锌指蛋白GhZFP基因调控棉花抗黄萎病功能分析.pdf

新 疆 农 业 大 学 学 报 2 0 2 3,4 6(4):2 6 92 7 6 J o u r n a l o f X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yD O I:1 0.2 0 0 8 8/j.c n k i.j x a u.2 0 2 3.0 4.0 0 2锌指蛋白G h Z F P基因调控棉花抗黄萎病功能分析张国帅1,卢国强1,张文祥1,代培红1,程贯富1,梁春燕1,雷建峰2,李 月1(1.新疆农业大学 生命科学学院,新疆极端环境生物生态适应与进化重点实验室,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2;2.新疆农业大学 农学院,教育部棉花工程研究中心农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2)摘 要:为探究陆地棉(G o s s y p i u m h i r s u t u m)C 2 H 2锌指蛋白家族基因G h Z F P在棉花抗黄萎病反应中的功能,本研究通过同源比对的方法筛选并克隆了一个响应棉花黄萎病菌(V e r t i c i l l i u m d a h l i a e)侵染的C 2 H 2锌指蛋白编码基因G h Z F P。利用泡根法将黄萎病菌侵染棉花,通过荧光定量技术(q R T-P C R)检测G h Z F P基因相对表达量的变化情况。利用烟草脆裂病毒(T R V)诱导的基因沉默技术(V I G S)对其功能进行验证。结果表明,黄萎病菌处理后,G h Z F P基因的相对表达量在2 4 h较对照组显著增高5 0%。利用V I G S技术抑制G h Z F P基因的表达后,棉花对黄萎病的易感性升高,剖杆检测的结果显示基因被沉默的棉株褐化程度更高。从荧光定量和基因沉默结果可以得出:G h Z F P基因响应黄萎病菌V 9 9 1株侵染,G h Z F P是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。关键词:棉花;G h Z F P基因;黄萎病;病毒诱导的基因沉默中图分类号:S 4 3 5.6 2 1 文献标识码:A F u n c t i o n a l A n a l y s i s o f Z i n c F i n g e r P r o t e i n G h Z F P G e n e R e g u l a t i n g V e r t i c i l l i u m w i l t i n C o t t o nZ HAN G G u o-s h u a i1,L U G u o-q i a n g1,Z HAN G W e n-x i a n g1,D A I P e i-h o n g1,CHE N G G u a n-f u1,L I AN G C h u n-y a n1,L E I J i a n-f e n g2,L I Y u e1(1.X i n j i a n g K e y L a b o r a t o r y f o r E c o l o g i c a l A d a p t a t i o n a n d E v o l u t i o n o f E x t r e m e E n v i r o n m e n t B i-o l o g y,C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 2,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r a l B i o t e c h n o l o g y,C o t t o n E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r,M i n i s t r y o f E d u-c a t i o n,C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e,X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 2,C h i n a)A b s t r a c t:T o e x p l o r e t h e f u n c t i o n o f t h e G o s s y p i u m h i r s u t u m C 2 H 2 z i n c f i n g e r p r o t e i n f a m i l y g e n e G h Z F P i n t h e r e s p o n s e t o V e r t i c i l l i u m w i l t r e s i s t a n c e i n c o t t o n.I n t h i s r e s e a r c h,a C 2 H 2 z i n c