Bactobac表达系统中文版说明指导书.doc

Bac-to-Bac杆状病毒表示系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表示系统提供快速有效方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病质粒（杆粒）位点特意转座子表示框质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表示系统关键包含：*pFastBac捐献质粒选择，它要能够产生包含目标位点表示结构，这个目标基因产生被杆状病毒特意位点开启子控制。*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表示结构后能够产生重组杆粒。*一个控制表示质粒，包含Gus和/或CAT基因，方便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表示-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。Bac-to-Bac表示系统优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统同源重组有以下优点：*和使用同源重组产生重组杆状病毒所需4-6周相比，判别纯化重组病毒少于两周*降低了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒几率*能够快速同时进行大量重组，适合表示功效性研究蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量pFastBac菌体全部适于进行Bac-to-Bac表示系统。选择对于你需要最适宜菌体。Vector特点参考pFastBacTM1高水平表示强AcMNPV聚乙烯（PH）开启子用于简单克隆大量克隆位点Anderon 1996pFastBacTMHT高水平表示聚乙烯开启子；N-末端含有6XHis，能够用来纯化重组蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3个阅读框Polayes 1996pFastBacTMDual两个强开启子（PH和p10）能够同时表示两种蛋白；两个大克隆位点Harris和Polaye 1997指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表示系统概述，并对以下提供指导：1、 克隆目标基因到pFastBacTM供体质粒选择2、 转化pFastBacTM 结构到最高效DH10BacTM产生重组质粒3、 转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、 扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表示目标重组蛋白关键：Bac-to-Bac杆状病毒表示系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表示目标基因系统。即使她能够帮助你很轻易产生杆状病毒表示你重组蛋白，不过使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表示背景使用者。我们高度推荐使用者含有病毒和组织培养技术和知识。Bac-to-Bac表示系统表示系统成份：表示系统简单高效产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年方法，此系统利用了位点特意专座子Tn7区简化和提升重组质粒DNA*系统第一个成份是用来克隆目标基因pFastBacTM菌株。基于pFastBacTM菌株选择，表示基因被AcMNPVPH或p10开启子控制，在昆虫细胞内高水平表示表示框被Tn7 左右臂包围，而且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型Tn7 *第二个关键结构是EcoliDH10BacTM品系，用来作为pFastBacTM菌株宿主。