科技攻关计划项目可行性研究报告样本.doc

利用白细胞介素对恶性肿瘤基因诊疗省科技攻关计划项目可行性研究汇报—范文网
一、 立项背景和意义
二十一世纪生命科学将是基因科学,伴随人类基因组图谱全部破译，基因诊疗肿瘤将使医学科学进入一个崭新时代。基因诊疗技术研究快速发展，IL-24在肿瘤诊疗方面将会是一座新里程碑。
基因诊疗恶性实体肿瘤是临床医生面临挑战性课题，因为肿瘤易转移特征，使手术、化疗和放疗等传统诊疗方法对晚期肿瘤诊疗有限。研究表明，肿瘤生长关键原因是血管形成，实体瘤表示，如血管生长因子、碱性成纤细胞生长因子和血小板源性生长因子等血管形成介导肿瘤产生新血管，利用原发肿瘤血管形成而转移。所以，寻求抑制肿瘤生长和血管形成进而阻止肿瘤转移方法尤为关键，基因疗法为恶性实体肿瘤诊疗提供了这种可能性。理想功效基因表示产物应能诱导肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤生长和肿瘤血管形成，对正常组织细胞无显著毒副作用。白细胞介素-24（IL-24）含有上述功效。现在,利用白细胞介素-24（IL-24）对恶性肿瘤基因诊疗,是发达国家研究热点之一。
白细胞介素-24（IL-24）是1995年Jiang H等人首先克隆并分离出该细胞因子，原名称黑色瘤分化相关抗原（mda－7），，mda－7因其分子结构、基因定位和细胞因子样特征而被正式命名为白细胞介素－24（IL-24）。
研究表明，借助腺病毒表示载体，将人白细胞介素－24基因转染肿瘤细胞，可特异性抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡，但不会影响正常细胞。IL-24这种作用在最少50余种人类恶性肿瘤细胞试验中得到证实，包含黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。能够认为IL-24是现在发觉唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表示刺激免疫系统蛋白基因。现在，P53、P10、Rb等抑癌基因正在用于基因诊疗临床试验（其中重组人P53腺病毒注射液已在中国生产上市，也是世界上第一个上市基因诊疗药品），但均不含有经过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞特征。所以，经过比较能够证实IL-24研究有着关键临床意义。
经过腺病毒介导人IL-24基因进行诊疗肿瘤基因诊疗技术，含有很关键社会、理论和临床意义。基因诊疗产品使细胞产生内源性目标蛋白质或多肽，产生特异生物诊疗。基因诊疗使给药愈加特异、高效和安全，达成医学科学所期望达成最高目标。基因诊疗药品将对基因工程蛋白质或肽类药品也形成严重挑战，用基因诊疗方法可替换反复使用、费用极高蛋白质药品，一次注射，可带来长久疗效或根治。
据世界卫生组织（WHO）统计，全世界每十二个月有500多万人死于多种癌症，每十二个月多种癌症患者多达2200万人。中国每十二个月约有600万肿瘤患者，假如有百分之一患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”，诊疗一个疗程，用药20支，其用量为120万支，按每支元人民币计算，中国市场为24亿元人民币，中国外市场百分之一为44亿元人民币。所以，基因诊疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量高科技项目。
该项目是我单位独立研究基因诊疗项目，现已独立完成了人白细胞介素－24基因克隆。从中国人外周血中分离单核细胞中克隆出人白细胞介素－24基因，经测序和国外公布人IL-24基因序列一致，说明我们已得到人IL-24基因。正进行重组腺病毒载体构建。
本单位是生物医药研究、开发、生产、经营专业化企业，是山东省高新技术企业，十余年来负担了多个项目标研究。独立研究IL-2（125ser）是山东省火炬计划项目、IL-18是山东省重大科技攻关项目、G-CSF 是济南市星火计划项目、α-2b干扰素抗病毒口含片是山东省SARS综合防治技术研究药品开发中标项目、重组人新型溶栓酶是济南市科技发展计划项目，其中IL-2（125ser）获省、市、区科技进步奖，并获国家科技部等五部委联合颁发《国家关键新产品证书》。有较强生物技术药品研究开发能力。
该项目标成功开发及产业化，势必将带动中国整个生物高新技术发展，并组成一个生物高技术平台，一个巨大产业，一个新经济增加点。同时,不仅能够在临床上有着关键诊疗意义，而且能够对广大肿瘤患者提供一条崭新诊疗路径，也将会对生命科学发展和山东省经济发展起到一定作用。
