甘蔗镰孢菌插入突变体库的构...异突变体筛选及突变基因定位_蒙姣荣.pdf

热带作物学报 2023,44(2):233-245 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-05-10；修回日期 2022-06-15 基金项目 国家自然科学基金项目（No.31960031）；广西科技基地和人才专项（桂科 AD17129002）；广西甘蔗重点实验室自主课题项目（No.2018-266-Z01）。作者简介 蒙姣荣（1971），女，博士，副教授，研究方向：植物病理学。*通信作者（Corresponding author）：陈保善（CHEN Baoshan），E-mail：。甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及 突变基因定位 蒙姣荣1,2，黄海娟3，杨惠贞3，曾 泉3，李珅雨1，陈保善1,2*1.广西大学农学院/广西甘蔗生物学重点实验室，广西南宁 530004；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004；3.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530004 摘 要：由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease,PBD）是甘蔗的主要病害之一。在广西，甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）是 PBD 的优势病原菌。尽管 PBD 的研究已有较长的历史，但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理，本研究采用农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）技术构建甘蔗镰孢菌 FF001 菌株的 T-DNA 插入突变体库。采用携带潮霉素 B 磷酸转移酶基因pTHR1-AH 双元载体的农杆菌菌株 AGL-1 介导转化 F.sacchari 分生孢子，获得 3018 个转化子；随机选取 12 个转化子进行 PCR 检测和 Southern 杂交分析，结果显示所有检测突变株均插入潮霉素 B 磷酸转移酶基因，多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力，获得致病力明显减弱 21 个和致病力增强 9 个，共 30 个突变体。通过 TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对，确定了其中 27 个突变株的 T-DNA 插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失，导致 1 个插入位点可以影响 1 个以上的功能基因。T-DNA 插入位点多为编码区和启动子区，少数为终止子区和间隔区。受影响的基因分别编码-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase）、中性氨基酸渗透酶（neutral amino acid permease）、寡聚高尔基复合体成分 4（oligomeric golgi complex component 4）、寡肽转运蛋白（oligopeptide transporter）、酰基辅酶 A 脱氢酶（acyl-CoA dehydrogenase）、乙酰乙酰-CoA 合成酶（acetoacetyl-CoA synthetase）、碳酐酸酶（carbonic anhydrase）、Bud 10 蛋白（Bud 10 protein）、类驱动蛋白 bimC（kinesin-related protein bimC）、锌指蛋白 ASD4（zinc finger protein ASD4）、转录起始因子 TFIID（transcription initiation factor TFIID）、角质酶 G-box 结合蛋白（cutinase G-box binding protein）、吖啶黄素敏感性控制蛋白（acriflavine sensitivity control protein ACR-2）、核类 VCP 蛋白（nuclear VCP-like protein）、热激蛋白 HSP30（heat shock protein 30）、硫氧还蛋白（thioredoxin）、2C 型蛋白磷酸酶（type 2C protein phosphatase）、核糖核酸外切酶（exoribonuclease）、硒蛋白（selenoprotein）、DNA 聚合酶（DNA polymerase eta）、存活因子 1（survival factor 1）和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase）等 22 个已知功能蛋白和 16 个未知功能蛋白。部分突变基因，如锌指蛋白 ASD4、角质酶 G-box 结合蛋白、寡肽转运蛋白和 2C 型蛋白磷酸酶等，已分别在稻瘟病菌、稻曲病菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰孢菌等植物病原真菌中证实为致病相关基因。