DH10BacTM细胞包含带有微型-attTn7靶位点病毒质粒和辅助质粒（具体见下文）。一旦pFastBacTM表示质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBacTM菌株微型Tn7单位和微型-attTn7靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供转化蛋白处。假如你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表示试验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价病毒株能够用来感染细胞，进行大规模重组蛋白表示。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包含：*一个低拷贝 微型F复制子*卡那霉素抗性标识*一个来自于pUC载体编码LacZa肽DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入微型attTn7不会中止LacZa肽阅读框。杆粒在含有卡那抗性大质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染色体LacZ缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，她编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功效。图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒产生和目标基因表示试验轮廓：步骤：下图揭示了表示目标基因通常步骤1、 pFastBac donor 质粒（步骤：目标基因克隆 ） 得到2、 pFastBac重组体 （转化至DN10Bac细胞（含有杆粒和helper） 得到3、 含有重组杆粒Ecoli细胞 （重新划线） 得到4、 验证过含有重组杆粒Ecoli细胞 （过夜培养，分离重组杆粒DNA） 得到5、 重组杆粒DNA （使用Cellfectin试剂感染细胞） 得到6、 P1 重组杆状病毒株（106pfu/ml） （感染昆虫细胞扩增病毒） 得到7、 P2 重组杆状病毒株（107pfu/ml） （滴定感染昆虫细胞） 得到8、 蛋白表示培养昆虫细胞：通常指导：介绍：对于您杆状病毒转移菌，我们推荐使用Sf9和Sf21昆虫细胞作为宿主。在开始你转化试验和表示之前，确定你有收获Sf9和Sf21，并将其冻存。使用无血清介质：昆虫细胞可能在无血清条件下收获。我们推荐使用Sf900 SFM。Sf900 SFM对于维持Sf9 和Sf21和对于大规模生产重组蛋白，全部是无蛋白最优介质。昆虫细胞培养参考指导：维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下 冷冻细胞 使用无血清介质 按百分比增加细胞产量通常指导：昆虫细胞对于环境很敏感，另外化学和营养原因，物理原因全部能够影响昆虫细胞成长。需要优化以得到最大产量。考虑以下培养条件：*温度：细胞感染和成长最适合范围是27-28度*PH：对于很多培养系统6.1-6.4时适宜范围。Sf900 SFM在此范围内支持通常空气和开盖培养*同渗重摩：鳞翅类细胞使用介质最优同渗重摩是345-380 mOsm/kg*通风：对于最优生长条件和蛋白表示，昆虫细胞要求被动通氧。主动通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%*剪切力：悬浮培养产生机械剪切力。生长昆虫细胞在含有血清介质中（10%-20% FBS），对于细胞剪切力通常会得到足够保护。假如你细胞在无血清条件下生长，加入剪切力保护剂比如PluronicF-68。注意：在Sf900 SFM中生长细胞不需要加入剪切力保护剂。转染细胞：你需要是对数期细胞95%发育能力，能够完成成功转染。产生重组pFastBacTM菌株（Vector）通常信息：介绍：为了产生包含目标基因重组质粒，使用Bac-to-Bac杆状病毒表示系统，你需要使用限制酶消化和连接，将你目标基因克隆进入pFastBac 菌其中一个。