f i n g e r p r o-t e i n-e n c o d i n g g e n e,G h Z F P,w h i c h w o u l d r e s p o n d t o t h e i n f e s t a t i o n o f c o t t o n V e r t i c i l l i u m d a h l i a e,w a s s c r e e n e d a n d c l o n e d b y h o m o l o g o u s c o m p a r i s o n.C o t t o n w a s i n f e s t e d w i t h V.d a h l i a e u s i n g t h e s o a k-r o o t m e t h o d,a n d c h a n g e s i n t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f t h e G h Z F P g e n e w e r e d e t e c t e d b y f l u o r e s c e n c e q u a n t i f i-c a t i o n(q R T-P C R).T h e n i t s f u n c t i o n w a s v e r i f i e d u s i n g t o b a c c o r a t t l e v i r u s(T R V)v i r u s-i n d u c e d g e n e s i-l e n c i n g(V I G S).T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f G h Z F P g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y i n-c r e a s e d b y 5 0%a t 2 4 h a f t e r V.d a h l i a e t r e a t m e n t c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l g r o u p.T h e s u s c e p t i b i l i t y o f c o t t o n t o V e r t i l l i u m w i l t w a s e l e v a t e d a f t e r i n h i b i t i n g t h e e x p r e s s i o n o f t h e G h Z F P g e n e u s i n g t h e V I G S t e c h n i q u e,a n d t h e r e s u l t s o f t h e d i s s e c t e d s t e m a s s a y s h o w e d t h a t p l a n t s w i t h s i l e n c e d g e n e s w e r e b r o w n e d t o a g r e a t e r e x t e n t.F r o m t h e f l u o r e s c e n c e q u a n t i f i c a t i o n a n d v i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g r e s u l t s,i t c a n b e收稿日期:2 0 2 3-0 8-0 2基金项目:新疆维吾尔自治区“天山英才”培养计划“三农”骨干人才-农业技术推广人才项目(2 0 2 3 S N G G N T 0 6 3);新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2 0 2 3 D 0 1 E 0 3);国家自然科学基金项目(3 2 1 6 0 4 9 4);国家级大学生创新创业训练计划项目(2 0 2 2 1 0 7 5 8 0 0 1)通讯作者:李 月,E-m a i l:l i y u e 6 9 0 51 2 6.c o m新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 c o n c l u d e d t h a t t h e G h Z F P g e n e r e s p o n d s t o V.d a h l i a e V 9 9 1 i n f e s t a t i o n,a n d t h a t G h Z F P i s a p o s i t i v e r e g u l a t o r o f c o t t o ns d e f e n s e a g a i n s t V.d a h l i a e.K e y w o r d s:c o t t o n;G h Z F P g e n e;V e r t i c i l l i u m w i l t;v i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g 棉花(G o s s y p i u m h i r s u t u m)是我国最重要的经济作物之一1,棉花黄萎病是威胁棉花产量和质量的重要病害2,培育棉花抗黄萎病品种的首要目标是找到与棉花抗病相关的基因3。