二、中国外现实状况和发展趋势：
经检索，在中国，只检索到军事医学科学院和苏州大学细胞和分子生物学教研室对IL－24基因克隆及在大肠杆菌中表示文件，未发觉利用腺病毒介导人IL-24基因来诊疗肿瘤报道。也未发觉利用Admax腺病毒表示系统来介导人白细胞介素－24基因诊疗肿瘤专利。所以，我单位研制重组人白细胞介素-24腺病毒注射液可形成自己知识产权。
在国外，只有美国等少数发达国家对携带IL-24基因重组腺病毒进行研究，还未有对其开发成药品报道。
现在中国未发觉有对IL-24进行药品研究单位和个人。
我单位从上世纪八十年代中期开始对生物技术进行研究，基础和国外同行业同时。已独立研制成功了IL-2（125ser）、IL-18、G-CSF、α-2b干扰素抗病毒口含片、重组人新型溶栓酶等生物技术高科技结果产品。拥有一支素质较高、经验丰富科研队伍。已对该项目进行了十二个月多研究，已完成人白细胞介素－24基因克隆。从中国人外周血中分离单核细胞中克隆出人白细胞介素－24基因，经测序和国外公布人IL-24基因序列一致，证实我们已得到人IL-24基因。正进行重组腺病毒载体构建。基因诊疗关键技术是表示系统，腺病毒表示系统被广泛用于基因诊疗、基因功效性研究、反义诊疗、疫苗开发等领域。我单位利用Admax腺病毒表示系统来介导人白细胞介素－24基因诊疗肿瘤，Admax腺病毒载体系统比现有其它腺病毒载体系统更有优势，含有构建简单、出毒快、单细胞病毒产量高等优点。
三、现有研究基础、特色和优势
1、        现阶段已达成关键技术指标和经济指标
（1）现阶段已完成人白细胞介素－24基因克隆。
（2）从中国人外周血中分离单核细胞中克隆出人白细胞介素－24基因，经测序和国外公布人IL-24基因序列一致，说明我们已得到人IL-24基因。
（3）正进行重组腺病毒载体构建。
2、        项目标创新点及在人才、资源和产业方面特色优势
重组人白细胞介素-24腺病毒关键创新点：
（1）、 白细胞介素－24是新发觉抗肿瘤细胞因子，中国外均未上市。
（2）、 利用Admax腺病毒作载体将IL-24基因介导到人体，对肿瘤细胞进行基因诊疗方法。
腺病毒载体系统通常应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，所以为人类蛋白进行正确翻译后加工和合适折叠提供了一个理想环境。大多数人类蛋白全部可达成高水平表示而且含有完全功效。
腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白表示。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，所以在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表示重组蛋白。尤其需要指出是：腺病毒含有嗜上皮细胞性，而人类大多数肿瘤就是上皮细胞起源。所以，腺病毒载体系统含有靶向性，使其能够靶向特定组织或细胞内复制增殖，表示目标基因，直接作用于病灶，抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡。
（3）、 Admax腺病毒表示载体含有构建简单，出毒快，单细胞病毒产量高等特点 。
Admax腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr Frank Graham在1999年创建一套重组腺病毒构建系统，该系统基础原理是经过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使共转染到293细胞中腺病毒载体穿梭质粒和辅助质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶作用下产生重组腺病毒。得到重组病毒是E1/E3缺失复制缺型腺病毒。和现在使用最普及AdEasy系统相比，有一定优势：AdMax系统只需要2~4周就能完成从质粒构建到重组出毒，成功率大于98%（其中95%克隆含有目标基因），因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒生存压力，有利于重组腺病毒基因组完整性；而AdEasy系统出毒成功率只有18-34%（Stratagene企业新版AdEasy XL系统成功率在94%左右），且在原核细胞（BJ5183）中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力腺病毒基因组更轻易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。
