用应ssap技术分析渐渗系后代多样性研究--毕业设计.doc

本科生毕业设计(论文)中文题目 应用SSAP技术分析渐渗系后代多样性研究 外文题目 SSAP technique analysis of diversity in offspring introgression lines 学号0907040010 姓名 陈志青 学院 生命科学学院 专业 生物科学（师范类） 指导教师 罗向东 完成时间2013年4月18日 江西师范大学教务处制目录目录I摘 要2Abstract3引 言41 文献综述5 1.1 植物渐渗杂交的研究进展51.1.1渐渗杂交概述51.1.2 渐渗杂交可激活沉默的转座元件5 1.2 植物逆转座子的研究进展51.2.1 逆转座子的类型与结构61.2.2 逆转座子的转座活性71.2.3 逆转座子的转座机制7 1.3基于逆转座子的SSAP分子标记7 1.4 SSAP分子标记的应用8 1.5本课题的立项依据和研究意义92 材料与方法9 2.1供试材料10 2.2 实验方法102.2.1 模板DNA的制备102.2.2 基因组DNA酶切112.2.3连接接头112.2.4 预扩增122.2.5 选择性扩增122.2.6 扩增产物的检测142.2.6.1 变性聚丙烯酞胺胶电泳142.2.6.2 SSAP条带的显色14 2.3 数据统计153 结果与分析15 3.1 遗传多样性分析15 3.2 群体PCA分析16 3.3 系统进化树分析164 讨 论17参考文献19附录A21 A.1 主要实验仪器21 A.2主要试剂21符号表22致谢23I摘 要逆转座子的高拷贝数特点和稳定的遗传特性使其在分子标记领域有着巨大的应用潜力,高等植物中的逆转座子主要属于Ty1-copia类,基于其LTRs的SSAP已成为最有用的分子标记技术之一。本研究利用本实验室分离到的东乡野生稻渐渗系后代Ty1-copia类逆转座子的LTRs,建立了研究东乡野生稻渐渗系后代多样性的SSAP技术。对46个材料包括东乡野生稻渐渗系、中国栽培稻以及国外栽培稻进行遗传多样性分析。SSAP序列特异性引物根据Ty1-copia类逆转座子houba、osr15和osr17的LTR区域设计。结果扩增得到140条条带，进一步分析可以将这些条带分为6个家族,东乡野生稻后代几乎分布于每个家族中; PCA分析也发现, 东乡野生稻渐渗系后代分布广泛。渐渗系后代的平均Neis基因多样性（He）结果为0.394,高于中国和国外的栽培稻（分别为0.385和0.376）。表明渐渗杂交能够扩大现有栽培稻的变异度,为水稻遗传改良提供有效的途径。关键词：渐渗系，栽培稻，SSAP，多样性 SSAP technique analysis of diversity in offspring introgression Chen ZhiqingDirected by Professor Luo Xiangdong AbstractThe stable of genetic characteristics and high copy number of retrotransposons made it has great potential applications in the field of molecular markers, retrotransposons in higher plants are mainly belongs to the Ty1-copia class, The SSAP based on LTRs has become one of the most useful molecular marker technology.This study use the LTRs of offspring introgression lines derived from Dongxiang wild rice , it is the class of Ty1-copia retrotransposon which was separated in our laboratory, established the study of SSAP technology of the diversity of Dongxiang wild rice