多种类型致病相关突变体的获得，为深入研究甘蔗镰孢菌致病分子机理提供了新的材料。关键词：甘蔗镰孢菌；农杆菌介导；遗传转化；致病力相关基因；侧翼序列；甘蔗梢腐病 中图分类号：S435.661 文献标识码：A Construction of Fusarium sacchari Mutant Library,Screening of Pathogenic Mutants,and Identification of Mutated Genes MENG Jiaorong1,2,HUANG Haijuan3,YANG Huizhen3,ZENG Quan3,LI Shenyu1,CHEN Baoshan1,2*1.College of Agriculture,Guangxi University/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology,Nanning,Guangxi 530004,China;2.234 热带作物学报 第 44 卷 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Nanning,Guangxi 530004,China;3.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004,China Abstract:Pokkah boeng disease(PBD)caused by Fusarium complex is one of the major diseases in sugarcane with great impact on the sugarcane industry worldwide.F.sacchari is the prevalent species responsible for PBD in Guangxi.Albeit of a long history of study on the disease,the mechanisms underlying the pathogenicity of the pathogen are still far from clear.To tackle this challenge,we generated an insertional mutant library by transformation of the conidial spores from F.sacchari strain FF001 via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT).A total of 3018 hygromycin B-resistant transformants were obtained.Among 12 transformants randomly selected,nine out of 12 trans-formants carried a single copy of T-DNA,as verified by PCR and Southern blot analysis.The mutants were further screened for virulence variation on detached leaves and 30 mutants with obvious changes in virulence were obtained,including 21 mutants with significantly attenuated and 9 mutants with enhanced virulence.The sites of insertion were determined by thermal asymmetric interlaced PCR(TAIL-PCR)and sequence alignment to the genome sequence of F.sacchari.The majority of the insertions were found in coding regions or promotor regions,with a few in terminator or intergenic regions.It was observed that a few insertions were accompanied with genome fragment deletion,resulting in more than one genes being disrupted in a single insertion.Among the 22 mutated genes with annotated functions were those encoding alpha-mannosidase,neutral amino acid permease,oligomeric Golgi complex component 4,oligopeptide transporter 2,acyl-CoA dehydrogenase,acetoacetyl-CoA