人才、资源和产业方面特色优势：
本单位是山东省科技厅认定高新技术企业及关键联络单位。在人才、资源和产业化方面含有以下优势：
1、有研究开发基因药品专业机构--生物技术研究所。配置有较完善科研生产检测仪器和设备（DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼发酵罐、发玛西亚蛋白层析系统、Waters高效液相、万级净化等级试验室等）。
2、拥有一支经验丰富、老中青相结合科研队伍。已开发出国家级新药“重组人白细胞介素-2（125ser）”和重组人粒细胞集落刺激因子”，并已取得国家药品监督管理局颁发新药证书和同意文号，现已投放市场。
3、有一座4000m2GMP标准生物药品生产车间（GMP证书编号：C1064），年生产药品能力可达千万支。
4、有完善科研协作网络。我单位和“美国俄亥俄州立大学分子生物学中心”、“中国协和医科大学”、“山东大学药学院”等中国外大专院校和科研院全部紧密合作关系。本项目是和中国协和医科大学共同合作研究科研项目。
5、我单位科研工作经验丰富，负担过省、市、区级科研项目多项。
上述条件，为“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”研制奠定了基础。
四、应用或产业化前景、市场需求
人白细胞介素-24（IL-24）是现在发觉唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表示刺激免疫系统含有双重功效蛋白基因。研究表明，借助腺病毒表示载体，将人白细胞介素－24基因转染肿瘤细胞，可特异性抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡，但不会影响正常细胞。IL-24这种作用在最少50余种人类恶性肿瘤细胞试验中得到证实，包含黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。
全世界每十二个月有500多万人死于多种癌症，每十二个月多种癌症患者多达2200万人。中国每十二个月约有600万肿瘤患者，假如有百分之一患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”，诊疗一个疗程，用药20支，其用量为120万支，按每支元人民币计算，中国市场为24亿元人民币，中国外市场百分之一为44亿元人民币。
该项目产业化后，可年产100万支，实现产值20亿元人民币，年销售收入可达12亿元人民币，年利税6亿元人民币，年创汇万美元。
所以，基因诊疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量高科技项目。同时，对包装、印刷、玻璃制品等行业起到带动作用。
五、研究内容和预期目标
研究内容：
1、人白细胞介素-24基因克隆
2、重组人白细胞介素-24腺病毒建立
3、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液质量控制和检测方法建立
4、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液抗肿瘤试验
总体目标
本项目估计投入800万元人民币。可完成基础性研究，取得重组人白细胞介素-24腺病毒注射液样品，整理出科研文件。
本单位现有资产1.6亿元人民币，职员116人。
经济目标
项目完成时，估计年新增产品销售额3000 万元、年新增交税总额200万元、年新增净利润 1000万元、年新增创（节）汇 200 万美元、年新增产值4000万元。
技术、质量指标：
参考国家«人基因诊疗研究和制剂质量控制技术指导标准»、«中国生物制品规程»、«中国药典»（）等要求建立重组人白细胞介素-24腺病毒注射液质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素-24腺病毒制品病毒纯度、病毒滴度测定和复制型病毒（RCA）、腺相关病毒检测方法学进行研究。
1、比活性：病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定，>3.3%。