introgression lines.46 materials including introgression lines (ILs) derived from Dongxiang Wild Rice and cultivated rice from China and Foreign were used to investigate the genetic diversity by using SSAP technology. The SSAP primers were designed according to the LTR region of Ty1-copia like retrotransposon (houba, osr15 and osr17). The result showed that a total of 140 sepecific bands were amplified. Six families were distinguished after cluster and alignment analyses of the bands. ILs derived from Dongxiang Wild Rice exsit in all of the families. The average Neis gene diversity (He) of ILs was 0.394, which was higher than that of China and Foreign cultivated rice (0.385 and 0.376, respectively). It suggested that introgression hybridization introgression could broaden the base of genetic variation and provided a method in breed improvement of rice. Key words: introgression lines, Cultivated rice,SSAP,diversity引 言人们在对植物遗传多样性诱发因素的深入研究中发现了大量存在于高等植物的逆转座子(Retrotransposon)，它是目前己知数量最大的一类可活动的遗传因子，根据逆转座子DNA序列中是否含长末端重复序列(Long terminal repeat ,LTR)及其结构特点，可将逆转座子分为LTR和non-LTR两类1。 高等植物中的逆转座子主要是LTR类，其拷贝数、结构、插入位点对基因组大小及遗传多样性具有重要的意义。在过去十年, 研究者开发了各种各样的分子标记用于研究LTR逆转座子的插入位点, 如序列扩增多态性(SSAP)。序列SSAP技术是基于AFLP技术的基础上改进的, 能够识别出逆转座子插入位点及其附近序列的多样性，由于其多态性比例高、更适用于逆转座子家族拷贝数分析而被广泛应用。这种方法已经应用于各种植物的遗传图谱构建、基因多态性分析、系统进化树构建、植物进化研究以及由逆转座子导致的基因功能改变分析2。前人的研究表明,外源DNA渐渗能够导致植物基因组中逆转座子结构、拷贝数以及活性的改变3，而逆转座子活性的改变会使其在基因组DNA上的插入位点发生改变，进而引起植物基因组大小以及遗传多样性的改变。东乡野生稻具有许多优异基因，但其渐渗过程中会导致许多遗传和表观遗传上的改变4，如染色体结构的变异、序列的丢失和出现、以及LTR逆转座子活性的改变。而逆转座子活性的改变对其渐渗系后代群体的多样性也将产生变化,本研究利用SSAP技术,与栽培稻作为参照，对东乡野生稻渐渗系后代的遗传多样性进行探究。研究结果发现东乡野生稻渐渗杂交能够扩大现有栽培稻的变异度,同时也为水稻遗传改良提供有效的途径。1 文献综述1.1 植物渐渗杂交的研究进展1.1.1渐渗杂交概述渐渗杂交(Introgressive hybridization)最早由Anderson和Hubricht5所定义，指两物种的杂交后代与亲本反复回交，把某一亲本的性状带至另一亲本，产生的后代称为渐渗系。许多植物的进化历程中都含有渐渗杂交的足迹。在水稻的渐渗杂交中，育种工作者构建了水稻与多种野生稻的种间渐渗杂交后代, 主要利用了野生物种的抗逆性、抗病虫性、株型、耐光氧化、C4 植物的高光效和抗光氧化等优异基因。