synthetase,carbonic anhydrase,Bud 10 protein,kine-sin-related protein bimC,zinc finger protein ASD 4,transcription initiation factor TFIID,cutinase G-box binding pro-tein,acriflavine sensitivity control protein ACR-2,nuclear VCP-like protein,heat shock protein 30,thioredoxin,type 2C protein phosphatase(PP2C),exoribonuclease,selenoprotein,DNA polymerase eta,survival factor 1,and aldehyde de-hydrogenase,several of which,such as zinc finger protein ASD4 in Magnaporthe oryzae,cutinase G-box binding pro-tein in Ustilaginoidea virens,oligopeptide transporter in Colletotrichum gloeosporioides,PP2C in Fusarium oxysporum,have been implicated as pathogenicity genes.The availability of the diversified pathogenic mutants lay a new founda-tion for further study on the molecular pathogenic mechanisms of F.sacchari.Keywords:Fusarium sacchari;Agrobacterium tumefaciens-mediated;transformation;pathogenicity related genes;flanking sequence;pokkah boeng disease DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.02.002 甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease,PBD）是甘蔗重要的真菌性病害之一，在我国主要甘蔗产区普遍发生，且有逐年上升的趋势1。通常年份甘蔗梢腐病可使甘蔗减产 5%20%，发病严重的年份可减产 30.2%48.5%，糖分降低 2.63%5.21%，造成甘蔗产量及糖分巨大损失1-2。有效防治甘蔗梢腐病已成为目前确保甘蔗糖产业稳定发展急需解决的主要问题之一。甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）最早从甘蔗上分离出来，其有性阶段为甘蔗赤霉菌（Gibberella sacchari），是甘蔗梢腐病优势病原菌3-6；此外，甘蔗镰孢菌还是甘蔗枯萎病（sugarcane wilt）的病原菌，该病害对甘蔗产量及其糖含量的影响比甘蔗梢腐病的更为严重，是一种毁灭性病害7-8。在我国，有从小麦赤霉病样品上分离到甘蔗镰孢菌的报道9，在香蕉果实和叶片上也经常分离到甘蔗镰孢菌10-11。目前，针对甘蔗镰孢菌的致病分子机理研究十分有限，已有的文献涉及铁红素合成酶基因功能鉴定、产生毒素种类鉴定和携带真菌病毒种类鉴定等5,12-13。最近的文献报道，在甘蔗镰孢菌与甘蔗互作的研究中鉴定获得一批甘蔗镰孢菌的效应蛋白14-16。农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tu-mefaciens-mediated transformation,ATMT）是获得随机插入突变体的主要遗传手段之一，其转化起始材料通常不需经过去除细胞壁，如分生孢子、菌丝体均可用于转化，操作简便；同时具有转化率高及多为单拷贝插入等优点，被广泛应用于真菌功能基因的研究17-19，在包括镰孢菌在内的多种植物病原菌致病基因功能及其致病机制的研究中已有较多成功应用的报道20-22。王鑫等23采用ATMT技术构建了的甘蔗梢腐病菌 CNO-1菌株的突变体库，并针对生长速度减慢突变体的插入位点序列进行分析。本课题组于 20162018 年对广西甘蔗梢腐病发生情况进行全面调查，并对其病原菌进行鉴定，明确甘蔗镰孢菌是广西甘蔗梢腐病菌的优势病原菌种类6，并对分离获得的强致病力代表性菌株 FF001 进行了全基因组序列测定第 2 期 蒙姣荣等：甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位 235 （尚未发表）。