2、复制型病毒（RCA）检测：A549细胞检测法，每3.0×1010VP中应
不高于1RCA（即≤1RCA/3.0×1010VP）。
3、腺相关病毒检测：采取PCR法，应无腺相关病毒（AAV）污染。
4、病毒纯度检测：采取高效液相色谱法或A260/A280法  纯度大于95%。
本项目属科技攻关项目，关键是完成技术性研究，取得该技术领域科研结果。产业化达产后，估计可实现产值10亿元人民币，年销售收入6亿元人民币，年利税3亿元人民币，年创汇1000万美元。用腺病毒携带IL-24基因诊疗肿瘤方法可形成专利。
六、研究方案、技术路线、组织方法和课题分解
1、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液技术方案
1.1 重组人白细胞介素-24腺病毒建立
（1） 人白介素-24基因克隆
从人外周血单个核细胞中提取mRNA，设计并合成特异引物，应用PCR方法扩增得到人白细胞介素-24基因片段。
（2） 人白介素－24基因序列确实证
将用PCR扩增出人白介素-24基因，进行测序，并和GeneBank报道结果比较，以确定扩增白介素－24基因序列正确性。
（3 ）携带人白细胞介素－24基因腺病毒穿梭质粒载体构建和判定
采取基因工程方法，将人白细胞介素－24基因克隆至腺病毒穿梭质粒载体中，经过限制性内切酶图谱法判定人白细胞介素－24基因是否重组到腺病毒穿梭质粒载体中。
（4） 重组人白细胞介素－24腺病毒构建
经过脂质体转染技术，将携带人白细胞介素－24基因腺病毒穿梭质粒载体转染293细胞（人胚肾细胞），提取重组腺病毒DNA进行PCR判定。
（5） 扩增前重组人白细胞介素－24腺病毒空斑筛选
利用噬斑纯化方法，将感染重组腺病毒293细胞进行培养，挑选出单个重组腺病毒，以确保扩增纯度和稳定性。
（6） 重组人白细胞介素－24腺病毒扩增、纯化
将经噬斑纯化取得重组腺病毒大量感染293细胞，以大量生产重组腺病毒。待感染病毒293细胞成熟后收获细胞，经反复冻融及离心等方法，除去细胞碎片，搜集上清，取得重组腺病毒。并经过超滤和离子交换方法来纯化和浓缩重组腺病毒，从而取得大量、高滴度、高纯度重组人白细胞介素-24腺病毒样品。
1.2、 重组人白细胞介素-24腺病毒注射液质量控制和检测方法建立
参考国家«人基因诊疗研究和制剂质量控制技术指导标准»、«中国生物制品规程»、«中国药典»（）等要求建立重组人白细胞介素-24腺病毒注射液质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素-24腺病毒制品病毒纯度、病毒滴度测定和复制型病毒（RCA）、腺相关病毒检测方法学研究。
（1）比活性：病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定
（2） 复制型病毒（RCA）检测：A549细胞检测法，每3.0×1010VP中应不高于1RCA（即≤1RCA/3.0×1010VP）
（3）腺相关病毒检测
采取PCR法，应无腺相关病毒（AAV）污染。
（4） 病毒纯度检测
采取高效液相色谱法或A260/A280法  纯度大于95%。
1.3 重组人白细胞介素-24腺病毒注射液抗肿瘤试验
将重组人白细胞介素-24腺病毒注射到肿瘤细胞，观察重组人白细胞介素-24腺病毒抗肿瘤效果。
2、本企业在生产场地、公用工程、辅助设施等方面已含有条件和需新增加基础建设内容。
我单位有研究开发基因药品专业性生物技术研究所，有着从事多年生物技术药品研究和开发经验，曾研制出“注射用重组人白介素-2（125Ser）、注射用重组人白介素-18、α-2b干扰素口含片、新型溶栓酶”等高科技生物药品，含有良好科研基础。配置有较完善科研生产检测仪器和设备：DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼发酵罐、发玛西亚蛋白层析系统、Waters高效液相、万级净化等级试验室等。现有生物药品GMP生产车间和两条生物药品生产线，含有良好生产条件。
3、述生产过程中“三废”排放、“三废”处理方法和生产过程中职业危害原因分析及采取保护方法方案。
重组人白细胞介素-24腺病毒注射液研制和生产过程，无三废排放。
4、特殊行业许可证报批情况
我单位企业法人营业执照（执照号：8）、药品生产企业许可证（证号：鲁01Sz0020）和药品GMP证书（证书编号：C1064）等证照齐全。

5、说明本项目推广应用计划和保障方法
（1）本项目研制成功后，我单位自行生产。