D o n g等4通过全基因组鉴定筛选出1 4个乙醇酸氧化酶(G O X)基因,其 中 的G h HA O X2-D基 因 可 能 通 过 与 其 他G O X基因的协同作用正调控棉花对黄萎病抗性;H a o等5通过病毒诱导的基因沉默技术(V I G S)分别沉默G h B ON1、G h B ON2、G h B ON3,发现增强了棉花对黄萎病的抗性,其中,G h B ON 1是通过与蛋白G h B I R 1和G h B AK 1相互作用来调控棉花对黄萎病的抗性;L i u等6通过过表达和酵母单杂发现,转录因子G h MY B6通过调控P R1基因进而增强棉花对黄萎病的抗性;X i o n g等7通过转录组测序,发现了一个与木质素生物合成的枢纽基因G h4C L3 0,并证明了该基因正调控棉花对黄萎病的抗性。有研究表明,B s r-d1可以通过调节H2O2的积累来调 控 水 稻(O r y z a s a t i v a L.)对 稻 瘟 病 的 抗性8。B s r-d1基因编码了一类锌指蛋白(Z F P s),锌指蛋白是一 类具有保 守结构域 的 大 型 蛋 白 家族9,能够协调锌离子并结合核酸,广泛存在于动物、植物、酵母和病毒中1 0。根据Z F P s结构中半胱氨酸和组氨酸残基的顺序和数量,可分为9个亚家族1 1。其中C 2 H 2锌指蛋白具有最经典的锌指结构1 2,研究表明C 2 H 2锌指蛋白在植物胁迫反应中起关 键 作 用1 3。Z h a n g等1 4研 究 发 现,过 表 达C 2 H 2锌指蛋白编码基因Z F P3 6可以提高超氧化物歧化酶的表达和活性,增强小麦(T r i t i c u m a e s t i-v u m L.)的抗逆性;S u n等1 5研究发现,C 2 H 2锌指蛋白家族成员T a Z F P 1通过A B A信号介导的光合作用、渗透溶质代谢和R O S平衡相关基因调控小麦的抗性。Y u等1 6研究发现,C 2 H 2锌指蛋白编码基因V v Z F P1 1促进了防御基因的表达,增强了葡萄(V i t i s v i n i f e r a L.)的抗病性;Z h a n g等1 7研究发现,C 2 H 2锌 指 蛋 白N b c Z F 1在 烟 草(N i c o t i a n a t a b a c u m L.)中可以通过介导一种诱导子S s C u t的反应来诱导植物免疫,当该基因被沉默时,烟草对烟草黑胫病等疾病的抗性降低;钟婵娟1 8研究发现,C 2 H 2锌指蛋白转录因子R p s Y u基因正调控植物的抗病性。C 2 H 2锌指蛋白是广泛存在于植物体内的一种转录因 子,在 植 物 抗 逆 的 过 程 中 发 挥 着 重 要 作用1 9。植物基因功能一般通过V I G S技术来验证。V I G S技 术 可 以 快 速 高 效 地 鉴 定 植 物 基 因 功能2 0,2 1,烟草脆裂病毒(T R V)是目前在V I G S中运用最多的载体病毒,T R V介导的V I G S技术已被广泛应用于棉花基因功能的研究中2 2。L i等2 3通过V I G S技术研究发现,F-b o x蛋白G h A C I F 1正调控棉花对黄萎病的抗性;W a n g等2 4通过V I G S技术研究发现,MA P K级联途径基因G h MPK2 0及其上、下游基因G h MKK4、G h WRKY4 0都增强棉花对枯萎病的抗性;胡晓倩等2 5通过V I G S技术研究发现,沉默G h R A R1基因会使棉花对黄萎病的敏感性增强。本研究利用同源克隆的方法获得一个棉花中的C 2 H 2蛋白G h Z F P,通过研究G h Z F P基因在棉花抗黄萎病过程中的表达模式以及G h Z F P基因的 沉 默 对 棉 花 抗 黄 萎 病 能 力 的 影 响,来 揭 示G h Z F P基因在棉花抗黄萎病过程中的功能特性,为进一步探索棉花抗病机制,培育抗黄萎病棉花品种提供理论基础,并为黄萎病的防治提供新的思路和策略。1 材料与方法1.1 材 料供试棉花品种为新陆早2 7号,棉花黄萎病病原菌V 9 9 1株、T R V病毒载体及构建完成的T R VG h C L A 1、T R VR NA 2和 T R VR NA 1农杆菌均由新疆农业大学生命科学学院作物功能基因组学与分子改 良 实 验 室 保 存;大 肠 杆 菌DH 5、农 杆 菌GV 3 1 0 1购于上海唯地生物技术有限公司;多糖多酚植物总R NA提取试剂盒购于杭州博日科技公司;各种限制性内切酶购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;高保真聚合酶T r a n s S t a r K D P l u s、无缝克隆 试 剂 盒p E A S Y-U n i S e a m l e s s C l o n i n g a n d A s s e m b l y K i t、荧光定量试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;P C R 所用引物的合成及D NA的测序均由新疆有康生物科技有限公司完成。