本研究采用 ATMT 技术构建菌株FF001 的突变体库，筛选致病力差异较大的突变体，并对突变基因进行定位分析，以期为克隆致病相关基因提供研究材料，为甘蔗镰孢菌的致病分子机理研究奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌种、质粒与甘蔗品种 甘蔗镰孢菌FF001 菌株为本课题组从具有典型梢腐病症状的甘 蔗 病 株 上 分 离 纯 化 并 保 存6；大 肠 杆 菌（Escherichia coli）Trans1-T1 感受态和 pEASY-T1 Clonging Kit 购自北京全式金生物技术有限公司；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株AGL-1，携 带 潮 霉 素 B 磷 酸 转 移 酶 基 因 的pTHR1-AH 质粒由本实验构建并保存。甘蔗品种中蔗 9 号为甘蔗梢腐病感病品种，用于致病力测定。1.1.2 主要试剂 抗生素利福平（rifampicin,Rif）、氨苄青霉素（ampicillin,Amp）、壮观霉素（spectinomycin,Spe）、头孢霉素（cefalosporiner,Cef）、潮霉素 B（hygromycin B,Hyg B）、乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和 2-(N-马啉)乙基磺酸2-(N-morpholino)ethane-sulfonic acid，MES均购自北京索莱宝科技有限公司。琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒小量提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DIG Wash and Block Buffer Set 试剂盒和 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒购自罗氏公司。2Es Taq Master Mix 购自北京全式金生物技术有限公司，马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）购自美国BD 公司（Becton,Dickinson and Company），其他试剂均为国产分析纯。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.1.3 培养基 PDA：按照 BD 公司说明书配制。LB（luria-bertani medium）培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，用纯水定容至1000 mL，pH 7.07.2；基础培养基（minimal medium,MM）：无水葡萄糖 2.0 g，KH2PO4 2.05 g，KH2PO4 1.45 g，NH4NO3 0.5 g，(NH4)2SO4 0.5 g，MgSO47H2O 0.6 g，NaCl 0.3 g，CaCl2 0.01 g，FeSO4 0.001 g，Z-Salts 溶液（1000 mL Z-Salts 含ZnSO47H2O、CuSO45H2O、H3BO4、MnSO4H2O及 NaMoO4H2O 各 0.1 g）5.0 mL，用纯水定容至1000 mL，pH 6.77.0；诱导培养基（induced medium,IM）：MES 7.808 g，无水葡萄糖 2.0 g，K2HPO4 2.05 g，KH2PO4 1.45 g，NH4NO3 0.5 g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO47H2O 0.6 g，NaCl 0.3 g，CaCl2 0.01 g，FeSO4 0.001 g，Z-Salts 溶液 5.0 mL，用纯水定容至 1000 mL，pH 5.6。上述培养基加入15.018.0 g 的琼脂粉，即为固体培养基。1.2 方法 1.2.1 根癌农杆菌介导的甘蔗镰孢菌遗传转化 参照文献23的方法进行遗传转化，并稍作修改。具体步骤：将携带 pTHR1-AH 质粒的农杆菌AGL-1 菌株在 LBA 培养基（Rif、Amp 和 Spec终浓度均为 50 g/mL）上划线，28培养 2 d 后挑取单菌落接种到 MM 液体培养基中（Rif、Amp和 Spec 终浓度均为 50 g/mL），28条件下振荡培养（200 r/min）2 d，4500 r/min 室温离心 5 min，用 1 mL IM 培养基重悬菌体，并稀释至浓度 OD600为 0.1，加入 AS（终浓度为 200 mol/L），28，振荡培养 48 h（200 r/min）；配制浓度为 1104个/mL 的新鲜甘蔗镰孢菌分生孢子悬浮液，与上述步骤获得的农杆菌菌液按 11 比例混合，涂布于IM 固体培养基表面的 0.45 m 孔径微孔滤膜上，25条件下共培养 2 d；将微孔滤膜转移至筛选PDA培养基上（含 400 g/mL Cef和 50 g/mL Hyg B），并在微孔滤膜上加一层筛选 PDA 培养基（含400 g/mL Cef 和 100 g/mL Hyg B），25培养23 d 即有可见转化子长出，将转化子转移到新的筛选 PDA 培养基上（Cef 400 g/mL，Hyg B 100 g/mL），25培养 23 d，再次转移到另一新的筛选 PDA 培养基上（含 Cef 400 g/mL，Hyg B 50 g/mL），25培养 45 d。经过 3 次筛选可在含 50 g/mL Hyg B PDA 培养基上正常生长的转化子即认定为稳定遗传转化子，即可保存备用。