通常分子生物学技术：为了帮助限制酶消化和连接DNA序列，需要其它通常分子生物学技术扩增和保留质粒：pFastBac菌种和她对应表示对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因，能够使用Ecoli进行Amp筛选。为了扩增和保留pFastBac和pFastBac对照质粒，使用以下方法：1、 使用载体株系感染一个recA ,endA Ecoli株，比如Top10，DH10B或DH52、 在含有100ug/ml AmpLB琼脂糖平板选择转化株。3、 选择含有质粒转化子制备甘油菌方便长久保留克隆进入pFastBacTM1介绍：为了帮助你设计策略克隆你目标基因进入pFastBacTM1，参考以下提议和表格克隆考虑事项：pFastBacTM1菌株是非融合菌株（无融合标签）。为了确保重组蛋白表示，你插入必需含有：*一个ATG起始密码子用于转录起始*一个终止密码子。注意：终止密码子包含在全部三个阅读框中多克隆位点中注意：重组蛋白产生要求你插入包含一个转录起始ATG。通常来说，转移载体包含完整PH引导序列，能够提升表示产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始效率是低，而且通常不干涉表示和重组蛋白检测。pFastBacTM1多克隆位点：下图是pFastBacTM1多克隆位点。限制位点标出来方便显示实际切刻位点。潜在终止密码子下划线表示。pFastBacTM1全序列能够从网站下载。pFastBacTM1图谱和描述见后缀克隆进入pFastBacTMHT A，B，C 介绍：pFastBacTMHT载体由三个读码框（A，B，C）提供多克隆位点从而实现克隆目标基因，而且在N端带有6XHis。克隆：pFastBacTMHT菌株是融合菌株。为了确保表示重组蛋白，你必需：*克隆你基因要带有ATG，在4050-4052碱基对间。这个将会产生融合表示，带有6XHis标签，能够用TEV切除*你插入要含有终止密码注意：重组蛋白产生要求你插入包含一个转录起始ATG。通常来说，转移载体包含完整PH引导序列，能够提升表示产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始效率是低，而且通常不干涉表示和重组蛋白检测pFastBacTMHT A多克隆位点：下图是pFastBacTMHT A多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来方便显示实际切刻位点。pFastBacTMHT B多克隆位点：下图是pFastBacTMHT A多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来方便显示实际切刻位点。框住核苷酸显示出是易变区域。pFastBacTMHT C多克隆位点：下图是pFastBacTMHT A多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来方便显示实际切刻位点。框住核苷酸显示出是易变区域。注意pFastBacTMHT C在Xba 位点内有一个终止密码子，她在N端标签框内。确定你基因5端是在Xba 位点上游开始。克隆进入pFastBacTMDual介绍：pFastBacTMDual包含两个多克隆位点，能够同时表示两个异源基因，一个经过PH开启子控制，另一个经过P10开启子控制。参见下列提议方便有利于你基因克隆克隆事项：pFastBacTMDual是一个非融合载体。为了确保重组蛋白表示，你插入必需含有以下两点*一个ATG起始密码子*假如你不使用多克隆位点中终止密码子，就必需要有一个终止密码子注意：重组蛋白产生要求你插入包含一个转录起始ATG。通常来说，转移载体包含完整PH引导序列，能够提升表示产量。对于插入克隆上游聚乙烯开启子，注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始效率是低，而且通常不干涉表示和重组蛋白检测。PH开启子下游多克隆位点：下图是pFastBacTMDual中PH开启子下游多克隆位点图示。限制性位点标识出来显示了实际切刻位点。潜在终止密码子有下划线标出。P10开启子下游多克隆位点：下图是pFastBacTMDualAcMNPV p10开启子下游多克隆位点。