本研究利用东乡野生稻和栽培稻协青早B构建渐渗系进行了渐渗系后代遗传多样性研究6。这些渐渗系的构建及优异基因的研究为有效的利用外源优异基因进行作物遗传育种奠定基础, 对于创造新的水稻种质具有重要理论意义。1.1.2 渐渗杂交可激活沉默的转座元件在植物和真菌基因组中, 转座元件多数情况下是处于抑制状态7。几十年前，McClintock就曾预言，渐渗杂交对植物基因组来说是一种强烈的“冲击”(genome shock)，在这种情况下，基因组内沉默状态的转座元件被激活，从而对这一冲击发生反应并引起基因组的重建。尽管尚缺少渐渗杂交和转座元件激活之间因果关系的直接证据，但一些间接的观察得出的结论与McClintock的预言相一致，而且越来越多的研究也支持这一假说。研究表明，菰DNA渐渗杂交能够引起水稻基因组中几种LTR逆转座子拷贝数的增加以及MITE类转座子mPing和Pong的激活8；小麦族远缘杂交及多倍化可激活转座子元件、蛋白质编码序列以及一些未知功能的序列9；两种烟草Nicotiana otophora和N. tabacum的种间杂交、两个wallaby种间杂交等植物的研究都能够为种间杂交激活沉默的转座元件提供有力的证据。总之，从以上研究可以看出，远缘杂交可激活基因组中沉默的转座元件，这很可能是远缘杂交打破了基因组内部表观遗传抑制控制（如甲基化状态的改变）的结果。1.2 植物逆转座子的研究进展 转座元件（Transposable element, TE）是指在植物基因组中从染色体的一个位点转移到另一位点或者从一条染色体转移到另一个染色体上的DNA 序列10。根据其结构和转座机制不同，转座元件可分为两个主要类型：第一类以RNA为中间媒介通过DNA-RNA-DNA 的方式进行转座，每转座一次其拷贝数就增加一个，由于其转座过程经历逆转录过程，因此称为逆转座子；第二类是以DNA-DNA 方式增殖的转座元件，它们从基因组的一个位点切下后插入基因组的另一个位点，转座前后不涉及拷贝数的变化，称为DNA转座子11。1.2.1 逆转座子的类型与结构逆转座子是真核生物中数量最多、分布最广泛的转座元件。根据长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）的有无，逆转座子可分为LTR 逆转座子和non-LTR 逆转座子两类。LTR 逆转座子根据其 POL（Polyprotein）区编码蛋白的相似性及排列顺序，又可分为 Ty1-copia 和Ty3-gypsy 两类。 植物的LTR逆转座子研究的最为广泛，其结构与逆转录病毒DNA结构基本相似（图1），只是缺少逆转录病毒的包膜蛋白基因，其LTR长度从100 bp到5 kb不等，LTR不编码蛋白质，包含对转座起重要作用的转录起始信号和终止信号。LTR逆转座子内部主要包括gag和pol基因区，gag基因区编码的蛋白负责逆转座子RNA的成熟和包装，pol编码四个与转座有关的蛋白，分别为prot（蛋白酶），RT（逆转录酶），RNaseH和int（整合酶），其中RT和RNaseH是逆转座子复制和转座必需的，int负责逆转座子插入到基因组的新位点。根据pol基因的同源性以及排列顺序，LTR逆转座子又可分为Ty1-copia和Ty3-gypsy两类。在Ty1-copia类逆转座子中，int基因排列在RT和RNaseH之前，而Ty3-gypsy类逆转座子的int基因在RT和RNaseH之后，位于POL基因区的末端12。 图1 LTR逆转座子结构LTR：长末端重复； gag：种群专一性抗原；pro：蛋白酶；RT：逆转录酶；RnaseH：核糖核酸酶；int：整合酶；PBS：引物结合位点；PPT：多嘌呤位点 Fig.1 The structures LTR retrotransposonsLTR: long terminal repeat; gag: group-specific antigen; prot: protease; RT: reverse transcriptase; RNaseH: ribonuclease H; int: integrase; PBS: primer binding site; PPT: polypurine tract.1.2.2 逆转座子的转座活性植物基因组中的逆转座子在正常生长条件下通常没有转座活性，其原因如下：（1）植物基因组中的大部分逆转座子含有终止密码子突变、移框突变等现象，不能够形成转座。