1.2.2 突变株总 DNA 的提取及分子鉴定 用CTAB 法提取野生型菌株和突变株的基因组DNA。突变株的 PCR 鉴定：以野生型菌株 FF001和突变株的基因组 DNA 作为模板，使用特异性引物 AMP F/HPH-1 R（表 1）进行 PCR 扩增，反应体系总体积 25 L：2Ex Taq Master Mix 12.5 L；10.0 mol/L 引物 AMP F 1.0 L；10.0 mol/L 引物 HPH-1 R 1.0 L；DNA 模板（2050 ng/L）236 热带作物学报 第 44 卷 1.0 L，ddH2O 9.5 L。反应条件：95预变性5 min，94变性 1 min，60退火 1 min，72延伸 1 min，运行 30 个循环，72延伸 10 min。Southern 杂交分析：大量提取野生型菌株和突变的基因组 DNA（50 g），分别用快速限制性内切酶 Xba I 进行单酶切，在 37恒温条件下反应过夜，酶切产物经氯仿抽提 2 次后取上清加入 2 倍体积的无水乙醇和 3 mol/L 醋酸钠溶液，充分混匀，80超低温冰箱放置 30 min，4，12 000 r/min离心 15 min，弃上清液；再加入 500 L 75%的乙醇溶液洗涤沉淀 2 次，自然晾干，加入 35 L ddH2O 溶解，取 25 L 进行琼脂糖凝胶电泳并转膜。以质粒 pTHR1-AH 为模板，用引物 AMP F/HPH-1 R 进行扩增获得的 DNA 片段作为探针，参照罗氏公司地高辛试剂盒说明书进行标记，杂交。按照 DIG Wash and Block Buffer Set 试剂盒说明书进行洗膜等。用 LAS500 超灵敏化学发光成像仪成像分析杂交结果。表 1 本研究所用引物 Tab.1 Primers used in this study 引物名称 Primer name 序列（53）Sequences(53)AMP F CTGGATGGAGGCGGATAAAGTT HPH-1 R CGCCCTCCTACATCGAAGCT RSP2 TTTACCCTACAAGTTGGCGCTGACC RSP3 TTCGGTATGTCCGCGGTATGTCAGC RSP4 AGAGGATCCCCCTGCTGGGATTAC M13-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC LSP3 GCTTCCTTAACTGCAAGCGCAATGGLSP2 CCAACCTCCGAAGTGGAGCTCG AD5 GTNCGASWCANAWGTT Note:S=C/G;W=A/T;N=A/G/T/C.1.2.3 突变体致病力的测定 参照 WANG 等24接种叶片的方法进行突变株的致病力测定。突变体及野生型菌株分别接种于 PDA 平板上，28培养 45 d，在菌落边缘取直径 0.6 cm 的菌丝圆片；选取生长 48 个月，健康甘蔗植株（中蔗 9 号）完全展开的+1 或+2 位叶片，弃其基部约 10 cm，依次剪取约 6 cm 叶片（一张叶片约 8 个叶片节段），从叶片边缘垂直中脉方向剪一切口（切口大约为 1.0 cm），将菌丝圆片覆盖在切口上，保湿，28条件下培养 34 d，记录病斑出现时间，测量病斑直径，每个突变株接种 3 张叶片。经过 3 次致病力测定获得遗传稳定的致病变异突变株：第一次初筛使用突变库所有突变株进行致病力测定，第二次复筛使用第一次初筛致病力有明显变化（增强或减弱）的突变株，第二次复筛获得的致病力有明显变化的突变株经过单孢分离后进行第三次致病力测定，当 1 个突变株的 3 个以上的单孢分离株均表现为致病力有明显变化且表现一致时（即所有单孢分离株致病力全部变弱或全部增强）确定为致病变异突变株，并用于插入位点序列扩增与基因定位分析。1.2.4 致病变异突变体 T-DNA 插入位点侧翼序列的扩增与突变基因定位 使用 AD5 随机引物和右边界（right border,RB）及左边界（left border,LB）序列的特异引物，参照文献25-26采用热不对称交错 PCR（thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）方法对突变体的 T-DNA 侧翼序列进行扩增。第一轮反应以突变株总 DNA 作为模板，简并引物 AD5 与特异引物 RSP4（RB 侧翼序列）或 M13-47（LB 侧翼序列）为引物；以第一轮反应的 PCR 产物（稀释 50 倍）作为模板进行第二轮反应，引物为 AD5 与 RSP3 或 LSP3；以第二轮反应的 PCR 产物（稀释 50 倍）作为模板进行第三轮反应，引物为 AD5 与 RSP2 或 LSP2。TAIL PCR 结束后取 5.0 L 第二轮和第三轮 PCR 的扩增产物，在 1.5%琼脂糖糖凝胶进行电泳分析，使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒对第二轮或第三轮 PCR 产物进行纯化回收，与 pEASY-T1 载体连接并转化大肠杆菌 Trans1-T1 感受态，质粒小量提 取 试 剂 盒 提 取 阳 性 克 隆 并 测 序。