山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响.pdf

Vol.50 No.1Journal of Southwest Minzu University(Natural Science Edition)第50 卷第1期Jan.20242024年1月西南民族大自然科学版）doi:10.11920/xnmdzk.2024.01.004山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响李志斌1,2,3,许晴1,2,3,李瑞文4,5,王永1,2 3，李艳艳1-2.3，朱江江1,2,3，王友利1,2.3，林亚秋1,2 3（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都6 10 0 41；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川成都6 10 0 41;3.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川成都6 10 0 41；4.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院，四川成都610041；5.成都市妇女儿童中心医院，四川成都610041)摘要：旨在克隆山羊KLF8基因序列，阐明组织表达特性，并初步揭示过表达KLF8后对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的潜在影响.利用逆转录PCR（r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n-p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n，RT-PCR）方法克隆获得山羊KLF8基因启动子和CDS区序列（coding sequence，CD S），并运用生物信息学方法分析其序列特征；利用基因重组方法构建山羊pcDNA3.1-KLF8真核过表达载体，利用CCK-8、Ed U 检测方法和实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR,qPCR）明确KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.结果显示，获得包含2 个潜在的核心启动子、多个TATA-Box和GATA-Box的山羊KLF8基因启动子2 0 0 1bp和包含KLF家族典型的锌指结构域、发挥转录抑制/激活基序的CDS序列10 6 2bp.KLF8高表达于山羊脾脏组织，极显著高于其他组织(P0.01），中度表达于肾脏和肺脏组织，低表达于背最长肌和股二头肌.过表达KLF8抑制山羊肌内前体脂肪细胞增殖，并且这种作用可能是通过上调CCND1的表达来实现的.结果为明确山羊KLF8基因生物学特征及对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响提供重要的数据支撑。关键词：山羊；KLF8；序列特征；肌内前体脂肪细胞；细胞增殖中图分类号：S827文献标志码：A文章编号：2 0 95-42 7 1(2 0 2 4)0 1-0 0 2 8-11Biological characteristics of KLF8 and its effect onintramuscular preadipocyte proliferation in goatsLI Zhi-bin 2,3,3,XU Qing.l.2.3,3,LI Rui-wen4.5,WANG Yong1,2,3,LI Yan-yan.2.3，ZHU Jiang-jiangng.2.,WANG You-lil-2,LIN Ya-qul-2.(1.School of Animal and Veterinary Sciences,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,China;2.Key Laboratoryof Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization,Ministry of Education,Chengdu 610041,China;3.Sichuan Provincial Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization,Chengdu 610041,China;4.Women and Childrens Hospital Affiliated to School of Medicine of University of Electronic Science andTechnology,Chengdu 610041,China;5.Chengdu Women and Childrens Central Hospital,Chengdu 610041,China)Abstract:This experiment aimed to clone goat KLF8 gene