手足口病标本采集及检测技术方案.ppt

手足口病标本采集及检测技术方案目录1病原学病原学5二、标本采集注意事项二、标本采集注意事项6三、实验室检测操作流程三、实验室检测操作流程7四、生物安全四、生物安全4一、采集标本的种类、保存和运输一、采集标本的种类、保存和运输2国外流行概况国外流行概况3我国流行概况我国流行概况病原学 手足口病（hand,foot and month disease,HFMD）是由）是由肠道病毒肠道病毒引起的急性传染病，引起的急性传染病，多发于多发于10岁以岁以下婴幼儿下婴幼儿，以，以手、足、口腔手、足、口腔等部位等部位皮肤黏膜皮肤黏膜的的皮疹、疱疹、皮疹、疱疹、溃疡溃疡为典型表现，为典型表现，个别患者个别患者可出现可出现心肌炎、肺水肿、无菌心肌炎、肺水肿、无菌性脑脊髓膜炎、脑炎性脑脊髓膜炎、脑炎等等并发症并发症。手足口病并不是一种新发。手足口病并不是一种新发传染病，自传染病，自1957年首次报道以来，曾在许多国家和地区多年首次报道以来，曾在许多国家和地区多次流行。次流行。2006年世界卫生组织公布该病在须申报疾病的发年世界卫生组织公布该病在须申报疾病的发病率中居第四位。该病全年皆可发生，我国以病率中居第四位。该病全年皆可发生，我国以夏秋季夏秋季多发，多发，是可防、可治且预后较好的小儿常见传染病。中华人民共是可防、可治且预后较好的小儿常见传染病。中华人民共和国卫生部于和国卫生部于2008年年5月月2日起，将该病列为日起，将该病列为丙类传染病丙类传染病管理管理。背景知识病原学 引起手足口病（HFMD）的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括：柯萨奇病毒 A组（Coxasckievirus A,CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等 B组（Coxasckievirus B,CVB)的1、2、3、4、5 型等；肠道病毒71型（Human Enterovirus 71,EV71）；埃可病毒（Echovirus,ECHO）等。背景知识病原学 其中以EV71和CVA16为主要病原。近年来我国陆续出现这两种病原引起的HFMD季节性流行，局部呈强流行态势。由此，HFMD的有关研究日益受到人们的重视。目前对于HFMD感染尚没有特效的疫苗和药物，主要采用对症和支持治疗，积极防止发生并发症，因此加强疾病及病原的监测、准确处置疫情、开展健康教育是控制的关键。背景知识国外流行概况 手足口病是一种全球性传染病，世界大部分国家和地区均有此病流行的报道。1957年首先发生于加拿大，并于同年在新西兰被最早加以描述和报告。1958年加拿大初步查出CVA16病毒为本病病原。澳大利亚、美国、瑞典是最早出现手足口病的国家之一。1959年英国伯明翰、美国加利福尼亚地区发生流行，并从患者疱疹液中分离出CVA16，并根据本病病变分布特点，被正式命名为“手足口病”。国外流行概况 1972年EV71病毒引起的手足口病在美国被首次确认，此后EV71感染与CVA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。日本是手足口病发病较多的国家，历史上发生过多次CVA16，EV71引起的大规模流行。我国流行概况 1981年我国首次在上海市暴发手足口病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海、广东和河南等省市陆续出现该病报道。1983年天津发生由CVA16引起的手足口病暴发流行，510月间发生病例7000余例，经过两年散发流行后，1986年出现了以托儿所及幼儿园为主的疫情暴发。1995年武汉病毒研究所从手足口患儿标本中分离到EV71。1998年深圳市防疫站同样分离到EV71。我国流行概况 1998年我国台湾地区发生EV71感染引起的手足口病和疱疹性咽峡炎流行，检测哨点共报告129106例患者，重症患者405例，死亡78例，多为五岁以下幼儿。2000年山东省招远市手足口病暴发，市人民医院共接诊患儿1698例，最小年龄5个月，最大14岁，3例合并心肌炎死亡。2008年安徽阜阳市发生较大规模手足口病疫情，共报告病例6606例，其中23例死亡。一、采集标本的种类、保存和运输（二）咽拭子标本（三）血清标本（四）疱疹液（六）尸检标本（一）粪便标本（七）脑脊液标本（五）肛拭子标本（一）粪便标本 采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4暂存12小时内送达实验室；-20以下低温冷冻保藏；长期保存的标本存于-70冰箱。一、采集标本的种类、保存和运输（二）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4暂存并在12小时内送达实验室，-20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70冰箱。一、采集标本的种类、保存和运输（三）血清标本 在手足口病流行年份中应采集EV71 和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血清置于-20以下冰箱中冷冻保存。一、采集标本的种类、保存和运输（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。一、采集标本的种类、保存和运输（五）肛拭子标本 采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有35ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。一、采集标本的种类、保存和运输（六）尸检标本 采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。一、采集标本的种类、保存和运输（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。一、采集标本的种类、保存和运输一、采集标本的种类、保存和运输 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。