1.2 方 法1.2.1 棉花种植参考代培红等2 6的方法,挑选籽粒饱满的种子,无菌水清洗并于3 7 温室中浸泡2 43 6 h,取072 第4期张国帅,等:锌指蛋白G h Z F P基因调控棉花抗黄萎病功能分析露白的种子种植于装有经高压灭菌的蛭石和黑土(12)的花盆中,每个花盆种植3株棉花,种子生长条件为2 8 室内培养,光照周期为光照1 6 h,黑暗8 h。1.2.2 接菌处理及取样参考徐诗佳等2 7的方法,对黄萎病原菌V 9 9 1株进行活化,利用察氏培养基对黄萎病菌进行培养,培养条件为2 8,2 0 0 r/m i n,7 d后将病原菌用纱布过滤,利用光学显微镜对孢子浓度进行计数,最后利用蒸馏水将孢子的浓度调整至21 06个/m L。利用泡根法处理棉花根,将棉花根部浸泡在蒸馏水中5 m i n后开始取样,取处理0、4、8、1 2、2 4、4 8 h根部组织,共1 8株,作为C K组;另取生长条件完全 一 致 的1 8株 棉 苗,用V 9 9 1株 孢 子 液 浸 泡5 m i n后开始取样,取处理0、4、8、1 2、2 4、4 8 h根部组织,作为V 9 9 1组。采取的根部组织立即放到液氮中,每个时间点均取3个生物学重复。1.2.3 棉花中R NA的提取及c D NA的合成参考玛迪娜木拉提等2 8的方法,用多糖多酚植物总R NA提取试剂盒提取棉花叶片和根部组织R NA,用1.0%的琼脂糖凝胶检验,用反转录试剂盒合成c D NA。1.2.4 G h Z F P基因克隆通过b l a s t p方法在N C B I(h t t p s:/www.n c-b i.n l m.g o v/)数据库中获得G h Z F P基因登录号:XM_0 1 6 8 5 6 5 4 1.2。参考周垚均等2 9的方法,以新陆早2 7号棉花叶片c D NA为模版,参照G h Z F P基因C D S序列(6 8 1 b p)设计克隆引物:G h Z F P-F:5 -AT G G C T C T T GAAA C G T T G-3 和G h Z F P-R:5 -T T AAG C G T C G G T AAA C G GA-3,依 照T r a n s-S t a r K D P l u s说明书扩增目的片段。1.2.5 G h Z F P基因在黄萎病侵染前后的表达模式分析通过P r i m e r-B L A S T方法在N C B I数据库中对基 因G h Z F P分 析,以 该 基 因 的 完 整 序 列(1 9 3 2 b p)设 计 荧 光 定 量 引 物:G h Z F P-F:5 -C A C T C AA C C AAT G GA C GA C G-3 和G h Z F P-R:5 -T T C AAT G G G GAG T T G G G G T T-3,以 陆 地 棉泛素基因G h U B Q7(D Q 1 1 6 4 4 1)为内参基因设计引物:G h U B Q 7-F:5 -GAAG G C AT T C C A C C T GA C-C AA C-3 和G h U B Q 7-R:5 -C T T GA C C T T C T-T C T T C T T G T G C T T G-3。每个样本 均取3个 生物学重复,每个操作均进行3个技术重复。1.2.6 G h Z F P基因的V I G S载体构建使用S GN-V I G S网站设计能够抑制G h Z F P基因C D S区(6 8 1 b p)的特异性序列(3 0 0 b p),根据序列信息设计带有载体同源序列的特异性引物:G h Z F P-F:5 -G T G A G T A A G G T T A C CG A A T T CC A C-T G C T C C A C C A T G A T G A T A C A-3 和G h Z F P-R:5 -G A G A C G C G T G A G C T C G G T A C CA A G G C T T G T C C-T G A A G A A A A C G-3(下划线为E c o R和K p n酶切位点,下划线之前为载体同源序列),以新陆早2 7号棉花叶片的c D NA为模板,用P C R技术扩增出相应的 目 标 片 段3 0。将 目 的 片 段 与 线 性 化 的p T R V 2病毒载体(E c o R和K p n双酶切)用无缝克隆连接酶连接,参照张晓红等3 1的方法将重组质粒转化至大肠杆菌感受态DH 5 中。挑取经酶切鉴定正确的单克隆送新疆有康生物技术有限公司测序,将测序正确的质粒参考胡子曜等3 2方法转化至农杆 菌 感 受 态 细 胞GV 3 1 0 1中。