sequence,elucidate its tissue expression characteristics,and revealthe potential effect of KLF8 on goat intramuscular preadipocytes proliferation through overexpression technique.The promoterand CDS region sequence of goat KLF8 gene was cloned by RT-PCR technique,along with bioinformatics analysis ofsequence.pcDNA3.1-KLF8 overexpression vector was constructed by gene recombination method.CCK-8,EdU and real-timequantitative PCR(qPCR)were used to clarify the expression pattern of KLF8 in the proliferation of goat intramuscular preadipo-cytes and its effect on proliferation.The results showed that the obtained goat KLF8 gene promoter sequence was 2 001bp in收稿日期：2 0 2 3-0 5-0 6通信作者：林亚秋（197 6-），女，教授，博士，研究方向：动物遗传育种与繁殖.E-mail：l i n y q 1999 16 3.c o m基金项目：国家自然科学基金（32 0 7 2 7 2 3,3190 2 154）；四川省应用基础研究计划重点项目（2 0 2 2 JDTD0030）；西南民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（2 0 2 10 57）29期第李志斌，羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响length,containing two potential core promoters,multiple TATA-boxes and GATA-boxes,and 1 062 bp of CDS sequence contai-ning typical zinc-finger domain of KLF family and transcriptional repressor/activation motifs.Tissue expression profile assayfound that KLF8 was expressed at a high level in spleen tissue and significantly higher than any other tissues(P 0.01),at amedium level in kidney and lung tissue,at a low level in longissimus dorsi muscle and biceps femoris muscle.Overexpression ofgoat KLF8 inhibited the proliferation of intramuscular preadipocytes,and this regulation may be achieved mainly through up-reg-ulating the expression of CCND1.The results provided important data support to clarify the biological characteristics of goatKLF8 gene and its effect mechanism on the proliferation of goat intramuscular preadipocytes.Keywords:goat;KLF8;sequence feature;intramuscular preadipocytes;cell proliferation近年来,因居民膳食结构的改变、肉类价格的变动和居民消费习惯的变化等综合作用，羊肉凭借其高蛋白低脂肪的特点备受青睐，我国羊肉消费量持续升高.这对畜牧工作者在羊肉品质培育方向提出了新要求，即在提高产量的同时也要提高肉质品质.肌内脂肪含量是影响畜禽肉质品质的重要因素之一，并以“大理石花纹”呈现.脂质沉积直接影响肌内脂肪含量，然而，产肉动物的脂肪沉积涉及到一系列的生物学过程,如前体脂肪细胞的分化和增殖,而这些生物学过程受到多种转录因子的调控2-3.其中细胞增殖是细胞的一项重要生理过程，是个体生长、发育和遗传的基础，涉及到许多分子、通路等的相互作用.