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分子标记技术原理、方法及应用
一、 遗传标记的类型及发展
遗传标记（genetic marker)：指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性.它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。
形态学标记:主要包括肉眼可见的外部形态特征，如:矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点： 形态学标记简单直观、经济方便.缺点： (1）数量在多数植物中是很有限的; （2） 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁； (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长
细胞学标记：植物细胞染色体的变异:包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等)的变化。优点： 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大； (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测
生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型.优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小.缺点： （1)目前可使用的生化标记数量还相当有限； (2)有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度
分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异,也叫DNA标记。（1）数量多，高多态性,信息量大(2）与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4）均匀分布于整个基因组（5）选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7）成本低廉(8)稳定,重复性好（9)共显性遗传
在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：
第一类是以分子杂交为核心的分子标记,包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记;
第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记;
第三类是一些新型的分子标记,如：SNP标记、表达序列标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
几种主要的ＤＮＡ分子标记
二、几种常见分子标记的原理及方法
1.RFLP2.RAPD3.AFLP4。SSR5。ISSR6。SNP
1.RFLP：Restriction Fragment Length Polymorphismby Botstein（1980)
基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。
用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。
优点： 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响；共显性，非常稳定;起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制
缺点：检测步骤多，周期长,需DNA量大，费时；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；放射性同位素，易造成环境污染

2.RAPD：Random Amplified Polymorphic DNA by Williams et al。(1990）
基本原理：此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物,对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性
基本步骤：
基本步骤：

与常规PCR的两点不同：
1．引物长度短——--常规PCR中需要两个引物，长度20—30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9—10个核苷酸,而且是随机引物。
2．退火温度低——-—在RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。
优点： 不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；技术简便,不涉及杂交和放射性自显影等技术；DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低
缺点:显性,不能鉴别杂合子和纯合子;实验重复性较差，结果可靠性较低
与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序,但相对RAPD 而言，RFLP方法更费时、费力,需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。
但RFLP又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。
3。AFLP：Amplified Fragments Length Polymorphism by Zabeau ＆ Vos(1993）
基本原理：基因组DNA经限制性内切酶双酶切，其中包括一个酶切位点稀有的内切酶（识别位点一般为6个碱基或8个碱基）和一个酶切位点丰富的内切酶（识别位点一般为4个碱基）的酶切组合，形成分子量大小不等的随机限制性片段。酶切片段先与有共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序作为PCR反应的引物结合位点，通过PCR反应把酶切片段扩增，然后将扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，其多态性即以扩增片段的长度不同而被检测出来。
三种检测方法:1.放射性自显影检测————同位素标记引物。2.银染检测3.荧光检测-———荧光染料标记引物。
优点： 由于AFLP标记的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多,AFLP标记产生的标记数目是无限的;每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；分辩率高，结果可靠;模板用量少,并且对模板浓度变化不明显；特定引物扩增，退火温度高，假阳性低AFLP标记

缺点：专利技术，试剂盒价格贵；技术复杂、成本高；基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高
技术比较：
1/它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。
2/AFLP结合了RFLP的稳定性和PCR技术高效性的特点.AFLP的多态性极高，一次可以检测到100－150个扩增产物,因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究.
4。SSR: Simple Sequence Repeat
基本原理:微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列,每个重复单元的长度在1-10bp之间，常见的微卫星如TGTG……TG= TG）n或AATAAT……AAT= （AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性.在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列,据此可设计引物,其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。
优点: 数量丰富,广泛分布于整个基因;共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；实验重复性好,结果可靠;所需DNA量少，对DNA质量要求不高
缺点：由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，对于许多物种需构建文库，因此其开发有一定困难，费用也较高
5。ISSR： Inter Simple Sequence Repeat by Zietkiewicz et al。 （1994）
基本原理：在SSR的5’或 3'端加锚 l～4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。在SSR的3’端或5’端锚定1—4个简并碱基的优点是在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了SSR在基因组上的滑动大大提高了PCR扩增的专一性。
ISSR的重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后,每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，它在引物设计上比SSR技术简单得多，不需知道DNA序列即可用引物进行扩增，又可以揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多态性。因此，ISSR标记是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。ISSR标记呈孟德尔式遗传,在多数物种中是显性的，目前己广泛用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。
6.SNP: Single Nucleotide Polymorphism
也是以PCR技术为基础的分子标记技术。它是指不同生物个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异,这种差异可以通过设计特异PCR引物扩增和电泳检测显示出来。
SNP标记是根据基因组测序结果发展起来的，因而它的数量非常丰富。检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术.

优点： 共显性;基因有功能意义。。缺点：引物设计困难
三、分子标记技术的应用
司法鉴定
分子遗传图谱构建
基因定位（QTL）与克隆
遗传多样性研究
种质资源研究（品种、品质鉴定）
比较基因组研究