利 用SNAP.GENE 软件上查找所获得序列的特异引物（RSP3 或 RSP2、LSP3 或 LSP2）及 T-DNA 的RB 和 LB 侧翼序列，并与甘蔗镰孢菌 FF001 的基因组序列（尚未发表数据）比对，结合 NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov）比对结果，确定插入位点基因及其功能。2 结果与分析 2.1 农杆菌介导的甘蔗镰孢菌的遗传转化 使用携带潮霉素抗性基因 pTHR1-AH 质粒的农杆菌 AGL-1 菌株介导转化甘蔗镰孢菌分生孢子，在含 Hyg B 的筛选 PDA 培养基依次进行 3次筛选（前 2 次 Hyg B 浓度为 100 g/mL，第三次为 50 g/mL），获得 3018 个稳定遗传的 Hyg B抗性转化子，依次命名 FsAT0001FsAT3018。随机提取 50个转化子接种于不含 Hyg B的 PDA上，第 2 期 蒙姣荣等：甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位 237 28条件下培养 7 d 后进行培养性状观察。结果显示，大部分转化子的在 PDA 上的生长速率和菌落形态与野生型菌株 FF001 的未有明显区别，少数转化子表型与野生型相比表现很大的差异，表现为生长速率减慢、生长衰减和产生色素等（图 1）。FF001 FsAT2026 FsAT2206 FsAT2242 FsAT2418 图 1 野生型菌株 FF001 和 4 个表型明显变化转化子的培养性状 Fig.1 Colonial morphology of wild type strain FF001 and four transformants with significant changes in phenotypes 2.2 转化子分子鉴定 为确定获得的转化子是否携带潮霉素抗性基因及其插入拷贝数，依据 pTHR1-AH 双元表达载体的序列（图 2A）设计引物 AMP F/HPH-1 R，随机挑选 12 个转化子提取总 DNA 进行 PCR 检测。结果显示，所有检测转化子和 pTHR1-AH 阳性对照均能扩增出约 1900 bp 特异性目标条带，而野生型菌株 FF001 没有扩增任何可见条带（图2B）；同样地，以 AMP F/HPH-1 R 为引物，扩增pTHR1-AH 获得的 DNA 作为探针进行 Southern杂交，测试的 4 个转化子均出现杂交条带，野生型菌株 FF001 没有杂交条带（图 2C），说明 T-DNA片段已经整合在 FF001 菌株基因组上。统计 12个转化子的 Southern 杂交结果，有 9 个突变株的T-DNA 为单拷贝插入，3 个突变株为双拷贝插入，未观察到 3 个及以上拷贝插入。A：PCR 引物和 Southern 杂交探针位置示意图。B：突变株的 PCR 检测电泳图，引物为 AMP F/HPH-1 R；1:pTHR1-AH；2：野生型菌株 FF001；38：突变体；9：对照（水）。C：突变株的 Southern 杂交分析，14：突变体；5：野生型菌株 FF001。M：1 kb Plus DNA ladder。A:Scheme of genomic DNA of F.sacchari disrupted by T-DNA integration,AMP F/HPH-1 R primers and probe used for hybridization are indicated.B:PCR detection of the transformants with the AMP F and HPH-1 R primers,1:pTHR1-AH;2:Wild-type FF001;38:Independ-ent transformants;9:Water.C:Southern blot analysis of wild type Fs FF001 and four transformants,14:Mutant;5:Wild-type FF001.M:1 kb Plus DNA ladder.图 2 部分转化子的潮霉素磷酸转移酶基因的 PCR 检测及 Southern 杂交分析 Fig.2 PCR detection of hph gene and southern Southern blot analysis of transformants 2.3 致病变异突变体的筛选 为获得甘蔗镰孢菌致病相关基因，采用叶片离体接种法进行 3 次筛选，测定了所有 3018 个转化子的致病力。接种野生型菌株 FF001 34后，甘蔗叶片表现出黄色的坏死斑，病斑长度在 2.0 3.0 cm之间；有21个突变株表现为致病力下降（如图 3 中 FsAT1336、FsAT2953 和 FsAT3001 菌株），接种 34后，病斑长度在 1.02.5 cm 之间；此外，有 9 个突变株表现为致病力增强（如图 3 的FsAT0444 和 FsAT1899 菌株），接种 3 d 后即可产生明显的病斑，病斑长度超过 3.5 cm；其余的大部分转化子致病力未有明显变化（图 3 的 FsAT0126238 热带作物学报 第 44 卷 菌株），病斑产生的时间其大小与野生型菌株相比无明显差异（图 3）。2.4 致病变异突变体插入位点侧翼序列扩增 为明确致病变异突变体 T-DNA 插入位点的侧翼序列，提取所有 30 个致病变异突变体总DNA，采用 TAIL-PCR 的方法分别插入位点的侧翼序列进行 3 轮 PCR 扩增。