限制性位点标识出来方便显示实际切刻位点。潜在终止密码子标识下划线。转化和分析介绍：假如你已经完成了你连接反应，你就要准备把你pFastBacTM结构转化进Ecoli了。很多Ecoli宿主菌和转化程序全部是能够使用。通常推荐转化Ecoli和分析转化在下面列出Ecoli宿主：一旦你把你插入序列克隆进入了pFastBacTM，你需要转化连接反应到Ecoli，并选择优Amp抗性转化株。你能够使用任何recA，end A Ecoli菌。包含Top10，DH10B或DH5进行转化。不要转化连接反应进入DH10Bac细胞。注意TOP10和DH10B感受态细胞能够从Invitrogen得到转化方法：你能够选择使用任何方法对Ecoli进行转化。化学转化是最便利方法，而电转对大质粒是最有效方法。选择好转化株，使用含有100ug/ml Amp LB平板。转化株分析：一旦你得到Amp抗性转化株，我们有以下推荐：1、 选出10个转化株，在含有100ug/mlAmpLB或S.O.B培养基过夜培养2、 使用你选方法分离质粒DNA。我们推荐使用企业试剂盒3、 使用限制性方法分析质粒，证实是重组质粒并证实插入起始正确。使用限制性酶或酶化合物对Vector和插入端各进行一次酶切。使用PCR对转化株进行分析：你也能够使用PCR方法对阳性转化株进行分析。使用适宜PCR引物和Amp条件。假如你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行试验。使用错误引物或污染平板可能会得到假象。以下方法能够给你提供便利。其它方法也是可用。需要材料：高保真PCRSuperMix，合时PCR前后引物过程：1、对于每个样品，在0.5ml小离心管加入48ul高保真PCR SuperMix和各1ul前后引物。 2、选出10个克隆，在上述离心管中进行重悬（记得做一个Patch板保护克隆方便进行更深分析） 3、94度10分钟溶解细胞灭活核酸酶 4、20-30个循环进行扩增 5、延伸使用72度10分钟。4度储存 6、琼脂糖凝胶电泳检测测序：对于你结构需要进行测序证实目标基因是正确起始方便表示。假如你是将基因克隆进入了pFastBacTMHT，证实基因进入了N末端标签读框中。长久保留：一旦你证实了测序正确，确定克隆纯度并制作甘油菌长久保留。推荐储存质粒DNA在-20度1、 在含有100ug/mlLB平板上对原始克隆进行划线培养2、 挑单克隆在1-2ml含有AmpLB抚育3、 培养至稳定时4、 在0.85ml培养物中混合0.15ml过滤甘油，转到冷冻小管5、 -80度储存重组质粒产生转化到DH10Bac Ecoli介绍：一旦你有了你pFastBacTM结构，你就能够准备转化纯化质粒DNA进入DH10BacTMEcoli，转变成为杆粒。你能够使用蓝/白斑选出含有重组杆粒克隆。Bac-toBac表示系统提供高效DH10BacTM感受态细胞。阳性对照：每个pFastBacTM质粒全部提供对应阳性对照用来作为阳性转染和表示对照（下表）。依据pFastBacTMVecctor使用，我们推荐在你DH10Bac转染试验中作对应对照。所需材料：开始之前你需要有以下材料 *纯化pFastBacTM结构（200pg/ul储存于PH8.0TE） *阳性表示对照 *高效DH10BacTM感受态细胞（表示系统提供，每个转化试验使用1管细胞） *pUC19（和DH10Bac一起提供，用来做对照） *LB平板，包含Kan，Gen（庆大），Tetracycline（四环素），Bluo-gal（卤代吲哚基-beta-D-半乳糖苷）和IPTG。 （每个转化3个板，使用新鲜平板，推荐见下文） *LB板含有100ug/mlAmp（用于pUC19转化对照） *S.O.C介质 *15ml圆底塑料管 *42度水域和37度摇床及37度培养箱。你需要准备LB琼脂糖平板，包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG，用来进行DH10BacTM转化株筛选。能够从我企业预订抗生素，Bbluo-gal，IPTG，在后面有制备平板指导。假如你正准备LB平板使用是事先混合好，我们推荐使用Luria Broth Base替换LB。