基于高通量测序技术研究原发性胃癌患者胃肠道菌群特征_凌宝殿.pdf

第 43 卷 第 3 期2023 年 03 月Vol.43 NO.3MAR.2023赣南医学院学报JOURNAL OF GANNAN MEDICAL UNIVERSITY投稿网址：http：/基于高通量测序技术研究原发性胃癌患者胃肠道菌群特征凌宝殿1，谢志军2，张文娟1，王晓玲1，王芳胜1，胡晓梅1，赖姨梅3，吴何莉2，胡龙华4（1.赣南医学院第一附属医院检验科；2.赣南医学院第一附属医院消化内科；3.赣南医学院第一附属医院病理科，江西 赣州 341000；4.南昌大学医学院第二附属医院检验科，江西 南昌 330000）摘 要：目的：探讨原发性胃癌患者胃肠道菌群种类和分布构成，探究原发性胃癌患者的微生态与癌变发生相关性，并寻找可能存在的菌群生物标志物。方法：根据纳入排除标准，分别收集未经治疗的5例初诊胃癌患者（胃癌组）和5例健康对照人群（对照组）胃黏膜和粪便样本，共20个样本，采用16S rDNA基因高通量测序技术检测胃癌组和对照组胃肠道菌群，通过 PICRUSt2 预测菌群功能差异。结果：操作分类单元（Operational taxonomic units OTU）物种多样性分析显示，胃癌组和对照组胃黏膜样本优化序列数量差异无统计学意义，但胃癌组粪便（WAFB）OTU数明显高于对照组。两组间多样性指数Dominance、Shannon、Chao1、Simpson、Pielou_e及Observed_otus比较差异均无统计学意义，但距离矩阵与（主坐标分析）PCoA分析显示两组菌群结构存在显著差异。线性判别效应分析（LefSe）结果显示，在细菌分类的门水平上，与对照组相比，胃癌组黏膜（WANM）古细菌和拟杆菌门丰度降低，而厚壁菌门和弯曲杆菌门丰度增加，胃癌组粪便（WAFB）的厚壁菌门和放线菌门丰度降低，而变形杆菌门、拟杆菌门和弯曲杆菌门丰度增加。在属水平上，胃癌组大肠埃希菌志贺菌属（Escherichia-Shigella）丰度高于对照组，而拟杆菌属（Bacteroides）等益生菌则低于对照组。功能基因预测结果显示，胃癌组与对照组菌群代谢通路存在差异。结论：胃癌患者胃肠道菌群多样性和结构发生了特征性改变，其中在门水平上，无论是胃黏膜菌群，还是肠道菌群，其拟杆菌门和变形杆菌门为具有显著差异的标志性菌群，在属水平上，胃癌患者大肠埃希菌志贺菌属（Escherichia-Shigella）丰度显著增高，而拟杆菌属（Bacteroides）等益生菌则显著降低。大肠埃希菌志贺菌属（Escherichia-Shigella）可能作为本地区胃癌患者潜在的生物标志物。关键词：胃黏膜菌群；肠道菌群；胃癌；16S rDNA中图分类号：R735.2 文献标志码：A 文章编号：1001-5779（2023）03-0228-07 DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2023.03.002开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Study on the characteristics of gastrointestinal flora in patients with primary gastric cancer based on high-throughput sequencing technologyLING Bao-dian1，XIE Zhi-jun2，ZHANG Wen-juan1，WANG Xiao-ling1，WANG Fang-sheng1，HU Xiao-mei1，LAI Yi-mei3，WU He-li2，HU Long-hua4（1.Department of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University；2.Department of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University；3.Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000；4.Department of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University Medical College，Nanchang，Jiangxi 330000）Abstract :Objective :To explore the types and distribution composition of gastrointestinal flora in patients with primary gastric cancer，clarify the synergistic rule of gastrointestinal flora，explore the microecological carcinogenic mechanism in patients with primary gastric cancer，and search for potential biomarkers of bacterial flora.Methods :According to the inclusion and exclusion criteria，Gastric mucosa and fecal samples were collected from 5 newly diagnosed gastric cancer patients and 5 healthy control cases without prior treatment，with a total of 20 samples，16S rDNA gene high-throughput 基金项目：江西省卫生计划生育委员会科技计划项目（20195406）作者简介：凌宝殿，男，硕士在读，研究方向：临床微生物耐药性研究。