（2）植物基因组中存在抑制逆转座子转座活性的重要调节机制。（3）复杂的转座过程，转座具有转录、RNA加工、mRNA的输出、翻译后修饰、插入核酸、反转录及整合等许多步骤，其中任何一步都可能限制逆转座子的转座活性13,14。在一般情况下，逆转座子以静止状态存在于植物中，但部分逆转座子仍具有转座潜能，能够被各种生物和非生物胁迫所激活如包括原生质体分离、组织培养、外伤、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）等非生物胁迫能够大大提高Tnt1和Tto1逆转座子的表达15。同时许多生物因素，如病毒、细菌、真菌病原物以及真菌提取物接种，也可以导致逆转座子的转录激活16,17。另外，渐渗杂交也能够诱导逆转座子的转录及转座活性。1.2.3 逆转座子的转座机制LTR逆转座子的转座机制比较复杂，其转座类似逆转录病毒在宿主细胞中的复 制，是逆转录酶主导的反应，以 DNA-RNA-DNA方式转座。LTR不编码蛋白质，但含有对转座起重要作用的启动和终止信号。LTR 逆转座子以其5端LTR下游的由十几个碱基组成的mRNA 的引物结合位点（PBS）与宿主细胞内相应的tRNA互补合成短的RNA 双链，逆转录酶以此tRNA 为引物合成第一条DNA 链，与tRNA 形成RNA-DNA杂合链。LTR逆转座子中的RNaseH 专一地消化RNA-DNA杂合链上的RNA，形成单链DNA，然后以此单链DNA 为模板，位于3端LTR 上游的多嘌呤序列（PPT）作为引物合成双链线性DNA 链。在INT（整合酶）的作用下，染色体上靶位点的DNA双链被切开，同时对将插入的双链DNA进行切割，产生3-5bp不等的缺痕，合成完毕、具有逆转座子完整结构的双链DNA转移到靶位点时，该位点的DNA 片段两侧形成3-5bp 的重复18。 1.3基于逆转座子的SSAP分子标记 SSAP是由Waugh等根据AFLP标记而改进的一种基于逆转座子LTR序列的锚定的AFLP技术，用于检测逆转座子插入位点与邻近限制性酶切位点之间的 DNA 多态性（图2）。在众多逆转座子的分子标记中，SSAP被认为是多态性最丰富、灵敏度最高、反映的多态性信息量最多的一种类型。其原理与操作流程与AFLP 相类似，首先用限制性内切酶酶切产生具有粘性末端的限制性片段，然后将这些片段与其末端互补的已知序列的接头相连接，所形成的带接头的特异序列作为随后预扩增反应的模板。预扩增产物稀释后作为选择性扩增的模板，引物分别为接头特异引物和基于逆转座子中保守序列（如LTR）而设计的引物。SSAP扩增的多态性来源主要有以下三个：第一是限制性位点及其两侧序列的变异；第二是LTR 5末端的变异；第三是逆转座子插入位点的变异。其中第一种变异与AFLP所检测的变异一样，而后两种变异则是由逆转座子产生的。因此，理论上SSAP多态性高于AFLP，目前许多有关SSAP 和AFLP 相比较的报道也表明前者多态性高于后者19,20,21,22。 图2 逆转座子序列特异扩增多态性（SSAP）扩增原理Figure 2 Amplification strategy of SSAP (Sequence-specific amplification polymorphism) marker1.4 SSAP分子标记的应用由于SSAP分子标记多态性高, 操作简单而且费用低等特点, 利用这种标记进行遗传多样性及种内、种间的系统发育分析对于亲本选配和品种纯度鉴定具有十分重要的意义。利用BARE-1的反向重复序列区设计的SSAP引物被应用于小麦四倍体、大麦品种之间的遗传多态性分析以及亲缘关系系统树的构建,且通过SSAP标记发现了一些常规图谱发现不了的品种间的隐秘变异23。Venturi等运用SSAP分子标记检测发现苹果新品种的芽变可能是由于逆转座子插入新位点产生。除此之外, SSAP技术还被用于大麦、莴苣等植物QTLs定位以及遗传连锁图谱的构建。1.5本课题的立项依据和研究意义渐渗杂交是植物界普遍发生的现象，并成为促进植物遗传变异的重要手段24。