筛选调控脂肪细胞增殖的关键因子对提高肌内脂肪含量和改良羊肉品质具有重要的意义Kruppel样转录因子(Kruppel-likefactor,KLF)家族属于转录调节因子家族，在细胞、组织和全身水平的代谢控制中起着多种重要作用,并控制一系列的生物过程，例如能量稳态、衰老、细胞增殖、分化和调亡等生物过程46 .KLF8是KLF家族成员之一，又被称为BKLF3或ZNF74，其转录受粘着斑激酶（focaladhesionkinase,FAK）、K L F1和KLF3的调控,转录后翻译的主要修饰方式为泛素化7 .KLF8在各组织器官中广泛表达，因此具有多种生物学功能，研究发现KLF8通过调控细胞增殖、迁移、浸润等过程在癌症、肿瘤和心血管疾病中发挥重要的作用8-9,然而最显著的功能是调控各类癌细胞,KLF8参与人骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，人乳腺瘤细胞的侵袭和转移10-1.此外,许多癌细胞经历了过度的内源性脂肪酸生物合成，脂质过度代谢为癌细胞的增殖和迁移提供了物质基础12 .山羊是重要的经济家畜，就其肉用性能而言，脂肪组织的含量对肉质品质至关重要.脂肪组织的生成过程主要包括脂肪细胞数量的增多和甘油三酯的积累而导致的脂肪细胞的体积增大13.本实验室前期发现KLF8调控山羊肌内前体脂肪细胞分化,然而，KLF8是否参与调控山羊肌内前体脂肪细胞增殖并影响脂肪沉积而最终调控山羊肉质品质尚不清楚.因此,为探究KLF8在山羊肌内前体脂肪细胞增殖中的调控作用,本研究以简州大耳羊为研究对象，克隆KLF8的启动子区域和CDS区域；然后对其序列进行生物信息学分析；利用qPCR技术检测其在山羊各组织中的表达情况；利用脂质体转染法将KLF8真核表达载体转人山羊肌内前体脂肪细胞使其过表达，利用CCK-8及EdU方法并结合qPCR技术检测细胞增殖相关基因的表达变化,最终明确KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.1材料与方法1.1试验动物及组织样品采集试验动物为6 只2 周岁简州大耳公羊（四川天地羊生物工程有限责任公司），试验动物禁食2 4h后于清晨屠宰，屠宰后迅速采集心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、臂三头肌和股二头肌，DEPC水清洗后将各个组织样品用锡箔纸包裹并放人冻存管，置于液氮中保存备用.山羊肌内前体脂肪细胞由实验室前期试验分离获得。1.2主要试剂TRIzol 试剂和 TB Green TM Premix Ex Taq TM II购自TaKaRa公司；限制性内切酶（KpnI、No t I）、Re v e r-tAid First Stand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司;Cell CountingKit-8、Ed U 试剂盒购自上海碧云天公司;DMEM/F12培养基、胰蛋白酶和双抗购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gemini公司；pMD-19T载体、30第50 卷西南民族大自然科学版）DH5感受态细胞、DNA纯化回收试剂盒、pClone007购自擎科公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、2 GC-richPCRMasterMix购自Tiangen公司；Opti-MEM、L i p o f e c t a mi n e T M 30 0 0 T r a n s f e c t i o n Re a g e n t购自Invitrogen公司.1.3山羊KLF8启动子和CDS区克隆及序列分析1.3.1KLF8启动子克隆取适量山羊臂三头肌放入研钵中，加入液氮进行研磨，用适量PBS重悬样品，超声波短暂破碎，制备成细胞悬液,按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取基因组DNA.根据NCBI上提供KLF8基因组序列（NW_017189516.1:25051547-25053547），利用SnapGene设计KLF8promoter克隆引物（表1）.PCR反应体系为2 5L,将PCR产物在1%凝胶电泳中检测后使用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，将纯化的目的片段连接于pClone007载体,转化至DH5感受态细胞，37 过夜培养，挑取阳性菌落进行PCR鉴定，最后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序.表1克隆引物序列信息Table 1 The sequences information of clone primers引物名称序列信息(5-3)退火温度()克隆区域KLF8-PSGAAGCCTTGGGACTCAGCAG68PromoterKLF8-PAGGAAAAGAATCAAGGGAAAGACAKLF8-KSCACCTCCATTCCTACCCTGATC58CDSKLF8-KACCAGTCAGCTCTTCTAGTG3.1-8SCGGGGTACCATGGATGAACTCATAAACAACT60KLF83.1-8AATAAGAATGCGGCCGCTTACACGGTGTCATGGCGC(Note:S:sense primer;A:antisense primer;KLF8-PS/A:KLF8 promoter cloning;KLF8-KS/A:KLF8 CDS cloning;3.1-8S/A:KLF8 subclone)1.3.2KLF8CDS区克隆用TRizol法提取分化Oh的山羊肌内前体脂肪细胞中的RNA，随后取1g总RNA参照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录.