挑 取 单 克 隆 用E c o R和K p n双酶切鉴定,鉴定正确的菌液在-4 0 保存。1.2.7 农杆菌介导的V I G S方法为获得阴性对照棉株T R V0 0、沉默G h C L A1(K J 1 2 3 6 4 7)的棉株T R VG h C L A 1(G h C L A1基因与叶绿体的发育有关,沉默该基因会使叶片出现白化现象,该现象作为V I G S体系是否被成功应用的标 志 之 一3 3)及 沉 默G h Z F P的 棉 株T R VG h Z F P。将构建好的农杆菌T R VG h Z F P、T R VG h C L A 1、T R VR NA 2和T R VR NA 1参考赵曾强等3 4的方法进行菌液活化、重悬。将T R VG h Z F P、T R VG h C L A 1、T R VR NA 2的重悬菌液分别与T R VR NA 1重悬菌液等体积混合,混合后的菌液在黑暗条件下放置3 h,参考李秀青等3 5的方法将重悬菌液注射至两叶一心时期的棉花。将注射含T R VR NA 2菌液的5 0株棉花命名为T R V0 0组,将注射含T R VG h C L A 1菌液的9株 棉 花 命 名 为T R VG h C L A 1组,将 注 射 含T R VG h Z F P菌液的5 0株棉 花命名为T R VG h Z F P组。注射T R VG h C L A 1菌液的棉株出现白化 后,利 用q R T-P C R技 术 对T R VG h C L A 1组、T R VG h Z F P组和T R V0 0组棉株的根部和叶部基因的相对表达量进行检测,引物序列为:G h-C L A 1-F:5 -G C C C T T T G T G C AT C T T C-3 和G h-C L A 1-R:5 -C T C T AG G-G G C AT T GAAG-3,基因在T R VG h Z F P组或T R VG h C L A 1组棉株中的相对表达量显著低于T R V0 0组则认为基因已被沉默。每个样本均取3株棉花进行3个生物学重复,每个操作均进行3个技术重复。172新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 1.2.8 棉花的接种处理与抗性检测选取基因被沉默且生长状况一致的T R V0 0组和T R VG h Z F P组棉株5 0株,依照1.2.2的方法同时接种黄萎 病菌V 9 9 1株,在 接种黄萎病 菌2 0 d后,拍照记录不同棉株的表型,采用叶片分级法统计病情指数3 6,同时对不同棉株进行剖杆检测3 7。每个样本均取5 0株棉花进行5 0个生物学重复,每个操作均进行3个技术重复。2 结果与分析2.1 G h Z F P基因克隆以新陆早2 7号棉花c D NA为模板进行P C R扩增,得到的条带大小与预期6 8 1 b p相符,经新疆有康生物科技有限公司测序表明成功克隆出G h Z F P基因(图1)。M1750 bp500 bpM.D L 2 0 0 0 D NA M a r k e r;1.G h Z F P基因C D S区扩增产物图 1 G h Z F P基因的克隆F i g.1 C l o n i n g o f G h Z F P g e n e2.2 G h Z F P基因在黄萎病菌侵染前后的表达模式分析采用q R T-P C R技术分析G h Z F P基因在黄萎病菌侵染前后不同时间点的相对表达量。由图2知,在棉花黄萎病菌V 9 9 1株的诱导下,同一时间点的G h Z F P基因表达量与C K组相比,在4、1 2、2 4 h表达量差异显著,以2 4 h时表达量差异最大,较C K组增高约5 0%,表明该基因在棉花响应黄萎病胁迫的过程中发挥着一定的调控作用。2.3 G h Z F P基因的V I G S载体构建克隆的靶序列长度在2 5 05 0 0 b p,与预期结果3 0 0 b p一致(图3)。T R VG h Z F P重组质粒用双酶切鉴定,出现约8 0 0 0 b p和3 0 0 b p的两条带,与预期结果相符,经新疆有康生物科技有限公司测序表明V I G S载体构建成功(图4)。0481224481.51.00.50.0?（h）CK?V991?aaabaaababaa同一时间点两组间不同小写字母表示差异显著(P0.0 5)图2 黄萎病菌侵染下G h Z F P基因的表达模式分析F i g.2 A n a l y s i s o f t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f G h Z F P g e n e u n d e r t h e t r e a t m e n t o f V e r t i c i l l i u m d a h l i a eM1500 bp250 bpM.D L 2 0 0 0 D NA M a r k e r;1.G h Z F P基因V I G S目标片段扩增产物图3 G h Z F P基因的V I G S目标片段克隆F i g.3 