二、标本采集注意事项 用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。在手足口病的实验室诊断中，在手足口病的实验室诊断中，从从疱疹液疱疹液或或脑脊液脑脊液中分离到病中分离到病毒即可毒即可诊断诊断该病毒为该病毒为病因病因。标本保存液的配置三、实验室检测操作流程（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）(四)Real-time RT-PCR（rRT-PCR）（一）病毒分离（一）病毒分离2病毒分离细胞系3标本的处理4接种和观察（病毒分离）5病毒分离结果解释1.试剂配置三、实验室检测操作流程（一）病毒分离1.试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：三、实验室检测操作流程（一）病毒分离（2）粪便标本和肛拭子的处理液 完全PBS液中加入P.S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100g/ml。完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。三、实验室检测操作流程（一）病毒分离 用600800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。A液：三、实验室检测操作流程（一）病毒分离B液：液：溶解于溶解于100ml100ml蒸馏水蒸馏水中，中，10psi10psi（70Kpa70Kpa）1515分分钟高压灭菌。钟高压灭菌。C液：液：溶解于溶解于100ml100ml蒸馏水蒸馏水中，中，10psi10psi（70Kpa70Kpa）1515分分钟高压灭菌。钟高压灭菌。三、实验室检测操作流程（一）病毒分离2病毒分离细胞系 许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。三、实验室检测操作流程（一）病毒分离3标本的处理（1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于20；三、实验室检测操作流程（一）病毒分离 5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；8）1管粪便悬液冻存于20作为备份，另1管存于4-8以备接种。三、实验室检测操作流程（一）病毒分离（2）疱疹液标本的处理 疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理 脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理 咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。三、实验室检测操作流程（一）病毒分离4接种和观察（病毒分离）（1）通常使用ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；三、实验室检测操作流程（一）病毒分离（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36。（或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞）。（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；三、实验室检测操作流程（一）病毒分离（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，Ct值35.0的样本为临界值。Ct值38.0的样本或无数值的标本为阴性。三、实验室检测操作流程(四)Real-time RT-PCR（rRT-PCR）（2）One Step Real-time PCR法同时检测EV71和CVA16核酸（双通道检测）双通道可以同时检测EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短时间(2.5小时)内检测到标本中是否含EV71或CVA16核酸。反应体系配置反应体系共25l，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5l模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。三、实验室检测操作流程(四)Real-time RT-PCR（rRT-PCR）a.先将试剂解冻，从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按n+1配置25l反应体系（n=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：b.将下述反应液混匀离心后，按照每管20L分装于适用的PCR管中。三、实验室检测操作流程 c.加样：将提取好的样本RNA，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul模板量），不够部分以水补足。总反应体积25L。荧光RT-PCR循环条件设置(四)Real-time RT-PCR（rRT-PCR）三、实验室检测操作流程(四)Real-time RT-PCR（rRT-PCR）结果分析条件设定和结果判断 阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。Ct值35.0的样本为阳性。Ct值无数值的标本和Ct值38.0的样本为阴性样本。三、实验室检测操作流程(四)Real-time RT-PCR（rRT-PCR）38.0 Ct值35.0的样本为临界值。注：荧光PCR同时读取FAM和HEX，进行双通道检测，FAM荧光Ct值为CVA16的结果，HEX荧光 Ct值为EV71的结果。三、实验室检测操作流程四、生物安全 根据2006年1月11日卫生部制定的人间传染的病原微生物名录，柯萨奇病毒、埃可病毒、EV71型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。所有操作应遵守国家相关法律法规。资料整理仅供参考,用药方面谨遵医嘱