分别取第二轮或第三轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，共有 27 个突变株在第二轮或者第三轮 PCR 后获得清晰的特异条带，其中有 12 个突变体的左右边界侧翼序列均能有效扩增，其余突变株只能单一的侧翼序列；3 个突变株（FsAT0007、FsAT0017和 FsAT1019）未能有效扩增出侧翼序列片段；部分突变株第三轮 TAIL-PCR 后仍有 23 条清晰条带。图 4 为部分突变株第二轮或第三轮反应后的PCR 产物的电泳凝胶图。图 3 野生型菌株 FF001 和部分转化子的致病力 Fig.3 Pathogenicity of wild type strain FF001 and partial transformants A：第二轮反应 PCR 产物；B：第三轮反应 PCR 产物；M：1 kb Plus DNA ladde；15：突变体。A:Products from the secondary reactions;B:Products from the tertiary reactions;M:1 kb Plus DNA ladder;15:Mutant.图 4 5 个突变株的 TAIL-PCR 产物的电泳凝胶图 Fig.4 Agarose gel analysis of TAIL-PCR products of five mutants 2.5 致病变异突变体插入位点 T-DNA 边界序列特点 将 TAIL-PCR 产物回收纯化后测序，对扩增出 2 条及以上条带的转化子，剔除片段较短或T-DNA 边界序列不完整的序列，最终获得 39 条有效序列，其中 RB 侧翼序列 24 条，LB 侧翼序列 15 条。为确定 T-DNA 整合到甘蔗镰孢菌基因 组中的方式，将侧翼序列分别与载体 pTHPR1-AH的 T-DNA 序列比对，发现在 24 条 RB 侧翼序列中，RB 边界序列完整的有 20 条，占比 83.3%（未显示）。相反，在 15 条 LB 侧翼序列中，LB 边界序列完整的仅有 5 个，占比 33.3%，其余序列的LB 边界均有不同程度的截短，其中 FsAT0372 突变株 LB 边界序列缺失片段最长，为 64 bp（图 5）。图 5 致病突变体 T-DNA 插入位点左边界序列分析 Fig.5 Alignment of the left border(LB)sequences at the junction of T-DNA integration site of F.sacchari 第 2 期 蒙姣荣等：甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位 239 2.6 致病变异突变体突变基因的定位及其功能 将侧翼序列与甘蔗镰孢菌 FF001 菌株基因组序列进行比对，结合 NCBI 比对结果，获得突变及其对应基因的功能注释。与 FF001 基因组序列进行比对结果显示，FsAT2418 突变株 RB 和 LB侧翼序列分别与 2 条不同 contig（contig00006 和contig00011）上的序列对应，其余突变株的侧翼序列均对应于 FF001 基因组的单一序列，分布在9 条 contig 上；对同时获得 RB 和 LB 侧翼序列的12 个突变体的插入位点进一步分析，发现在突变体 FsAT3008 中，T-DNA 插入为直接插入；在FsAT1780 和 FsAT2324 中，T-DNA 插入造成 22 23 bp 的小片段基因组缺失，而其余突变株中，T-DNA 插入均可造成基因组较大片段的缺失，其大小在 22026129 bp 之间。此外，突变株 FsAT0213 和FsAT1666 的 RB 插入位点相同，FsAT1899 和FsAT2418 RB、FsAT0166 RB 和 FsAT1899 LB 分别插入同一基因的不同位点（图 6）。*括号中的数字表示基因组 DNA 缺失片段的大小。The numbers in parentheses indicate the size of genomic DNA deletion fragments.图 6 突变株的 T-DNA 插入位点在甘蔗镰孢菌基因组 contig 上的位置示意图 Fig.6 Distribution of T-DNA in the contigs of F.sacchari genome 将获得的 39 条单一侧翼序列，在 NCBI 上进行同源序列搜索，并进行插入位点分析，结果显示有 19 个 T-DNA 插入位点位于相应基因的编码区，16 个 T-DNA 插入位点位于相应基因的启动子区域，2 个 T-DNA 插入位点位于终止子区，另有 2 个 T-DNA 插入位点位于基因间隔区（表 2）。甘蔗镰孢菌基因功能注释结果显示，插入位点的基因分别编码 22 个已知功能蛋白和 16 个未知功能蛋白，其中致病力减弱突变体的插入位点基因编码的蛋白功能可以分成 6 类，第一类为参与物质转运与代谢相关的蛋白（7 个），包括-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase）、中性氨基酸渗透酶（neutral amino acid permease）、寡聚高尔基复合体成分 4（oligomeric