作为栽培稻的祖先，野生稻是一个天然的基因库，具有高产、优质、强耐冷、抗旱、抗多种病虫害等优良特性，前人的研究表明野生稻比栽培稻具有更高的遗传多样性，因此，将野生优异基因转入到栽培种中，是扩大水稻遗传基础和实现水稻遗传改良的重要途径，已经成为国内外育种家孜孜不倦的追求目标。众多育种工作者构建了一些高代重组自交系，并对一些重要农艺性状的遗传及生理学特性作了大量研究，如耐旱特性的鉴定、耐冷、高产以及茎杆木质化等性状相关基因的 QTL 分析。然而，目前利用东乡野生稻成功改良栽培稻数量性状的报道仍很少。研究表明，限制野生种质优异基因利用的原因是多方面的。一方面是因为野生种中存在不良连锁基因和不利农艺性状，加上所有平衡群体中野生种中不利基因高频的出现、基因互作的增加、微效多基因效应被掩盖等缺点；另一方面，外源基因渐渗会导致受体植物出现广泛的遗传和表观遗传变化，因而在基因组和表型上表现出许多不稳定现象，如丢失亲本序列或出现新序列；转座子活性等。这些遗传和表观遗传学变异可在一定程度上导致种间杂种及其后代疯狂分离，并很难在短时间内稳定和纯合，这在一定程度上阻碍了野生优异基因在实际育种中的利用25。 针对上述制约野生稻种优异基因挖掘和利用的瓶颈问题，本课题组对东乡野生稻基因渐渗系BC1F9代的228个株系进行SSAP分析，来揭示渐渗群体的遗传多样性，SSAP技术够识别出逆转座子插入位点及其附近序列的多样性，对各种植物的遗传图谱构建、基因多态性分析、系统进化树构建、植物进化研究以及由逆转座子导致的基因功能改变分析等方面的研究具有重要意义并为阐明东乡野生稻渐渗诱发栽培稻遗传和表观遗传变异机制奠定基础，为东乡野生稻中优异基因的有效挖掘与利用提供有用的信息。2 材料与方法2.1供试材料 以东乡野生稻(O. rufipogon Griff.)为供体亲本,与栽培稻协青早B(O. sativa spindica Kato.)杂交获得种间杂种F1,F1与协青早B回交获得BC1F1群体。BC1F1经单粒传、再连续自交8次后获得含228个株系的BC1F9 BILs群体。本实验所用材料包括东乡野生稻渐渗系后代BC1F9、中国水稻品种及国外水稻品种（表1）。表1 实验材料Table 1 Materials used in the experiment品种 Cultivars名称 name渐渗系后代IL5335、IL5243、IL16、IL58、IL116、IL126、IL149、IL183、IL159、IL18、IL40、IL223、IL5339、IL5、IL12、IL33、IL82、IL75中国水稻空育131、哈04、密阳46、金23B、珍汕97B、南京6号、台农1号、测64、桂99、谷梅4号、日本晴、TP309、稻花香、XB国外水稻 K12 、trenasse 、wells 、Bengal 、Lemont 、R15 、2428、cocodrie、Ronolo、Katy、della、tempheton、francis、dellrose2.2 实验方法2.2.1 模板DNA的制备所有材料在长至三叶一心时期取幼嫩的叶片,采用改良的CTAB法提取水稻基因组DNA26, 具体步骤如下:（1）取35 g水稻幼嫩的叶片剪碎放入研钵中,加液氮充分研磨至粉碎,适量分装至2 mL离心管中,装1/3左右; （2）每管加入1 mL 65预热的提取液(1.5CTAB),上下颠倒混匀,置65水浴锅中温育3060 min, 隔10 min颠倒混匀一次;（3） 取出室温放置5 min冷却, 加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1), 缓慢上下颠倒混匀;（4） 室温下12,000 rpm 离心10 min (温度不低于15)，重复抽提2次;（5） 吸取上清液约600 L到新的1.5 mL 离心管中,加入等体积的预冷的异丙醇, 轻轻混匀(沉淀DNA)后-20冰柜下2h或过夜;（6） 4下10,000 rpm离心10 min, 弃上清, 加入800 L 70%乙醇漂洗, 10,000 rpm离心5 min, 弃去乙醇溶液, 重复漂洗一次;（7） 弃上清,自然晾干后,将沉淀的DNA溶于600 L 的TE溶液中,放常温下完全溶解。