使用LB板将会降低颜色敏感度，并可能降低克隆数量。注意：在蓝/白斑筛选中使用Bluo-gal替换X-Gal。Bluo-gal产生蓝斑颜色要比X-Gal深。准备转化：对于每个转化，你全部需要一小瓶感受态细胞和三个平板。 *42度水域平衡 *37度烘板30分钟 *室温放置SOC介质 *对于每个转化试验预冷一个15ml管子转化过程：根据以下过程用高效DH10BacTM感受态细胞转化pFastBacTM结构。我们推荐做阳性对照转化来帮助你证实你结果。1、 整管高效DH10BacTM感受态细胞冰上解冻。2、 每个转化试验，轻轻地混合，将100ul高效DH10BacTM感受态细胞倒入预冷15ml管子3、 向细胞中加入适量质粒DNA，轻轻混合。千万不要上下吹吸混合*pFastBacTM结构：1ng(5ul)*pFastBacTM对照质粒：1ng*pUC19对照：50pg（5ul）4、 冰上抚育30分钟5、 42度热激45秒6、 立即冰上2分钟7、 加入900ul室温SOC培养基8、 pFastBacTM转化：37度225转震荡培养4小时。 pUC19转化：37度225转震荡培养1小时9、 对于每个pFastBacTM转化：准备10折连续（不知道什么意思）用SOC稀释细胞（10-1，10-2，10-3），每个稀释用100ul铺一个LB平板，平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG。对于pUC19转化：用SOC培养基1：100稀释细胞，铺100ul稀释物在含有100ug/mlAmpLB平板。10、37度抚育48小时。分析筛选克隆（参见推荐）。注意：我们不推荐早于48小时挑单克隆，因为这么可能会难于区分蓝白斑。关键：微型Tn7 插入到微型attTn7 隶属位点会干扰LacZa肽表示，所以包含重组质粒克隆在蓝色背景下是白色，可能隐藏在未改变质粒中。选择白斑分析。真正白斑克隆比较大；所以为了避免选择成假阳性，选择最大，最独立白斑。避免挑出现灰色或在中间菌落，因为她们可能是包含空质粒细胞核重组细胞混合。验证显性：1、挑10个白色克隆，重新划线在新鲜LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG）。37度过夜培养。 2、在包含Bluo-Gal和IPTG重新划线平板上选出单克隆证实是白色显性，嫁接至有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline液体中 3、使用我企业试剂盒抽提重组质粒DNA。选择性，你能够使用附录提供操作步骤。这个过程源于抽提大质粒DNA（100kb），适适用于分离质粒DNA。 4、分析重组质粒DNA证实成功转化到了杆粒中。我们推荐使用PCR分析杆粒DNA。 注意：适用琼脂糖凝胶电泳能够证实转化成功是否，她能够分出高分子量DNA。这个方法要比PCR分析可信度低，因为高分子量DNA是极难见到。使用PCR分析重组质粒介绍：重组杆粒DNA要大于135kb。既然限制性分析极难完成这么大DNA分析，我们推荐使用PCR分析判定重组杆粒中目标基因。杆粒包含M13 正负引物位点，在LacZa互不区域微型attTn7 位点两侧，能够完成PCR检验。本节提供使用M13 引物PCR检验指导。使用M13引物进行PCR分析：使用PCR法证实你目标基因在重组杆粒中，你可能会： *使用M13Forward（-40）和M13 Reverse引物 *使用M13Forward（-40）或M13 Reverse引物于你插入片段杂交成联合物DNA聚合酶：你可能会使用任何DNA聚合酶在你PCR试验中，包含Platinum Taq酶。假如期望PCR产物4kb，我们推荐使用聚合酶混合物。比如高保真Platinum Taq酶得到PCR产物：使用下面过程扩增重组杆粒DNA，适用M13正反引物和Platinum Taq酶。假如你使用M13F或M13 R和一个你基因特意引物混合，你需要自己决定扩增条件。假如你使用其它聚合酶，依据供给商提供提议。