根据NCBI上提供的KLF8预测序列（XM027534127.1），利用SnapGene设计KLF8克隆引物（表1），以山羊肌内前体脂肪细胞cDNA为模板进行RT-PCR扩增.通过1%凝胶电泳筛选目的条带，经DNA纯化回收试剂盒纯化后将目的片段连接至pMD-19T载体（16 连接2 h），转化及Amp抗性筛选后进行鉴定，最后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，将测序正确的菌液提取质粒并保存，质粒命名为pMD-19T-KLF8.1.3.3序列分析对测序获得的山羊KLF8基因启动子和CDS区片段进行生物信息学分析，分析内容及工具见表2.1.4山羊KLF8组织表达特性根据克隆得到的山羊KLF8CDS区序列设计定量引物，以UXT基因作为内参基因14（表3），以山羊各组织cDNA为模板，构建KLF8组织表达谱，qPCR反应体系:TB Green TMPremixEx TaqTMI10L,10molL上、下游引物各1L,组织cDNA1L,ddH,07L,每组设置3个重复.qPCR反应条件：95预变性3min;95变性30 s,Tm退火15s，72延伸2 min，共38 个循环.表2 分析内容及相应分析工具Table 2Analytical contenets and the corresponding ananlysis tools在线工具分析内容Online toolsAnalyticalcontentsBDGPPrediction of core promoter region in promoterPrediction of transcription factor binding sites inAlibaba2.1promotersEMBOSS CpgplotPromoter CpG island predictionPrediction of promoter TATA Box,CAAT Box andNARODNABankGATA BoxAmino acid translation and comparison of KLF8 cD-BioEdit 7.0.5NAsequenceNCBIAnalysis of conserved domain of KLF8 proteinSOPMAProtein secondary structure predictionSwissModelPrediction of protein tertiary structureProSA-webTheoretical model of KLF8 proteinSTRINGAnalysis of proteininteraction1.5山羊KLF8过表达载体构建根据KLF8基因CDS区10 6 2 bp的序列和pcD-NA-3.1载体，设计亚克隆引物3.1-8 S/A（表1）并选期31第李志斌KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响择KpnI和NotI作为酶切位点.利用Kpnl和NotI对pcDNA-3.1载体和亚克隆获得的完整山羊KLF8基因CDS区序列进行双酶切.双酶切体系：1g目的片段(或1 g pcDNA-3.1),NotI和 KpnI各1 L,10Q.cut Buffer 2L,ddH,0补充至2 0 L;37金属浴1h.之后使用DNA产物纯化试剂盒纯化酶反应物，将纯化产物利用T4连接酶16 过夜连接，连接产物转化至DH5感受态细胞,37 过夜培养.将阳性菌落扩大培养并提取质粒，对重组质粒进行双酶切鉴定及测序，质粒命名为pcDNA-KLF8.1.6山羊肌内前体脂肪细胞培养及pcDNA-KLF8转染复苏培养本实验室保存的山羊肌内前体脂肪细胞，待传至F3代的细胞汇合度达到8 0%时，将细胞接种至12 孔板中，每孔细胞密度达到8 0%时进行转染.pcDNA-KLF8和pcDNA-3.1采用脂质体转染法转入细胞，参考Lipofectamine3000转染试剂盒说明书进行转染.转染6 h后更换为含10%FBS的培养基继续培养细胞,48 h后利用TRizol收集细胞,提取细胞RNA并反转录,将产物置于-2 0 冰箱保存.1.7CCK-8检测及EdU染色将处于对数生长期的肌内前体脂肪细胞均匀接种到96 孔板中培养.当细胞培养至融合度为7 0%时，分别转染pcDNA-KLF8和pcDNA-3.1,转染48 h后，使用Cell CountingKit-8 cell Counting Kit 检测细胞活力，通过酶标仪测定490 nm波长处的吸光度值，分析细胞增殖情况.利用EdUCellProliferationDetectionKit对细胞进行固定染色，利用倒置荧光显微镜观察拍照.1.8qPCR检测过表达效率及脂肪细胞增殖相关基因的表达水平以“1.6”中得到的cDNA作为模板，,稀释5倍后，利用qPCR检测山羊KLF8过表达效率以及脂肪细胞增殖相关基因的mRNA水平表达量，以UXT基因作为内参基因，每个样本设置3个重复.