加入5 L不含DNase的RNaseA(终浓度为100g/mL),37保温2 h;（8） 然后于离心管中加入600 L氯仿:异戊醇(24:1), 轻轻上下颠倒混匀10 min 后12,000 rpm离心10 min,吸取上清液到1.5 mL 的离心管中先后加入1/10体积的3M醋酸钠(pH=5.2)和两倍体积预冷的无水乙醇,置-20冰柜中;（9） 2 h后10,000 rpm离心10 min,弃上清,之后用70%乙醇漂洗(8000 rpm,5min, 4),自然晾干后,最后DNA溶解于100 L灭菌的ddH2O中,-20保存备用;（10）待DNA完全溶解以后进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,根据DNA marker估计其溶度,调整溶度后的DNA置于-20保存备用。2.2.2 基因组DNA酶切用限制性内切酶EcoRI和 MseI (NEB) 进行酶切反应,反应体系如下: DNA 300ng 10T4 ligase Buffer 5.0ul EcoRI （20 U/L） 1.0ul MseI （20 U/L） 1.0ul ddH2O Up to 40.0ul注:酶切反应前,先将DNA、10T4 ligase Buffer、ddH2O混匀,4放置30min后,加入内切酶,混匀、低速离心数秒,37温浴。2.2.3连接接头 EcoRI 接头序列为：5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 3-CATCTGACGCATGGTTAA-5 MseI 接头序列为：5-GACGATGAGTCCTGAG-3 3-TACTCAGGACTCAT-5 用 T4 DNA ligase（TaKaRa）进行连接反应，体系如下： DNA 酶切产物 40.0l EcoRI 接头（5pmol/l） 1.0l MseI 接头（50pmol/l） 1.0l 10T4 ligase Buffer 1.0l T4DNA ligase（5U/l） 1.0l ATP（10mM） 1.0l Mg2+（25 mM） 2.0l ddH2O 3.0l将上述反应物混匀离心数秒,37保温过夜,65/10 min,-20保存备用。2.2.4 预扩增反应体系如下： DNA 酶切连接产物 6.0l 10PCR Buffer 2.5l Mg2+（25mM） 1.2l dNTP（2.5 mM） 2.0l Taq 聚合酶（5U/l） 0.3l EcoRI +0（5 mol/Ll） 1.2l MseI +0（5 mol/L） 1.2l ddH2O 10.6l混匀离心数秒后，进行PCR预扩增，程序为：（ 94/1 min; 56/1 min; 72/1 min, 35个循环, 72/10 min ） Step 1 94 1min Step 2 94 1min Step 3 56 1min Step 4 72 1min Step 5 to Step 2 35 cycles Step 6 72 10min Step 7 End4保存备用。预扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测,根据弥散带亮度确定其浓度,用ddH2O稀释适当倍数后(约15倍)用于选择性扩增模板。2.2.5 选择性扩增根据在耐冷渐渗系后代中具有活性增高的Ty1-copia类逆转座子houba、osr15和osr17的LTR区域设计27，本实验设计了4条逆转座子特异性引物, SSAP所用引物系列见表2。表2 SSAP 预扩增和选择性扩增引物序列 Table 2 Pre-amplification and selective amplification primer sequences used in SSAP 预扩增引物 Primers for pre-amplificationEcoRI +05-GACTGCGTACCAATTC-3MseI +05- GATGAGTCCTGAGTAA -3 选择性引物 Primers for selective amplificationLTR of osr155-GGTGTCTTTCTATTATCCCTTAT-3 Combined with MseI +CTC and EcoRI+TCLTR of osr17-15-TGGTCACAACCCTAAATCCT-3Combined