E-mail：通信作者：胡龙华，男，本科，教授，博士生导师，研究方向：临床细菌致病及耐药机制研究。E-mail：L 2283 期凌宝殿，等 基于高通量测序技术研究原发性胃癌患者胃肠道菌群特征投稿网址：http：/sequencing technology was used to analyze the gastrointestinal flora，and PICRUSt2 predicted the functional differences of the flora.Results :Operational taxonomic units（OTU）analysis showed that there was no statistical difference in the number of optimized sequences of gastric mucosa samples between gastric cancer patients and normal control group，but the number of OTU in gastric cancer feces（WAFB）group was significantly higher than that in control group，indicating that the species richness of intestinal flora in gastric cancer group was greater than that in control group.The comparison of Alpha diversity index between the two groups，Shannon，Chao1，Simpson，Pielou_e and Observed_otus showed no statistical significance，but the distance matrix and PCoA analysis showed significant differences in microflora structure between the two groups.Linear discriminant effect analysis（LefSe）results showed that，at the phylum level of bacterial classification，the abundance of archaea and bacteroidetes decreased in gastric carcinoma mucosa（WANM）group，while the abundance of firmicutes and campylobacter increased；the abundance of firmicutes and actinomycetes decreased in gastric carcinoma feces（WAFB）group，while the abundance of proteobacteria，bacteroidetes and campylobacter increased.At the genus level，the abundance of Escherichia-Shigella in gastric cancer patients was significantly higher than that in the control group，while the abundance of Bacteroides and other probiotics was significantly lower than that in the control group.The results of PICRUSt2 functional gene prediction showed that there were differences in the metabolism of bacteria between gastric cancer patients and healthy control group.Conclusion :The diversity and structure of gastrointestinal flora in patients with gastric cancer were characterized by the decrease of the abundance of Bacteroides and the increase of Escherichia-Shigella and other opportunistic pathogens.Escherichia-Shigella may be a potential biomarker for gastric cancer patients in this region.Key words :Gastric mucosal microflora；Gut flora；Gastric cancer；16S rDNA胃癌（Gastric cancer，GC）是全球第五大流行和第四大致命的恶性肿瘤，占所有癌症相关死亡人数的7.7%1。