扩增反应体系与程序同“1.4”.引物序列信息见表3.1.9数据统计与分析所有试验数据以“MeanSEM”表示，并采用2-AACt法对qPCR数据进行分析，使用SPSS20.0软件中One-wayANOVA方法分析检测数据间的差异显著性,Duncan法对组织表达数据进行多重比较,P0.05或P 2 0 0 bp、CG 含量 50%和Obs/Exp值 0.6,经过EMBOSSCpgplot在线程序预测发现（图3），在山羊KLF8启动子区域不存在CpG岛.利用BDGP程序预测山羊KLF8核心启动子区，结果表明（图4A），在KLF8起始密码子上游-6 7 5-6 2 5（Score=0.99）和-543 493（Score=0.93）区域存在2 个核心启动子区.通过Alibaba2.1预测转录因子结合位点发现，在第1个核心启动子区存在1个c-Ets-1识别位点和2 个NF-1识别位点，在第2 个核心启动子区存在2 个C/EBP识别位点、1个Odd识别位点、1个TBP识别位点和1个EIf-1识别位点（图4B）.利用NARODNABank预测发现，KLF8启动子区域存在4个TATA-Box，15个CAAT-Box和2 2 个GATA-Box(图4C).Observedvs Expecteddx3/sqo500100015002000BasenumberPercentageTTmO500100015002000Base numberPutativeIslands018090t00000500100015002000BaseNumber图3山羊KLF8启动子中CpG岛预测结果Fig.3Prediction results of CpG island in the promoter of goat KLF8ABCore promoter1ATGKLF8-675GAGATGCTGCCTGCCAGGCTTAAAG-651KLF8PromoterC-Ets-1NF-1-650TCCTAAAAAGTCCTGCCAAATAGT-625NF-1CorePromoter1Core promoter2675625-543GACATTGTAGATCAAATATACTTTG-519Core Promoter2CEBPaOdd543494-518ATTTTTTAAAAAAGAGGAAAAATT-494CEBPaTBPCEIf-1CAAT-BoxTATA-BOXGATA-Box图4山羊KLF8启动子序列分析结果Fig.4Analysis results of the KLF8 promoter sequence in goat.A.KLF8启动子上核心启动子区预测；B.核心启动子区中的潜在转录因子结合位点；C.KLF8启动子中存在的启动转录元件34第50 卷西南民族大自然科学版2.3山羊KLF8CDS序列分析对山羊KLF8氨基酸序列进行分析发现，该蛋白包含3个典型的锌指结构，分别位于2 7 0 2 90,30 0 320和330 350 之间（图5A），并且存在识别C末端结合蛋白（C-terminal binding protein,CtBP）的序列和多个核定位信号（图2）；在山羊KLF8基因序列第2 9位存在碱基突变（T29C）,进而导致其编码的氨基酸发生改变,由缬氨酸（V）变为丙氨酸（A）（图5B）；二级结构预测表明，推导的KLF8蛋白包含49.2 9%的无规卷曲、2 0.96%的延伸链、2 6.45%的-螺旋和8.22%的-转角（图5C）；三级结构预测发现，KLF8蛋白中存在3个-螺旋,C末端的Helice-3大致为Helice-2和N末端的Helice-1的垂直轴（图5D），但是评估理论模型的准确性和可靠性至关重要，因此对其三级结构模型评估发现，此模型获得的z-score值为-3.81,z-score值在天然蛋白质结构（通过NMR光谱法或X射线晶体学实验技术确定）范围内（图5E）；使用STRING对KLF8进行蛋白互作分析并构建蛋白互作网，结果显示，KLF8可能与TCF7L1、CT BP2、DDX3X、SA RT 1、U BE2 A、RNF7 和PPP2R3A等蛋白存在互作关系（图5F）.270280290300310320330340350CDFAGCSKVYTKSSHLKAHRRIHTGEKPYKCTSDGCSSKEARSDELTRHERKHTGIKPERCTDCORSESRSDHLSLHRRRHC2HzZnFIngerC2HzZnFIngerC2H2ZnFInSerPutativenuclelcacld bindingsites10203040506070BXM018043637.1ATGGATGAACTCATAAACAACTGGGAGGTCCAACTTAATTCAGAAGGTGGCTCAATGCATATGTTCAAACDE工E工S EGGSRThis studyATGGATGAACTCATAAACAACTGGGAGGCCCAACTTAATTCAGAAGGTGGCTCAATGCATATGTTCAAACDE工E工SEGGSK8090100110120130140XM018043637.1AGGTCACTGGCCCTGTTTCAAATTAGAGATTCCCTTAAGAGAGCAGACAGAGGTAATATGACATCTCCACCTGPIRDS工KRADRGTS PThisstudyAGGTCACTGGCCCTGTTCAAATTAGAGATTCCCTTAAGAGAGCAGACAGAGGTAATATGACATCTCCACCTGPRDS工KRADRGTSPC05010015020025030035010DEX-rayC-terminal.NMRHelice-3N-terminal.