注意：假如你插入片段4kb扩增条件需要被优化.1、 每个样品，在0.5ml微型管子中装入50ul量进行PCR反应重组杆粒DNA（100ng） 1ul10XPCR Buffer 5ul 10mM dNTP Mix 5ul50mM MgCl2 1.5ulPCR引物（1.25ul/10uM） 2.5ul蒸馏水 38.5总体积 50ul2、 一滴矿物油覆盖3、 一下参量进行扩增4、 从反应产物吸收5-10ul进行琼脂糖电泳分析你将会看到：假如转化发生了，而且你使用是M13正负引物扩增，你将会在电泳上看到下列PCR产物大小假如你使用是M13 和你特异引物进行扩增，你需要决定PCR产物是否是期望。12页图有利于你计算。重组杆状病毒产生转染昆虫细胞：介绍：一旦你证实了你重组杆粒含有你目标基因，就能够准备进行昆虫细胞转染了，以产生重组杆状病毒。本章提供指导和提议方便完成昆虫细胞转染准备质粒：你能够使用任何方法准备纯化重组杆粒DNA。杆粒DNA必需没有酚和NaCl污染，她们会杀死细胞，盐类会干扰脂类复合物，降低转染效率。我们推荐使用本企业产品提质粒。转染方法：推荐使用一个阳离子脂质体，比如Cellfectin试剂进行转染。此试剂用来提供给表示系统使用。Cellfectin试剂：不做翻译昆虫细胞系：推荐使用Sf9 和Sf21进行转染。High Five and Mimic Sf9不推荐因为她们转染效率低下。不过，假如你有了你杆状病毒株，你能够进行High Five and Mimic Sf9表示试验。转染介质：为了高效转染，我们推荐在无Grace昆虫细胞培养基中完成转染。注意Grace昆虫细胞培养基应该不含有FBS（血糖），因为蛋白在血糖和其补充物中会和Cellfectin试剂互作，影响转染。 注意：假如你在Sf-900 SFM中收获了Sf9或Sf21，你能够在不含有Grace培养基中完成转染，转染后能够轻易将Sf-900 SFM转变回去阳性对照：假如你有了从pFastBac对照质粒中得到重组杆粒，我们推荐，包含这个阳性对照在你试验中和转化中能够评定你结果。在这些杆粒中，包含-葡糖甘酶（Gus）和/或氯霉素乙酰转移酶（CAT）将会在PH或P10开启子控制下表示。在转染过后，表示Gus和CAT能够合适进行验证。所需材料：开始之前需要有下列材料： *从pFastBacTM结构（500ng/ul TE溶解，PH8.0）中纯化重组杆粒DNA *从适宜pFastBacTM对照结构中纯化重组杆粒DNA *适宜培养基收获Sf9或Sf21 *Cellfectin试剂（4度保留） *Graces昆虫细胞培养基，未被补充（培养基不含有补充剂，FBS或抗生素） *6孔培养板或其它组织 培养用具 *12X75mm灭菌管 *培养昆虫细胞完全培养基计算出你转染试验所需Sf9 细胞数量，进行扩增。转染前确定细胞健康且繁殖能力97%。转染条件：我们通常使用下列条件在Sf9中扩增杆状病毒株。对于你转染试验这些条件应该作为一个起始点，你能够经过改变DNA和Cellfectin试剂浓度和细胞密度对条件进行优化。 转染步骤：适用下列步骤在6孔板进行Sf9 细胞转染。假如你想在其它细胞培养用具中转染细胞，你需要对你条件进行优化。记得使用无补充Graces培养基，她不含有FBS或抗生素1、 在6孔板或35mm组织培养板，和每个孔2ml含有抗生素培养基中（比如：2mlSF900SFM包含50单位/ml青霉素和50ug/ml链霉素）接种9X105Sf9细胞。2、 27度细胞最少接触1小时3、 对于每个转染样品，准备杆粒DNA：Cellfectin试剂混合在12X75mm灭菌管中1） 将1ug纯化杆粒DNA稀释进入100ul未补充Grace培养基2） 完全混匀Cellfectin试剂，翻转混合5-10次。吸出6ulCellfectin试剂稀释进100ul未补充Grace培养基。3） 使用稀释Cellfectin试剂连接稀释杆粒DNA（总体积约210ul）。轻混合，室温抚育15-45分钟。4、 在DNA/脂肪混合体抚育过程中，从细胞中除去培养基并用2ml未补充Grace培养基清洗。弃去清洗培养基。5、 向每个含有混合体管子中加入0.8ml未补充Grace培养基，清混匀，将混合体加入到含有细胞孔中。6、 27度培养5小时7、 弃去DNA/脂肪混合体，向细胞中加入2ml全培养基（比如SF900SFM含有抗生素）8、 27度潮湿条件抚育72小时或指导你开始能够看到病毒感染现象。提取P1病毒株。分离P1病毒株介绍：带有芽孢病毒应该在转染以后释放入培养基72小时。