着肿瘤进展而逐渐上调或者下调的差异基因。这些差异基因在正常结肠黏膜转变为结肠癌过程中表达水平是逐渐积累变化的，在结肠癌癌变过程的作用尤为显著。分析活检组织数据集GSE37364获得从正常结肠组织到结肠癌进展中表达水平逐渐升高或者降低的183个差异基因，差异基因与多条肿瘤相关的生物过程和信号通路有关。基于 PPI 网络利用 cytoHubba 插件挖掘CRCCG，为避免单一种算法的计算偏差，采用了12种分析算法筛选在所有算法中均出现的11个基因为 CRCCG（ANLN、CXCL11、CXCL3、CXCL8、GZMB、IL1B、MMP3、SHCBP1、TIMP1、TRIP13、UBE2C）。手术切除组织样本和GEPIA数据库验证了这11个基因的表达趋势与活检组织样本的表达趋势一致，随着肿瘤进展表达水平显著升高。基于ROC曲线确定了CRCCG-GSVA评分最佳分类阈值：0.56判定为正常结肠，0.560.3 之间判定为结肠腺瘤，0.3 判 定 为 结 肠 癌，独 立 数 据 集 也 验 证CRCCG-GSVA 评分具有诊断价值。进一步挖掘CRCCG 与结肠癌预后关系发现IL1B、CXCL3 和TIMP1这3个基因与结肠癌患者预后显著相关。图 6两组数据集的CRCCG-GSVA评分分布与ROC曲线图7GEPIA数据库中CXCL3、IL-1、TIMP1基因的生存分析 2252023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/已有研究表明，部分结肠癌癌变基因与结肠癌发展密切相关。白细胞介素-1（Interleukin-1 beta，IL1B）是癌症相关炎症的重要介质，在包括结肠癌等多种癌症中表达水平升高19-20。IL1B通过 Zeb1激活结肠癌干细胞自我更新和上皮间质转化促进结肠癌生长和侵袭21。结肠癌细胞可诱导巨噬细胞释放IL1B，调控GSK3磷酸化，稳定-连环蛋白，增强T细胞因子依赖性的基因活化，诱导肿瘤细胞中Wnt靶基因表达，促进肿瘤细胞生长22。趋化因子3（Chemokines 3，CXCL3）和趋化因子 8（Chemokines 8，CXCL8）属于CXC趋化因子家族的单链蛋白质，对炎症和抗肿瘤免疫至关重要。CXCL3 表达受KRAS-IRF2调控，介导结直肠癌免疫治疗和免疫治疗耐药性23。在结肠癌组织中CXCL3高表达，与肿瘤大小、肿瘤血栓、DNA修复、细胞周期、细胞凋亡和P53调控通路密切相关，致使结肠癌患者总体生存期较差24-25。CXCL8在早期到晚期结肠癌以及转移和非转移病例中表达水平显著高于正常组织样本。另外发现血清样本中CXCL8浓度在结肠癌患者中也显著高于健康对照组。与没有转移的结肠癌患者相比，有远处转移的结肠癌患者CXCL8水平也显著升高26。组织金属蛋白酶抑制剂（Metalloproteinase inhibitor 1，TIMP1）具有抑制MMPs能力，有效控制细胞外基质成分分解，影响肿瘤侵袭和转移。与正常结肠组织相比，TIMP1在结肠肿瘤组织中表达水平升高，可特异性调节FAK-PI3K/AKT和MAPK通路，表达抑制导致结肠肿瘤增殖和转移能力减弱，细胞凋亡能力增强27。研究发现TIMP1既在结肠癌组织样本中高表达，也在血液样本中高表达。在健康人的血小板中TIMP1 mRNA几乎检测不到，但在结肠癌患者的血小板中显著增加，检测血小板中 TIMP1 mRNA 比检测 CEA 或 CA199 在结肠癌诊断具有更高的敏感性和特异性28。还有研究揭示血浆中 TIMP1表达水平是结肠癌患者生存的重要预后因素，术前血浆中高表达的TIMP1预示结肠癌患者预后不良29。综合已有研究和本研究结果，CRCCG不仅可以作为结肠癌组织检测的分子标志，或许还可以通过血液检测其表达值诊断结肠癌，早期对患者进行治疗，提高生存率。本研究结合了公共数据库和多种组织类型分析结肠癌癌变过程中随肿瘤进展显著差异表达的基因，确定了 CRCCG。CRCCG 是潜在的结肠癌诊断分子标志，其中IL1B、CXCL3和TIMP1 3个基因还与结肠癌的预后相关。这些结果为结肠癌的诊断和预后提供参考。肠镜活检组织检查是结肠癌诊断的金标准，但具有创伤性、需充分肠道准备、操作复杂、操作过程患者痛苦、患者依从性较差等缺点，大多数患者首诊已处于晚期。因此，急需开发敏感、特异、安全、无创的诊断方法便于诊断，从而降低结肠癌的死亡率。血液中含有与肿瘤相关的许多生物分子，同时血液又具有采样简便、风险较小等优点，因此基于血液的生物标志物可能是结肠癌诊断的更佳基质。本研究筛选得到的CRCCG与分泌蛋白、免疫反应密切相关，其中 CXCL8和 TIMP1已有研究分析其在结肠癌血液中的表达，CRCCG或许可作为结肠癌诊断的血液分子标志。后续将基于血液样本进一步研究这个诊断标志，以期得到非侵入性的诊断标志便于临床应用。参考文献：1 吴春晓，付晨，赫捷，等.2015年中国结直肠癌发病和死亡情况分析 J.中国癌症杂志，2020，30（4）：5.2 MORSON B C.Evolution of cancer of the colon and rectum J.Cancer，1974，34：845-849.3 LIEBERMAN D A，WEISS D G，BOND J H，et al.Use of colonoscopy to screen asymptomatic adults for colorectal cancer J.N Engl J Med，2000，343（3）：162-168.4 WINAWER S J，ZAUBER A G，HO M N，et al.Prevention of colorectal cancer by colonoscopic polypectomyJ.N Engl J 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