人体胃肠道定植大量微生物，微生物之间互相拮抗互为制约，维持相对稳定的微生物微环境，组成一个复杂的生态系统。机体胃肠道中的微生物在多种生理过程中发挥着重要作用，参与了能量代谢、营养吸收、肠道免疫系统的成熟以及防止病原体感染2，也参与疾病的发生和发展。微生物群的改变可能与癌症有关3-4。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染与GC密切相关。研究表明，尽管幽门螺杆菌可能参与了90%以上胃癌的发生，但它在胃炎晚期向癌症发展过程中的作用可能很小5，这预示着可能存在其他潜在生物菌群6在胃癌发展中的作用。以往由于分子生物学技术的局限，很难全面了解人类胃肠道微生物菌群的组成。近年来，随着高通量测序技术的进步，推动了越来越多关于胃微生物群和肠道微生物群与GC相关性研究。然而，有关胃微生物群和肠道微生物群的多样性与胃癌发生发展的相关性研究较少。本研究拟表征胃癌患者胃黏膜组织和肠道中的微生物群落，并探讨其与胃癌发生的潜在相关性。1 材料与方法 1.1研究对象 通过胃镜检查筛选赣南医学院第一附属医院2019年1月12月疑似胃癌患者52例，最终病理确诊 11例。剔除近期使用抗生素患者 5例，转移癌1例，共收集5例原发性胃癌患者胃黏膜组织和粪便样本。同时筛选5例近3个月内未使用过任何抗菌药物的健康人群作为对照组，收集其胃黏膜组织和粪便样本。共得到20个样本。纳入标准：（1）初诊胃癌患者；（2）原发性胃癌患者；（3）能同时获得胃黏膜组织和粪便标本；（4）近3个月内未使用过任何抗菌药物和益生菌。排除标准：（1）年龄18周岁的未成年人，70周岁的老年人；（2）同时并发其他消化道疾病的患者；（3）既往有放化疗史和胃肠道手术史患者；（4）近2周有胃肠道感染疾病史患者。所有入选者本人或其家属知情同意并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。1.2胃黏膜组织和粪便标本采集 使用标准胃镜钳获得12 mm的胃黏膜活检样本置于无菌EP管中；使用粪便收集管患者自我收集50100 mg粪便样本。样本立即转移到实验室，储存在80 冰箱保存，待进一步处理。1.3DNA提取和PCR扩增 采用CTAB或SDS方法对样品基因组进行提取，使用琼脂糖凝胶电泳检测提取出 DNA纯度和浓度；随后取适量 DNA于离心管中，并用无菌水稀释至1 ng L-1。以稀释后的基因组 DNA 为模板，根据扩增区域选择使用包含barcode的特异性引物，采用New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC 2292023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/Buffer和高效高保真酶进行 PCR，以确保扩增效率和准确性。PCR产物用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳再次进行检测，对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂 盒 进 行 回 收。使 用 NEBNext Ultra IIDNA Library Prep Kit建库试剂盒进行文库构建，将构建好的文库进行Qubit和Q-PCR定量；待文库合格后，使用NovaSeq6000进行测序。1.4肠道菌群的高通量测序 样本委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行高通量测序，根据barcode序列和PCR扩增引物序列获得的数据拆分出各样本数据，截去 barcode 和引物序列后使用FLASH软件对样本的reads进行拼接，获得原始标签（Raw Tags）。随后使用 fastp 软件对获得的 Raw Tags进行质控，得到高质量测序标签（Clean Tags）。最后使用 Usearch 软件将 Clean Tags 与数据库进行比对以检测嵌合体并进行去除，从而得到最终的有效数据（Effective Tags）。使用 QIIME2 软件中的DADA2模块或 deblur进行降噪，并过滤掉丰度5的序列，从而获得最终的ASVs以及特征表。随后，使用QIIME2软件中的classify-sklearn模块将得到的ASVs与数据库比对得到每个ASV的物种信息。1.5 统 计 学 方 法 使 用 QIIME2 软 件 计 算Observed_Otus、Shannon、Simpson、Chao1、Goods_Coverage、Dominance 和 Pielou_E 指数，并绘制稀释曲线（Rarefaction Curve）和物种累积箱形图（Species Accumulation Boxplot）。同时对alpha多样性的组间差异进行分析。使用 QIIME2 软件计算 Unifrac 距离，并使用R软件绘制PCA、主坐标分析（PCoA）和NMDS降维图。其中，PCA和PCoA调用R软件中的ade4 和 ggplot2 包。