不过，假如你转染效率不好，细胞可能在转染后4-5天也没有被病毒感染迹象。转染过后72小时，你需要亲自检验细胞是否有感染信号（下表）一旦细胞出现感染，使用下列步骤从培养基中收获细胞。感染细胞特征：使用倒差显微镜在250-400X观察感染细胞时，能够看到病毒感染细胞含有以下特点：感染记号显性描述早期（第一个二十四小时）细胞直径增加能够看到直径增大了25-50% 细胞核增大细胞核可能充满细胞晚期（24-72小时）细胞停止增加和单个细胞相比，细胞不再增大出现颗粒体病毒芽孢信号，出现小泡分离细胞从平板或曲颈瓶脱离很晚期（大于72小时）细胞消亡细胞出现消亡，单层细胞开始出现消亡制备P1病毒株：1、一旦从第8步得到转染细胞，上述晚期转染现象出现，就能够从每个孔中搜集含有病毒细胞，并转入灭过菌15ml带盖管子。500Xg离心5分钟除去细胞和大碎片 2、将上清转到新15ml离心管。这就是P1病毒株。4度避光储存。储存信息见下页 注意：假如你期望浓缩病毒株，你能够在离心后，使用0.2um低蛋白吸附滤器完成。病毒株储存：按下列条件储存：1、 避光，4度2、 假如培养基不含血清，加入FBS至终浓度为2%，血清能够作为蛋白酶底物。3、 对于长久保留，重新扩增后保留整株病毒于-80度4、 不要在4度时储存常常使用病毒。反复冻融会降低病毒滴度。下一步：得到你纯化P1杆状病毒株以后，你能够：1、 扩增毒株（下节具体介绍）这个过程推荐得到最高滴度毒株，而且在你试验中优化结果2、 决定你毒株滴定度（见病毒斑点试验）3、 假如你期望，纯化你病毒结构4、 使用P1病毒株感染Sf9进行表示预试验。注意：假如你想做一个小规模或是预试验，你能够直接使用P1毒株感染Sf9进行表示试验。因为毒株数量小，表示条件可能不能再生（假如滴度未知，MOI是不可知）扩增你病毒株介绍：P1毒株是小规模，低滴度毒株，你需要使用这株去感染细胞，从而产生高滴度P2株。转染Sf9细胞得到首株滴度通常为1X106到1X107pfu/ml。用以下步骤扩增得到P2株滴度为1X107到1X108pfu/ml。本章提供P2株制备和指导所需材料：SF9或Sf21；P1病毒株；适宜培养用具；组织培养试剂；27度潮湿培养箱关键：扩增P1病毒株，需要感染Sf9或Sf21 ，使用悬浮或单层培养。依据你需要，你能够任何规模扩增，不过你因你使用P1菌株量受到限制。通常扩增P1在10ml悬浮培养基中培养2X106细胞/ml或在6孔板培养2X106细胞/ml。计算感染所需Sf9细胞，随即Expand细胞。使用前确定你细胞健康而且繁殖力大于97%多样性感染（MOI）：为了扩增毒株，在多样性感染细胞范围是0.05-0.1。MOI就像每个细胞病毒数量一样需要定义。使用下列公式计算取得特定MOI需要多少病毒株：注意：假如你没有滴定你P1毒株，你需要假定滴度范围是1X106至107pfu/ml比如：需要感染10ml细胞，2X106细胞/ml，使用MOI =0.1我们假定P1 毒株滴度是5X106pfu/ml。扩增步骤：依据下列步骤在6孔板扩增P1毒株1、 感染当日，准备Sf9和Sf21细胞上清和细胞板，2X106细胞/孔。接触培养细胞室温1小时2、 1小时后倒差显微镜检验细胞吸附情况3、 每孔加入适宜数量P1毒株4、 27度潮湿培养箱抚育细胞48小时5、 感染后48小时，从每个孔搜集2ml含有病毒培养基，转到15ml管子。500Xg离心5分钟弃去细胞和碎片。注意：能够在感染晚期收获病毒（72小时）。每个杆状病毒结构决定了优化收获时间。过分培养将会因为细胞调亡使生殖能力衰减6、 将上清转到15ml管子。这是P2毒株。4度避光保留。长久保留需要整株在-80度7、 检测你P2毒株滴度梯度扩增步骤：一旦你有了高滴度P2杆状病毒毒株，你能够梯度增加扩增病毒至任何体积。为了产生高滴度P3，梯度扩增细胞量和病毒体积要合适，遵照本章指导从冰冻主毒株取得高滴度毒株：假如你储存你毒株在-80度，我们推荐使用此株产生另外高滴度毒株进行表示试验。当病毒在-80度保留时，滴度会降低。下面为指导和扩增过程病毒斑点试验（Performing a Viral Plaque Assy）:介绍：我们推荐使用斑点试验进行：决定你毒株滴度；斑点纯化病毒（可选）试验框架：决定病毒滴度，你需要1、 在6孔板Sf9细胞2、 准备10-flod连续稀释病毒株3、 将不一样稀释杆状病毒加入到Sf9 和感染细胞中1小时4、 弃去病毒覆盖细胞层使用Plaquing培养基5、 抚育7-10天计算每个稀释物中斑点病毒滴度影响原因：影响滴度原因很多：1、 目标基因大小。