-3.81-10Helice-2-15-202004006008001000Numberottesidues期35第李志斌KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响FMXD1POLR2HPOLR2EASB12KDMSBPOLR2APHFBPOLR28ZC3H128HUWEITRERF1MTMR9UBE2ASARTITSPAN11PQLC3TCFTL1HDGFL3KLFERNFCTNND1CTNNB1CTBP2CDHIENSOARG00000020708APOPTICTBP1PPP2R3APRMTIDDX3XMMPgTNFSF8ETV4GABPANFKBETV2ETV6NKX2-2图5山羊KLF8蛋白结构特征分析Fig.5Structural feature analysis of goat KLF8proteinA.山羊KLF8蛋白潜在结构域;B.山羊KLF8蛋白二级结构;C.山羊KLF8ORF部分核苷酸序列（第一和第三行）和推导的氨基酸序列（第二和第四行）的比较;D、E.K L F8 蛋白三级结构分子模型的质量评价结果;F.山羊KLF8蛋白互作分析2.4山羊KLF8组织表达谱为探究KLF8基因的组织表达特性，利用qPCR技术检测该基因在山羊各组织中的表达情况，以UXT为内参，心组织为参照.结果表明，KLF8在山羊脾脏组织中表达相对最高，极显著高于其他组织（P0.01）,在肾脏和肺脏组织中中度表达,其次为肝脏和心脏组织，而低表达于背最长肌和股二头肌（图6）.*57*4*3-2十170心Heart肝Liver脾Speen肺Lung肾Kindey二头肌Bicepsfemoris背最长肌Longssimusdorsi组织Tissue图6 KLF8基因在山羊不同组织中的表达情况Fig.6The expression of KLF8 gene in different tissues of goats2.5过表达KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响构建的过表达载体（pcDNA-KLF8），经KpnI和NotI双酶切后获得含KLF8片段和pcDNA-3.1载体片段，长度分别为10 6 9bp和5.4kb左右（图7 A），且测序结果正确，可用于后续研究.因pcDNA3.1vector不带有荧光标签,故本试验通过qPCR检测转染pcDNA-KLF8,培养48 h之后对照组与实验组之间KLF8表达水平是否有差异，qPCR检测发现,KLF8在山羊肌内前体脂肪细胞中过表达效果极显著（P0.01）（图7 B），转染效果良好.CCK-8检测结果表明，过表达KLF8后显著抑制了细胞增殖，过表达组OD值极显著低于对照组(P0.01）（图7 C).采用EdU细胞增殖试剂盒检测过表达KLF8基因对细胞增殖的影响,EdU检测结果所示（图7 D），增殖细胞标记为红色荧光，使用ImageJ软件进行自动细胞计数,结果发现过表达KLF8基因后，抑制了细胞增殖，红色荧光细胞占蓝色荧光细胞的比例降低,表明过表达KLF8基因后肌内前体脂肪细胞增殖受到抑制.进而检测脂肪细胞增殖相关标志基因的表达水平，结果显示（图7 E），在山羊肌内前体脂肪细胞中过表达KLF8,极显著地上调CCND1的相对表达水平（P0.05).36第50 卷西南民族大自然科学版）bpM1ABCCCK85.4kh800000.6-70000600002000500000.44000013T10001069bp7500.2150025000.0PCONA3.1PCDNA3.1-KLF8100PCDNA3.1PcDNA3.1-kIf8pcDNA3.1pcDNA3.1-KLF8DEHoechst2.01PcDNA3.1PCDNA3.1-KLF8100um100.um1.5-EdU1.0-P=0.076100um0.6-Merge0.0P27P53PCNACCND1CCNE1CDK2P21100CO图7 过表达KLF8对细胞增殖的影响Fig.7Effect of overexpression with KLF8 on cell proliferation.A.pcDNA-KLF8双酶切鉴定结果（M:DL2000Marker;1:pcDNA-KLF8）;B.K L F8 过表达效率；C.CCK-8检测过表达KLF8对肌内前体脂肪细胞增殖影响;D.在肌内前体脂肪细胞中过表达KLF8后EdU检测结果；E.在肌内前体脂肪细胞中过表达KLF8后对增殖相关基因表达的影响3讨论研究表明，KLF8通过抑制或激活靶基因启动子来调节关键的细胞过程，包括细胞周期进程、转化、上皮向间充质转化、迁移和侵袭15；有研究发现,KLF8通过调控细胞增殖在癌症及肿瘤疾病中发挥重要作用8 ,但在山羊肌内前体脂肪细胞增殖中的调控作用尚未见报道.