随后，调用 QIIME2 软件中的adonis 和 anosim 函数分析组间群落结构差异显著性。最后，使用线性判别效应分析（LEfSe）或R软件完成组间显著差异性物种分析。其中，LEfSe分析通过LEfSe软件来完成，默认设置LDA score阈值为4。MetaStat分析则使用R软件对两个比较组在门、纲、目、科、属和种6个分类水平上进行差异性检验筛选出组间显著差异性物种；而t检验同样使用R软件来实现各个分类水平上的物种显著差异性分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1两组胃黏膜和粪便标本细菌的OTU分析 根据聚类从 20 个样本中总共获得 3 069 个 OTU，其中胃黏膜和粪便样本共享 OTU 557 个，胃癌组黏膜（WANM）和对照组黏膜（ZCNM）样本共享 OTU 1 049个，胃癌组粪便（WAFB）和对照组粪便（ZCFB）样本共享 OTU 815 个（图 1）。随着测序深度的增加，胃黏膜和粪便样本菌群稀释曲线趋于平坦（图2），表明实测数据合理，基本达到测序深度。2.2两组胃黏膜和粪便菌群多样性分析 多样性 显 示，胃 癌 组 黏 膜（WANM）、对 照 组 黏 膜（ZCNM）、胃 癌 组 粪 便（WAFB）和 对 照 组 粪 便（ZCFB）组间 Dominance、Shannon、Chao1、Simpson、Pielou_e、Observed_otus指标比较差异均无统计学意义（P0.05）（表1）。2.3两组胃黏膜和粪便菌群多样性分析 本研究基于非加权Unifrac的PCoA法分析胃癌组和对照组胃黏膜和粪便样本的微生物结构差异，结果显示，胃癌组胃黏膜和粪便菌群结构与对照组存在显著差异（P0.05），胃癌组胃黏膜和粪便样本之间物种丰度和构成较为分散，而对照组之间的关系则更近（图3）。图1胃癌组黏膜（WANM）、对照组黏膜（ZCNM）、胃癌组粪便（WAFB）、对照组粪便（ZCFB）菌群OTU分析韦恩图图2胃黏膜和粪便样本菌群稀释曲线 2303 期凌宝殿，等 基于高通量测序技术研究原发性胃癌患者胃肠道菌群特征投稿网址：http：/2.4两组群落结构差异显著性分析 在细菌分类学的门水平上，胃癌组黏膜（WANM）和对照组黏膜（ZCNM）菌群主要由 6 个门组成，包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形杆菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、弯曲杆菌门（Campylobacter）和古细菌（Archaea）。相比对照组黏 膜（ZCNM），胃 癌 组 黏 膜（WANM）Archaea、Bacteroidetes 丰度降低，而 Firmicutes、Campylobacter丰度增加。胃癌组粪便（WAFB）和对照组粪便（ZCFB）菌群主要由 4 个门组成，包括 Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria 和 Bacteroidetes，其 中Firmicutes 和 Proteobacteria 明显占优势，占总数的65%以上。相比对照组粪便（ZCFB），胃癌组粪便（WAFB）Firmicutes、Actinobacteria 丰 度 降 低，而Proteobacteria、Bacteroidetes、Campylobacter丰度增加（图4）。2.5两组胃黏膜和粪便菌群LEfSe差异分析 使用LEfSe差异分析表明，细菌系统发育型在4组样本之间存在显著差异（图5A）。LDA值分布柱状图中展示了LDA评分4的物种，即认为组间差异有统计学意义的生物标志物，柱状图的长度代表差异物种的影响大小。当LDA评分的绝对值4时，4组间有39个物种差异显著。其中对照组黏膜（ZCNM）富集9 种，即 Archaea、Bacteroidetes、普 雷 沃 菌 属（Prevotellaceae）、巴斯德菌属（Pasteurellales）、放线杆菌属(Actinobacillus）、肠炎弧菌（Parahaemolyticus）、伯克霍尔德菌属（Bukholderiales）、异普雷沃菌属（Alloprevotella）、奈瑟菌科（Neisseraceae）；胃癌组黏膜（WANM）富集 5 种，即 Helicobacteriota、梭杆菌属（Fusobacteriia）、纤毛菌属（Leptotrichia）、赫尔曼埃希菌（Haemonadales）、韦荣球菌（Veronococcus）。对照组粪便（ZCFB）富集5种，即梭菌属(Clostridia）、颤螺旋菌目(Oscillospirales）、毛螺菌目(Lachnospirales）、双歧 杆 菌 目(Bifidobacteriales）、布 劳 特 氏 菌 属(Blautia）；胃癌组粪便（WAFB）富集2种，即肠杆菌目(Enterobacterales）、大 肠 埃 希 菌-志 贺 菌 属（Escherichia-Shigella）（图5B）。在属水平上，胃癌组表1两组胃黏膜和粪便菌群多样性指数差异分析（P-value）组别WAFBWANMZCFBZCNMDominance0.754 0230.464 702Shannon0.754 0230.347 208Chao10.347 2080.347 208Simpson0.754 0230.464 702Pielou_e0.916 8150.601 508Observed_otus0.347 2080.347 208注：WAFB：胃癌组粪便；ZCFB：对照组粪便；WANM：胃癌组黏膜；ZCNM：对照组黏膜。