实验35过氧化氢酶的活性测定.doc

完整版)实验35过氧化氢酶的活性测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积.H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性.
一、过氧化氢含量的测定
【原理】
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定.在一定范围内,其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系.
【仪器和用具】
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30％分析纯H2O2 57μl,溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5％（W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水.
【方法】
1。制作标准曲线：取10ml离心管7支,顺序编号，并按表40—1加入试剂.
表40-1 测定H2O2浓度标准曲线配置表
试剂（ml)
离 心 管 号
1
2
3
4
5
6
7
100μmol/L H2O2
0
0.1
0.2
0。4
0。6
0。8
1.0
4℃下预冷丙酮
1。0
0.9
0.8
0.6
0.4
0。2
0
5%硫酸钛
0.1
0.1
0。1
0。1
0.1
0.1
0。1
浓氨水
0.2
0。2
0。2
0。2
0。2
0。2
0。2

3000r/min 离心10min，弃去上清夜，留沉淀
2mol 硫酸
5.0
5。0
5。0
5.0
5.0
5。0
5.0
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色.
2.样品提取和测定：（1）称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35—1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3）向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算:
植物组织中H2O2含量（μmol/g Fw）=
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）;
Vt—样品提取液总体积（ml）；
V1—测定时用样品提取液体积（ml）；
FW-植物组织鲜重(g）。
二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法
【原理】
过氧化氢酶(CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
2e－

R（Fe+2)+H2O2==R（Fe+3+OH－)
2e－

R(Fe+3OH－）2+H2O2==R(Fe+2）2+2H2O+O2
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2
5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】
研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴;容量瓶25ml×1。
【试剂】
10％ H2SO4;0。2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；
0。1mol/L高锰酸钾标准液:称取KMnO4（AR）3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0。1mol/L草酸溶液标定；
0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17。6mol/L，取30% H2O2溶液5。68ml,稀释至1000ml，用标准0。1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下)进行标定；
0。1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4·2H2O 12。607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】
1。酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2。取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照）,测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml,再加入2。5ml 0。1mol/L H2O2,同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10％ H2SO4 2。5ml。
3。用0。1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失)为终点.
4.结果计算：
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示:
酶活（mgH2O2/gFW·min)=
式中 A—对照KMnO4滴定毫升数；
B-酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量(ml）；
V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7—1ml 0。1mol/L的KMnO4相当于1。7mg H2O2。
【注意】
所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。
三、过氧化氢酶的活性测定-—紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低.根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0。5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0。2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮);
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】
1。酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0。5g置研钵中,加入2～3ml 4℃下预冷的pH7。0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支,其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40—2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.2
0.2
0。2
pH7。8磷酸（ml)
1。5
1.5
1。5
蒸馏水（ml）
1.0
1。0
1.0
25℃预热后,逐管加入0。3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次,共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算:
以1min内A240减少0。1的酶量为1个酶活单位(u）。
过氧化氢酶活性（u/gFW/min)=
式中 A240= AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值;
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）;
0。1—A240每下降0。1为1个酶活单位（u)；
t-加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
【思考题】
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?
2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关？