C l o n i n g o f t h e V I G S t a r g e t f r a g m e n t o f G h Z F PM18000 bp500 bp250 bpM.D L 8 0 0 0 D NA M a r k e r;1.T R VG h Z F P载体酶切产物图4 G h Z F P基因的V I G S载体酶切鉴定F i g.4 C h a r a c t e r i z a t i o n o f G h Z F P b y V I G S v e c t o r d i g e s t i o n272 第4期张国帅,等:锌指蛋白G h Z F P基因调控棉花抗黄萎病功能分析2.4 G h Z F P基因沉默棉株的黄萎病抗性鉴定利用V I G S技 术 沉 默G h C L A1和 目 的 基 因G h Z F P 1 0 d后,T R VG h C L A 1棉株的真叶出现白化现象(图5);用q R T-P C R技术检测G h C L A1和 目 的 基 因G h Z F P在 根 和 叶 的 表 达 量,发 现G h C L A1和G h Z F P的表达量明显低于对照组,表明成功获得G h Z F P基因沉默棉株(图6、图7)。TRV 00?TRV GhCLA1?图5 沉默G h C L A1棉株的表型F i g.5 T h e p h e n o t y p e o f s i l e n c e d G h C L A1?1.51.00.50.0?TRV 00?TRV GhCLA1?abab同一组织不同小写字母表示差异显著(P0.0 5)图6 G h C L A1基因的沉默效率检测F i g.6 S i l e n c i n g e f f i c i e n c y o f G h C L A1选取 生 长 状 况 一 致 的T R VG h Z F P组 和T R V0 0组棉株,使用经察氏培养基活化、培养71 0 d的病原菌V 9 9 1株进行侵染,2 0 d后统计病情指数并进行剖杆检测。结果表明,与T R V0 0组棉株相比,T R VG h Z F P组棉花叶片黄化的症状更明显(图8);进一步统计棉株的病情指数,结果显示T R VG h Z F P组 棉 株 病 情 指 数 显 著 高 于T R V0 0组棉株,表明G h Z F P基因正向调控棉花对黄萎病的抗性(图9)。为进一步对G h Z F P沉默棉株的黄萎病抗性进行分析,对上述棉株进行纵剖茎杆(图1 0),发现T R VG h Z F P组棉株褐变程度较T R V0 0组褐变程度更高,与病情指数结果相一致。?1.51.00.50.0?TRV 00?TRV GhZFP?abab同一组织不同小写字母表示差异显著(P0.0 5)图7 G h Z F P基因的沉默效率检测F i g.7 S i l e n c i n g e f f i c i e n c y o f G h Z F PTRV 00?TRV GhZFP?图8 G h Z F P基因沉默后棉株的表型F i g.8 P h e n o t y p e a n a l y s i s o f c o t t o n a f t e r G h Z F P g e n e s i l e n-c i n gTRV 00?TRV GhZFP?50403020100?ab不同小写字母表示差异显著(P0.0 5)图9 G h Z F P基因沉默后棉株的病情指数统计F i g.9 D i s e a s e i n d e x s t a t i s t i c s o f c o t t o n a f t e r G h Z F P g e n e s i-l e n c i n g372新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 TRV 00?TRV GhZFP?图1 0 G h Z F P基因沉默后棉株的剖杆检测F i g.1 0 S t e m c u t t i n g p h e n o t y p e o f c o t t o n a f t e r G h Z F P g e n e s i l e n c i n g3 讨 论C 2 H 2锌指蛋白作为植物最大的转录因子蛋白家族之一,研究发现越来越多的C 2 H 2锌指蛋白参与植物对抗生物胁迫的反应。