本试验通过RT-PCR克隆得到山羊KLF8启动子2 0 0 1bp和CDS区10 6 2 bp，并且在启动子中不存在CpG岛，表明KLF8的表达调控不受DNA甲基化影响.DNA甲基化发生在CpG岛，甲基化后通过改变DNA构象、染色质结构和DNA与转录因子的结合以调节基因表达16 .已获得的KLF8启动子序列中存在TATA-Box、CA A T-Bo x 和GATA-Box分别为4个、15个和2 2 个，研究显示，TATA-Box、CA A T-Box和GATA-Box参与调控基因转录频率和转录的正确起始17-19.由此表明，KLF8可以被正确起始转录.启动子区域中包含2 个潜在核心启动子区，且均位于转录起始位点上，符合大多数基因启动子的分布.转录因子通过特异性识别靶基因启动子区域的结合位点，激活或抑制靶基因的转录活性.预测结果显示，KLF8潜在核心启动子区存在C/EBP、T BP、EIf-1、C-Ets-1、NF-1和Odd识别位点.有研究报道发现这些识别位点在细胞增殖、调亡、肿瘤发生以及神经疾病和调控转录等多方面发挥重要作用2 0-2 4.但是均未报道这些转录因子调控KLF8的表达，因此推测它们可能通过抑制/激活作用共同调节KLF8基因的转录，这一推测还需进一步研究验证.克隆获得山羊KLF8基因序列132 9bp，包含CDS区10 6 2 bp，编码氨基酸353个.KLF8蛋白中存在KLF家族典型的锌指结构，表明KLF8锌指结构也可能结合启动子中的CACCC序37期第李志斌KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响列;在KLF8蛋白序列中也存在Pro-Val-Asp-Leu-Ser基序,表明该蛋白可以与辅助抑制因子CtBP相互作用,抑制含有CACCC元件的基因表达2 5.KLF8蛋白需要从细胞质进人细胞核发挥转录调控作用，经核定位分析发现KLF8蛋白C末端存在多个核定位信号，其中S165和K172为激活域，其余核定位信号存在于锌指结构中.研究显示，核定位信号与穿梭受体-输人蛋白结合后，将其转运至细胞核内2 6 有研究证实，S165或K171突变时增加细胞质中KLF8含量，表明其在KLF8的跨核转运中发挥重要作用2 7 ,这与已知研究中激活域的位置存在差别,可能是KLF8的不同剪切体造成的.明确基因的组织表达规律是研究其功能的基础，因此,为了明确山羊KLF8的组织表达特性,本研究利用qPCR技术检测了KLF8基因在成年山羊不同组织中的相对表达水平,KLF8组织表达谱显示KLF8在山羊脾脏组织中的相对表达水平最高，显著高于检测的其它组织中的表达.结果与其他学者在其他物种中的报道存在不同之处,有研究表明,KLF8基因在成年人的组织中广泛表达,在肾脏、心脏和胎盘中表达水平较高2 5.虽然KLF8在脾脏中的作用未知，但因为脾脏是重要的免疫器官2 8 ,对清除、吞噬、免疫反应和造血功能的增强至关重要,因此推测KLF8可能参与免疫细胞的增殖分化以维持机体免疫功能.研究表明,KLF8在肾脏、肝脏和肺脏均可通过细胞增殖、侵袭和迁移等过程促进肿瘤或癌症的发生2 9-31.由于KLF8参与诱导细胞周期进展和维持血管平滑肌收缩状态32 ,因此KLF8在心脏、背最长肌和股二头肌中低表达以维持机体正常功能.基于上述报道结合本试验结果推测,KLF8基因组织表达具有物种和组织特异性且KLF8可能在各组织中均发挥作用.为了阐明山羊KLF8基因对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的调控作用，本试验利用过表达KLF8对其进行深入研究，CCK-8和EdU检测均显示，过表达KLF8基因显著抑制山羊肌内前体脂肪细胞的增殖.这与其他学者所发现的KLF8在膀胱癌细胞、肺癌细胞中高表达显著促进细胞增殖和集落形成的研究结果不同31.33,这种差异可能是因为细胞类型不同引起的.因KLF8为转录因子KLF家族中的一员，主要在转录过程中发挥作用，固检测了转染过表达载体后KLF8转录水平的变化，并且为进一步阐明其可能的作用方式及分子机制，对过表达KLF8后山羊肌内前体脂肪细胞的增殖相关标志基因变化进行检测.结果发现，过表达KLF8后,KLF8在山羊肌内前体脂肪细胞中过表达效果极显著,肌内前体脂肪细胞增殖相关标志基因CCND1表达水平与对照组相比极显著升高.CC-ND1是细胞周期蛋白家族中重要的一员,其主要功能是调节细胞周期进程，促进细胞由G1期转变为S期34.此外KLF8还可以通过募集辅助激活因子p300与P/CAF以激活细胞周期蛋白D1（Cy c l i n D 1）的表达15,但在山羊KLF8蛋白第118 和2 48 位氨基酸分别为V和Q,这可能是由于物种差异造成的,进而影响CyclinD1的表达，使细胞停滞在G1期,影响肌内前体脂肪细胞的增殖.由于基因表达调控受诸多因素影响,基因表达包括转录产生mRNA和翻译产生蛋白质等不同层面的动态过程，不同基因的mRNA表达峰值存在时间上的差异35.过表达山羊KLF8，可能使肌内前体脂肪细胞的周期进程停滞在G1期,故在该时期没有检测到P27、P53和PCNA等其余细胞增殖相关标志基因表达水平的显著性差异.但过表达KLF8基因后抑制山羊肌内前体脂肪细胞增殖的具体机制尚不清楚，有待进一步研究.4结论成功获得山羊KLF8基因的启动子和CDS区序列,长度分别为2 0 0 1bp和10