with MseI +CTCLTR of osr17-25-CGACTGGTCACAACCCTAA-3Combined with EcoRI + TCLTR of houba5-GCGTGTTTCGTGCCTTCG-3Combined with EcoRI +TC,AA,TT and TG反应体系如下： DNA 酶切连接产物 7.0l 10PCR Buffer 2.0l MgCl2（25 mmol/L） 1.2l dNTP（2.5 mM） 2.0l Taq 聚合酶（5U/l） 0.3l 接头引物（5 mol/L） 1.0l LTR引物（5 mol/L） 1.0l ddH2O 5.5l选择性扩增程序为：（一轮循环94/30 s, 65/30 s, 72/60 s, 之后每轮循环退火温度降0.7, 扩增11个循环; 94/30 s, 56/30 s, 72/60 s, 23个循环, 72/10 min ） Step 1 94 3min Step 2 94 30sec Step 3 65（每个循环降 0.7） 30sec Step 4 72 1min Step 5 to Step 2 11 cycles Step 6 94 30sec Step 7 56 30sec Step 8 72 1min Step 9 to Step 6 23 cycles Step 10 72 10min Step 11 End4保存备用。2.2.6 扩增产物的检测2.2.6.1 变性聚丙烯酞胺胶电泳选择性扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶,含6%丙烯酰胺, 0.32%N,N-亚甲双丙烯酰胺,7M尿素)中电泳分离。具体步骤如下:（1） 玻璃板的准备: 将长、短玻璃板彻底清洗干净并晾干, 用75%乙醇分别擦拭长、短玻璃板3遍。晾干后长板进行硅化处理(即用亲和硅烷处理), 短板进行反硅化处理(即用玻璃硅烷处理), 处理过程中应防止长、短板交叉污染;（2） 6%凝胶配制及灌胶: 用ddH2O先溶解25.2克尿素,待尿素完全溶解后加入40%PA胶贮液9 mL,10TBE 6 mL,ddH2O定容到60 mL,充分混匀后,过滤。放置冰上, 灌胶前加入四甲基乙二胺（TEMED）50 L,10%过硫酸铵(APS) 250 L,充分混匀,灌胶。灌胶后用夹子夹紧,放置4 h以上或者过夜;（3） DNA变性: 取选择性扩增产物5 L,加入等体积的甲酰胺上样缓冲液,混匀短暂离心后,置于95水浴锅中变性5 min,立即置于冰上冷却;（4） 电泳:上下层电泳缓冲液都为1TBE,电泳之前清洗点样孔3遍。60W预电泳30 min,上样10 L,恒功率电泳,60W/2.5 h3 h。2.2.6.2 SSAP条带的显色SSAP条带显色主要参照现代分子生物学技术(第二版)(卢圣栋,1999), 稍作改动:（1） 固定: 电泳结束后,撬开板,将附着凝胶的长板浸在固定液(10%乙醇, 0.5%冰醋酸)中,轻摇固定5 min;（2）染色: 将固定液倒出，将凝胶放入硝酸银染液(10乙醇,0.5%冰醋酸,0.2%AgNO3)中,轻摇染色5 min。将凝胶从染色液中取出,放入蒸馏水中短暂漂洗(约510 s); （3） 显色: 将凝胶立即转入显影液(3%NaOH, 0.1%甲醛)中,轻摇,直至条带清晰可见;（4） 终止: 将显影液倒出,凝胶重新放入固定液中,固定5 min;（5） 保存: 弃去固定液,去离子水漂洗2遍,自然风干保存。2.3 数据统计没有条带扩增出来记为“0”，扩增出目的条带的记为“1”。系统发育树利用NTSYS pc 2.1中SAHN方法构建。各遗传参数和遗传距离利用软件GENALEX 6.0中的主成分分析（Principal coordinate analysis, PCA）和贝叶斯（Bayesian）中的聚类方法来分析。3 结果与分析3.1 遗传多样性分析将这46个材料分为3个种群，pop1为渐渗系后代、pop2为中国栽培稻、pop3为外国栽培稻。之后利用5对引物组合对这46个材料进行SSAP分析,共扩增出140条条带，每一条条带为一个扩增位点。对这140个位点，利用软件GENALEX 6.0分析，得到其遗传距离（见表3）。从表中可以看出，pop1