L i u等3 8研究发现,芒果(M a n g i f e r a i n d i c a)C 2 H 2锌指蛋白转录因子的编码基因M i V O Z2在抵抗盘长孢状刺盘孢菌(C.g l o e o s p o r i o i d e s)和 柑 橘(C i t r u s r e t i c u l a t a B l a n c o)黄单胞菌芒果致病变种(X.c i t r i p v.m a n-g i f e r a e i n d i c a e)感染的免疫反应中是一个正调控因子;K a u r等3 9研究发现,油菜(B r a s s i c a n a p u s)在感染芸薹根肿菌(P.b r a s s i c a e)的情况下,C 2 H 2锌指蛋白基因B n a Z F2 0 2的表达量在1 4 d增加了5.1 6倍,表明C 2 H 2锌指蛋白在油菜中响应生物胁迫;M a d i t a等4 0研究发现,C 2 H 2锌指蛋白可以调节活性氧的积累,从而促进植物对病菌的抗性;S h i等4 1研究发现,在拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中C 2 H 2锌指蛋白A t Z AT 6可以正向调节水杨酸和活性氧(过氧化氢和超氧化物)的积累,并通过激活水杨酸相关基因和C B F基因的表达水平,正调控拟南芥 对 丁 香 假 单 胞 杆 菌(P s e u d o m o n a s s y r i n g a e p v.t o m a t o D C 3 0 0 0)的 抗 性;刘 松4 2研 究 发 现,C 2 H 2锌指蛋白基因G h I DD5 7通过影响过氧化氢、S A信号途径和木质素积累,负调控棉花黄萎病抗性;周垚均4 3研究发现,G h B s r-d1L1和G h B s r-k1编码的C 2 H 2锌指蛋白分别负向和正向调控棉花的黄萎病抗性;Z h a o等4 4研究发现,棉花受黄萎病胁迫后,G h R DU F4D基因表达量增加,拟南芥中过表达该基因会增加对黄萎病的抗性。本研究通过同源克隆的方法扩增出棉花中的同源蛋白G h Z F P,利用q R T-P C R和V I G S技术证明G h Z F P基因在棉花的抗黄萎病反应中起着正调控作用。尽管本研究提供了G h Z F P基因在棉花抵抗黄萎病侵袭方面的初步认识,但是理解G h Z F P基因如何调控棉花对黄萎病的抗性仍需要进一步的研究和验证。4 结 论本研究从陆地棉同源比对并克隆了一个C 2 H 2锌指蛋白家族基因G h Z F P并构建了V I G S载体,通过基因表达量检测和沉默棉株抗性检测,证明了G h Z F P基因正调控棉花抗黄萎病。参考文献:1 李 名 江,雷 建 峰,祖 丽 皮 耶 托 合 尼 亚 孜,等.棉 花G h I QM1基因克隆及抗黄萎病功能分析J.作物学报,2 0 2 2,4 8(9):2 2 6 5-2 2 7 3.2 王艳情,郑杰,许艳超,等.棉花HD A C基因家族鉴定及其在黄萎病菌侵染下的表达分 析 J.棉花 学报,2 0 2 1,3 3(6):4 6 9-4 8 1.3 刘芳,徐梦贝,王巧玲,等.棉花纤维优势表达基因G h-S L D1启动子的克隆和功能分析J.中国农业科学,2 0 2 3,5 6(1 9):3 7 1 2-3 7 2 2.4 D o n g L J,Z h a n g X,W a n g M,e t a l.G l y c o l a t e o x i d a s e g e n e f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n a n d f u n c t i o n a l a n a l y s e s i n c o t t o n r e s i s t a n c e t o V e r t i c i l l i u m w i l tJ.G e n o m e,2 0 2 3,6 6(1 2):3 0 5-3 1 8.5 H a o X Y,G a o S Q,L u o T T,e t a l.C a2+r e s p o n s i v e p h o s p h o l i p i d-b i n d i n g B ONZ A I g e n e s c o n f e r a n o v e l r o l e f o r c o t t o n r e s i s t a n c e t o V e r t i c i l l i u m w i l tJ.P l a n t m o l e c u l a r b i o l o g y,2 0 2 3,1 1 2(4-5):2 4 7-2 5 9.6 L i u T L,C h e n T Z,K a n J L,e t a l.T h e G h MY B3 6 t r a n s c r i p t i o n f a c t o r c o n f e r s r e s i s t a n c e t o b i o t i c a n d a b i o t i c s t r e s s b y e n h a n c i n g P R1 g e n e e x p r e s s i o n i n p l a n t sJ.P l a n t b i o t e c h n o l o g y j o u r n a l,2 0 2 1,2 0(4):7 2 2-7 3 5.7 X i o n g X P,S u n S C,Z h u Q H,e t a l.T h e c o t t o n l i g n i n b i o s y n t h e t i c g e n e G h4C L3 0 r e