（2）本单位有一座4000m2 GMP标准生物药品生产车间，含有完备生产仪器、设备，年生产能力可达上千万支生物制剂。
（3）本单位有专业销售企业，销售网络遍布全国30多个省市自治区，本项目产业化后即可上市推广。
（4）该项目有着巨大社会意义和经济效益，企业对该项目极为重视，不仅组织了科研能力较强专职研究队伍，加大资金投入，而且组织了由5位中国著名院士、6名著名教授组成教授组，对“重组人白细胞介素－24注射液”基因诊疗项目进行了论证指导，确保了本项目标可行性。
七、年度计划内容：
本项目计划为三年
1月-6月  载体构建             经费投入估计 300万元
7月-12月 载体判定             经费投入估计 100万元
1月-6月  重组腺病毒扩增纯化   经费投入估计 100万元
7月-12月 重组腺病毒质量研究   经费投入估计 100万元
1月-12月 重组腺病毒抗肿瘤细胞试验   经费投入估计  200万元
八、关键研究人员和单位简况及含有条件
1、关键参与人员情况
邹立家，硕士导师，药理、药学专业教授，在药理、药学学科方面有着很深造诣和贡献，有著作5部，科研结果8项。曾参与研制开发IL-2125Ser）、IL-18工作；现参与白介素-24（IL-24）研制开发工作，并任课题组责任人。
韩代书，博士、教授，中国协和医科大学博士生导师，细胞生物学专业教授，在细胞生物学学科方面有着很深造诣和贡献，有数十篇论在国际刊物上发表。是本单位科研课题组关键组员。
王加旺，博士，微生物专业，有6篇论文在国家级刊物上发表，曾参与IL-2（125Ser）、IL-18工作、α-2b干扰素抗病毒口含片、新型溶栓酶等项目标研究开发，是本单位研究所课体组关键组员。
苑波，博士后、教授，长久在美国从事基因组学科技研究，是美国著名基因组学科学家，被美国政府评为“十大科技青年”，多年来一直和我单位合作。

    课题组其它组员均在生物技术研究所长久工作，是“注射用重组人白介素-2（125Ser）”课题组原班人马，她们在“白介素-2（125Ser）”、“rhG-CSF”和“IL-18”等高科技产品研制开发过程中做了大量工作，取得了优异成绩，被济南市科技局评为“科技优异集体”、被济南市药监局评为“科技进步优异集体”。
2、单位法人近几年来研究开发业绩
我单位法人长久从事科研工作，率领企业负担了国家级、省级、市级星火计划、火炬计划、科技攻关、技术改造、关键工业项目等十几项科研开发及产业化项目，被广泛应用于社会各关键领域，多项结果填补了国家空白，取得了令人瞩目标成绩，受到各级政府和社会各界充足肯定和高度评价。
关键科技结果3项，科技著作2部。并领导本单位全体科研人员研制出了“注射用重组人白介素-2（125Ser）”、“重组人粒细胞集落刺激因子注射液（rhG-CSF）”、“注射用重组人白细胞介素-18（IL-18）”、“新型重组溶栓酶”、“α-2b干扰素口含片”等多项生物技术药品。“注射用重组人白介素-2（125Ser）”和“重组人粒细胞集落刺激因子注射液（rhG-CSF）”两项新药分别被列为《国家星火计划项目》和《山东省火炬计划》，《山东省技术改造导向计划》，《济南市三十项关键技术改造项目》。其中“注射用重组人白介素-2（125Ser）”各项关键技术指标，均达成国际领先水平，填补了中国空白。被国家五部委（中国科学技术部、国家税务总局、中国商务部、中国国家质量监督检验检疫总局、国家环境保护总局）认定为“国家关键新产品”，获山东省科技进步一等奖。(
在抗癌科研方面也做了长久大量工作，正式发表文章已被国外学术杂志引用，被聘为“山东省抗癌协会”常务理事，被“国际儿童癌症诊疗联合会”聘为高级顾问。
企业投资上亿元建起了生物工程药品生产基地。建有GMP生物制药生产车间、科研综合楼、办公楼等16000多平方米基础设施，并从发达国家引进了优异科研、生产设备仪器，建立了产学研一体化产业基础。
3、单位技术装备水平、试验仪器情况。
（1）我单位现已含有4000m2GMP生产车间（GMP证书编号：C1064）
（2）研究开发基因药品生物技术研究所，多年从事生物技术药品研究和开发，含有良好科研基础。
（3）研究所配置有较完善科研生产检测仪器和设备：DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼发酵罐、发玛西亚蛋白层析系统、Waters高效液相和万级净化等级试验室等。
九、经费预算
项目总投资800万元，申请科技三项经费100万元，自筹440万元，银行贷款250万元，省科技经费拨款10万元。其中已完成投资100万元。