滴度通常会伴随目标基因增大而减小2、 转染效率。为了高转染效率，我们推荐使用Cellfectin试剂转染Sf9。准备DNA/脂质体混合物在非补充Grace昆虫培养基3、 杆状病毒株年纪。长久保留在4度或-80度病毒滴度全部会减弱。假如你病毒株已经保留了6个月-1年我们推荐在使用前滴度或重新滴度病毒4、 冻融次数。假如你储存在-80度，每次冻融全部会降低病毒10%滴度5、 错误储存方法。为了常常使用，病毒株应该整株保留在4度避光条件所需材料：试验前所需材料：1、 你澄清杆状病毒株（使用前存在4度）2、 合适培养基中Sf9或Sf21（每个被滴度杆状病毒株为30ml对数期细胞，5X105细胞/ml）3、 SF900SFM或其它适宜完全生长培养基4、 Sf900培养基（1.3X）（100ml；或其它何时培养基）5、 4%琼脂糖凝胶6、 灭菌细胞培养等级蒸馏水7、 100ml灭菌玻璃瓶8、 6孔子之培养板（每个毒株2个板用来滴定）9、 无菌台 10、40度和70度水域 11、微波炉（可选） 12、27度潮湿培养箱注意：假如你在血清补充培养基培养Sf9 （完全TNM-FN）。你需要有以下试剂1、 Grace昆虫培养基，补充过2、 Grace昆虫培养基（2X）3、 胎牛血清（FBS），高质量热灭火准备斑点培养基（Plaquing Medium）：斑点培养基由培养基和琼脂糖混合组成，对于斑点试验用来固定昆虫细胞。在开始下列步骤前立即准备斑点培养基。假如你培养Sf9在SF900SFM中，那准备Sf900斑点培养基。假如你培养是在TNM-FH，准备Grace斑点培养基。注意其它培养基也能够使用1、 在微波炉或70度水域20-30分钟溶化4%琼脂糖凝胶，溶化以后，下列物质放入40度水域*空，灭菌100ml瓶子*Sf-900培养基（1.3X）或Grace昆虫细胞培养基（2X） 2、4%琼脂糖凝胶液化后，将胶，培养基和空瓶子转到超净台 3、用下列方法快速制备斑点培养基： Sf900 斑点培养基：混合30mlSf-900培养基（1.3X）和10ml4%琼脂糖凝胶在100ml瓶子里，轻摇。 Graces斑点培养基：20ml热灭活FBS加入到100ml Grace昆虫细胞培养基（2X）瓶子。将25ml含有血清Grace昆虫细胞培养基（2X）和12.5ml细胞培养等级灭菌蒸馏水和12.5ml溶化琼脂糖胶混合在100ml空瓶子，轻轻混匀4、 使用之前将斑点培养基瓶子放回40度水域斑点试验过程：使用以下步骤在6孔板完成斑点试验以决定拟杆状病毒株滴度。假如你有了杆状病毒表示对照，我们推荐你对这个也作滴度。记得在试验中做一个阴性对照（无病毒） 注意：下列过程提供量适合滴度一个病毒株（每个病毒株2个6孔板）。假如你想滴度更多，对应增加试剂量1、 转染当日，收获Sf9 ，在Sf900 SMF中制备30ml细胞上清，5X105细胞/ml。（或其它完全培养基）。假如你有阴性对照，你需要另外一个板子2、 是细胞在板底定居，盖盖室温抚育1小时3、 1小时培养以后，相差显微镜观察细胞。Sf9应该是已经吸附而且50%已经融合。4、 准备8个梯度稀释（10-1到10-8）纯化病毒株，在Sf900 SMF或未补充Grace培养基，无FBS。为了做这些，你需要在12ml管子次序稀释0.5ml病毒株或前面稀释过4.5ml培养基。需要完成8个管子。5、 将装有Sf96孔板和稀释过病毒管子转移到超净台。标识上板子，需要2体积（一个样品一个复制品）按以下方法：10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。6、 从孔中除去培养基，立即用1ml适合稀释病毒替换。7、 室温抚育1小时8、 抚育1小时后，从40度水域中除去细胞和培养基瓶。9、 从最高稀释到最低稀释（10-8至10-3）次序，从孔中除去含有病毒培养基，使用2ml斑点培养基替换。立即操作避免细胞单层干燥10、 移动板子之前使用琼脂糖培养基覆盖10-20分钟11、 27度潮湿培养箱抚育7-10天之道斑点可见并能够计数。假如你想着色斑点计数，见下面，计算