大肠杆菌感受态细胞制备与转化.ppt

实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化【实验目的】【实验目的】n n学习学习CaCl2CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技术。法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技术。n n学习大肠杆菌转化的原理与技术。学习大肠杆菌转化的原理与技术。【实验原理实验原理】n n在自然条件下在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种一般缺乏此种转移所必需的转移所必需的mobmob基因基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。n n如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNADNA。受体细胞经过。受体细胞经过一些特殊方法一些特殊方法(如电击法如电击法,CaCl,CaCl2 2等化学试剂法等化学试剂法)的处理后的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源成为能允许外源DNADNA分子进入的感受态细胞分子进入的感受态细胞(Compenent cells)(Compenent cells)。n n转化转化(Transformation)(Transformation)是将外源是将外源DNADNA分子引入受体细胞分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于0 0的的CaClCaCl2 2低渗溶液中，菌细胞膨胀低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的成球形。转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羟基酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经4242短时间热激处短时间热激处理，促进细胞吸收理，促进细胞吸收DNADNA复合物。进入受体细胞的复合物。进入受体细胞的DNADNA分子通过复制分子通过复制,表达实现遗传信息的转移表达实现遗传信息的转移,使受体细胞使受体细胞出现新的遗传性状。出现新的遗传性状。n n转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),(R,M),它可以容忍外源它可以容忍外源DNADNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子即可筛选出转化子(Transformant(Transformant，即带有异源，即带有异源DNADNA分子的受体细胞分子的受体细胞)。n nCaCl2CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出制备出的感受态细胞暂时不用时的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积可加入占总体积1515的无菌甘油于的无菌甘油于-70-70保存保存(半年半年)。n n本实验以本实验以E.coli DH5aE.coli DH5a菌株为受体细胞菌株为受体细胞,并用并用CaCl2CaCl2处理处理,使其处于感受态使其处于感受态,然后与然后与pUCm-TpUCm-T质粒（质粒（T-T-载体）共保温，载体）共保温，实现转化。由于实现转化。由于pUCm-TpUCm-T质粒带有氨苄青霉素抗性基因质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)(Ampr)，可通过，可通过AmpAmp抗性来筛选转化子。如受体细胞抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入没有转入pUCm-TpUCm-T，则在含，则在含AmpAmp的培养基上不能生长。能在的培养基上不能生长。能在AmpAmp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了导入了pUCmTpUCmT。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。【设备、材料与试剂】【设备、材料与试剂】n n一、一、设备设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，恒温水浴锅，制冰机，制冰机，分光光分光光度计，微量移液枪。度计，微量移液枪。n n二、二、材料材料 E.coli DH5 E.coli DH5菌株菌株:R,M,Amp:R,M,Amp；pUCmTpUCmT质粒质粒DNA:DNA:购自上海生工生物工程有限公司。购自上海生工生物工程有限公司。n n三、试剂三、试剂【实验步骤实验步骤】n n一、一、受体菌的培养受体菌的培养 从从LBLB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E.coli DH5E.coli DH5单菌落单菌落,接种于接种于20 ml LB20 ml LB液体培养基中液体培养基中,37,37下振荡培养下振荡培养1212小时左右小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:501:100-1:50的比例接种于的比例接种于100ml LB100ml LB液体培养基中液体培养基中,37,37振荡培养振荡培养1-21-2小时至小时至OD600 OD600 0.50.5左右。左右。n n二、二、感受态细胞的制备感受态细胞的制备(CaCl2 (CaCl2 法法)1 1、将培养液转入离心管中、将培养液转入离心管中,冰上放置冰上放置10-3010-30分钟，然后于分钟，然后于4 4下下5000 rpm5000 rpm离心离心1010分钟。分钟。2 2、弃上清，用预冷的弃上清，用预冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaCl2 CaCl2 溶液溶液30ml30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置轻轻悬浮细胞，冰上放置1010分钟后，分钟后，4 4下下5000 rpm5000 rpm离心离心1010分分钟，弃去上清。