图3两组胃黏膜和粪便菌群坐标分析（PCoA）分析图注：每个点表示一个样本，同一个组的样本使用同一种颜色表示，样本距离越接近，表示物种组成结构越相似。图4两组细菌群落结构差异分析图 2312023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/大肠埃希菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）丰度高于对照组，而拟杆菌属（Bacteroides）等益生菌则低于对照组。2.6KEGG 功能预测 采用 PICRUSt2 软件基于 KEGG数据库对胃肠道菌群进行功能预测，共发现35个代谢通路有显著差异（图6）。图54组菌群分布的富集偏差图注：A：4组LEfSe的分类分支图。生物标记类群用彩色圆圈和阴影区域突出显示。每个圆的直径反映了群落中这些类群的丰度；B：显著差异丰度特征用log2倍变化表示，并通过Benjamini-Hochberg校正进行多重检验，将OTUs丰度转换为log10相对丰度，4组的线性判别分析（LDA）得到的分类分支图，采用4.0的截断值。2323 期凌宝殿，等 基于高通量测序技术研究原发性胃癌患者胃肠道菌群特征投稿网址：http：/3 讨论 胃癌是一种多因素疾病，肿瘤微环境的改变是胃癌发生、发展和转移的必要条件。作为肿瘤微环境的一部分，胃微生物群和肠道微生物群中的细菌可以通过产生促肿瘤代谢物、DNA损伤、抑制抗肿瘤免疫和激活致癌信号通路来促进胃肿瘤的发展。大多数研究发现，与正常对照组相比，胃癌患者的微生物群多样性存在差异7-8。许多肠道和胃微生物被认为是结直肠癌和胃癌的致癌物9-11，或是增加患者对癌症的免疫治疗反应的益生菌12。然而，关于疾病进展与胃和肠道微生物群多样性之间关系的研究结果不一。幽门螺杆菌感染被认为是胃癌发生的主要危险因素，该菌具有多种与胃癌相关的毒力因子13，如空泡毒素、细胞毒素相关基因A和外膜蛋白，亦可过度表达如IL-1、IL-8、IL-17和TNF-等促炎细胞因子，引起慢性胃炎，进而发展为胃萎缩、肠化生，最终进展为胃肠腺癌14。幽门螺杆菌感染和酸分泌的损害，改变了胃微生物群的组成，促进了胃内其他细菌的定植。有研究发现，胃癌患者乳酸菌属的比例升高8，乳球菌和乳杆菌属可以产生乳酸，而乳酸可以作为肿瘤生长和血管生成的能量来源，从而促进肿瘤进展。本研究发现，胃癌组和对照组之间胃黏膜和粪便样本优化序列数量差异无统计学意义，但胃癌组粪便（WAFB）OTU数明显高于对照组，表明胃癌组肠道菌群物种丰富程度大于对照组，这与李慧珍等15报道一致。多样性显示，两组人群胃黏膜和肠道菌群的 Dominance、Shannon、Chao1、Simpson 指标比较差异均无统计学意义，这与 YOUSSEF O等16、COSTEA P I等17研究结果一致，即人体肠道微生物受饮食、疾病、治疗干预等因素影响，可能会出现相应菌群丰度及多样性的暂时性变化。但胃癌组粪便和胃癌组黏膜组内物种多样性中位数均高于对照组，这表明胃癌患者肠道菌群和胃黏膜菌群多样性较高。这与聂蓬等18、HU Y L等19研究一致，但亦有不一致的研究结果20-22，可能由于地域因素对胃肠道菌群的影响所致。多样性显示，胃癌组胃黏膜和粪便样本之间物种丰度和构成较为分散，而对照组之间的关系则更近。这表明胃癌中微生物群落的结构在系统发育上是多样化的，与研究报道一致23-24。主坐标分析显示，胃癌组与对照组菌群结构存在差异。线性判别效应分析结果显示，在门水平上，胃黏膜菌群的丰度差异主要集中在厚壁菌门、变形杆菌门、拟杆菌门、放线菌门、弯曲杆菌门、古细菌，肠道菌群的丰度差异主要集中在厚壁菌门、变形杆菌门、放线菌门和拟杆菌门，与COSTEA P I等17研究结果一致。其中拟杆菌门和变形菌门为具有显著差异的标志性菌群，与LIANG W R等21研究结果一致。在属水平上，胃癌组大肠埃希菌志贺菌属丰度显著高于对照组，而拟杆菌属等益生菌则显著低于对照组，差异均有统计学意义（线性判别分析值=4，P0.05），是属水平上的标志性物种。与李宁宁等20、黄鑫等25研究一致。提示志贺氏杆菌的富集可能预测GC的发生。京都基因和基因组百科全书结果显示，胃癌患者与健康对照组间的菌群代谢存在差异。然而，尽管大多数研究表明与健康人群相比，胃癌患者的微生物群发生了改变，但微生物群中不同细菌在特定微生境中的作用仍不清楚。在胃癌发生过程中，需要进一步研究确定胃癌细菌的微生物群和宿主间的相互作用。图6PICRUSt2 基于细菌16S rRNA基因序列的胃黏膜相关微生物组功能 2332023 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/参考文献：1 SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin，2021，71（3）：209-249.2 PITT J M，VETIZOU M，WALDSCHMITT N，et al.Fine-tuning cancer immunotherapy：optimizing the gut microbiome J.Cancer Res，2016，76（16）：4602-4607.3 ISHAQ H 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