钟，弃去上清。3 3、每、每50 ml50 ml初始培养物用初始培养物用200 l200 l预冷的预冷的0.1 mol/L0.1 mol/L的的CaCl2 CaCl2 溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。细胞悬液。n n三、三、转化转化 1 1、取、取200l200l感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，置冰上。感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，置冰上。2 2、加入连接产物、加入连接产物10l10l，轻轻摇匀，冰上放置，轻轻摇匀，冰上放置6060分钟。分钟。3 3、4242水浴中热击水浴中热击2 2分钟，热激后迅速置于冰上冷却分钟，热激后迅速置于冰上冷却2 2分钟。分钟。4 4、向管中加入、向管中加入800 l SOC800 l SOC液体培养基液体培养基(不含不含Amp)Amp)，混匀后，混匀后3737振荡培养振荡培养3030分钟，使细菌恢复正常生长状态，分钟，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)(Ampr)。（其间可以将。（其间可以将IPTG 7lIPTG 7l和和X-Gal 40 lX-Gal 40 l涂布于预制的涂布于预制的AmpAmp平板上）。平板上）。n n5 5、将上述菌液以、将上述菌液以3000 rpm3000 rpm离心离心2020秒，弃大部分上清，用剩余的秒，弃大部分上清，用剩余的100l100l上清重悬菌体，涂布于含上清重悬菌体，涂布于含AmpAmp的筛选平的筛选平板上（已涂布板上（已涂布IPTG 7lIPTG 7l和和X-Gal 40 lX-Gal 40 l），正面向上放置半小时），正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，3737培养培养16-2416-24小时。小时。n n同时做两个对照同时做两个对照:对照组对照组1:1:以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNADNA溶液溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LBLB平板平板上应没有菌落出现。上应没有菌落出现。对照组对照组2:2:以同体积的无菌双蒸水代替以同体积的无菌双蒸水代替DNADNA溶液溶液,但涂板时只取但涂板时只取5l 5l 菌液涂布于不含抗生素的菌液涂布于不含抗生素的LBLB平板上，此组平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。正常情况下应产生大量菌落。n n附录：附录：n nLBLB液体培养基液体培养基：胰蛋白胨：胰蛋白胨1 1 酵母提取物酵母提取物0.50.5 NaCl 1 NaCl 1 用用NaOHNaOH调调pHpH至至7.07.0，定容至，定容至1L1L，灭菌。，灭菌。n n含含AmpAmp的的LBLB固体培养基固体培养基：将配好的：将配好的LBLB固体培养基高压灭菌后冷却至固体培养基高压灭菌后冷却至6060左右左右,加入加入AmpAmp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为50ug/ml,50ug/ml,摇匀后铺板。摇匀后铺板。【注意事项注意事项】为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：实验中要考虑以下几个重要因素：1 1、细胞生长状态和密度：最好从、细胞生长状态和密度：最好从7070或或-20-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 OD600 来控制。来控制。DH5DH5菌株的菌株的OD600 OD600 为为0.50.5时时,细胞密度在细胞密度在5107 5107 个个/ml/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。n n2 2、质粒的质量和浓度、质粒的质量和浓度:用于转化的质粒用于转化的质粒DNADNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNADNA的浓度的浓度在一定范围内成正比在一定范围内成正比,但当加入的外源但当加入的外源DNADNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1ng1ng的的cccDNAcccDNA即可使即可使50l 50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5 5。n n3 3、试剂的质量、试剂的质量:所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.(GR.或或AR.),AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分装保存于干燥最好分装保存于干燥的冷暗处。的冷暗处。n n4 4、防止杂菌和杂、防止杂菌和杂DNADNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿所用器皿,如离心管如离心管,tip,tip头等最好是新头等最好是新的的,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNADNA酶或杂酶或杂DNADNA所污染所污染,否则均会影响否则均会影响转化效率或杂转化效率或杂DNADNA的转入的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。【思考题】【思考题】n n1 1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？其意义何在？、如何正确地设置连接和转化的各种对照？其意义何在？n n2 2、如何提高连接和转化的效率？、如何提高连接和转化的效率？