有机锗化合物与DNA相互作用的研究毕业论文.doc

药学系毕业论文题 目：有机锗化合物与DNA相互作用的研究姓 名： 学 号： 年 级： 专 业： 指导教师： 职 称： 教 授 学 科： 药物化学 目 录论文摘要31文献综述 51.1 前人研究成果51.2. 结合方式51 3. 研究方法71.4. 拟解决的问题 101.5 立题依据102实验部分 102.1 实验材料102.2 试剂和样品处理112.3 紫外可见吸收光谱（UV-Vis） 122.4荧光光谱及荧光滴定 133 结果与讨论 133.1 紫外可见吸收光谱（UV-Vis） 133.2. 荧光光谱143.3药物对溴化乙锭(EB)的荧光强度的影响 174 结论 175参考文献 18致 谢 20有机锗化合物与DNA相互作用的研究学 生: 指导老师: 上官国强 中文摘要用紫外可见分光法和荧光光谱法研究了两种有机锗化合物与小牛胸腺DNA(CTDNA)的相互作用。结果发现, BPE缓冲溶液中的有机锗化合物，当加入一定量的小牛胸腺DNA时,它们的最大紫外吸收光谱均发生了减色和红移现象；两种有机锗化合物在加入小牛胸腺DNA(CTDNA)后，荧光强度发生了明显变化,进而计算出化合物与小牛胸腺双链DNA的结合强度。用溴化乙啶（EB）作为荧光探针，当它与DNA结合后再加入药物分子，观察到EB荧光强度发生了明显减小，证实了两种有机锗化合物是以插入结合方式与小牛胸腺DNA结合的。本研究结果对于进一步研究药物小分子与DNA相互作用提供了一个途径,对于阐明有机锗化合物抗肿瘤、抗病毒药物的作用机制、药物体外筛选、致癌物的致癌机制的研究以及疾病的起源等均具有重要意义。关键词: 有机锗化合物 小牛胸腺DNA 结合作用 Study on the Interaction of Organogermanium Compounds with DNA Student Director Shangguan GuoqiangAbstractThe affinity and mode of interaction of two kinds of organogermanium compounds with calf thymus DNA (CT-DNA) in BPE buffer were investigated by absorption spectroscopy and fluorometric technique. After the interaction with DNA, the organogermanium compounds exhibited hypochromism and bathochromic effect in the UV-Vis spectra, and the fluorescence intensity of organogermanium compounds were changed. In the presence of the compounds, the fluorescence intensity of EB-DNA was decreased markedly. Nonlinear least-squares analysis from fluorescence titration data yielded binding constants. The results indicated that the compounds interacted with DNA by intercalation. The results offer a new important guidance for the synthesis and mechanism study on anticancer active organogermanium compounds.Key word: Organogermanium compound calf thymus DNA interaction1文献综述1.1前人研究成果脱氧核糖核酸DNA是主要遗传物质，通过复制而将遗传信息由亲代传给子代。1928年，英国Frederick Griffith的转化实验首先发现了DNA是遗产物质；1943年Oswald Avery等人在Frederick Griffith转化试验工作的基础上，终于完成了令人信服的体外转化实验，弄清了遗传因子的本质是DNA；1952年，Hershey Chase的噬菌体转导实验进一步证实了DNA是遗传物质的结论；DNA真正被人们接受是在1953年Watson和Crick提出的DNA右手双螺旋结构模型。DNA右手双螺旋结构模型说明了基因结构、信息和功能三者之间的关系，奠定了分子生物学的基础1，核酸尤其是DNA正作为一个新的作用靶而日益引起人们的关注。脱氧核糖核酸DNA与药物小分子间相互作用的研究，对于了解核酸分子的结构和功能、蛋白质与核酸的相互作用、药物小分子DNA间的相互作用以及在药物分子设计等方面具有重要意义2。许多化合物都能与DNA发生作用，这些化合物包括小分子药物3，金属络合物4，酶抑制剂5，生物染色剂6等。以DNA作为药物作用靶是有效的新兴新药设计和药物筛选手段。1.2 结合方式：1.2.1 DNA由平行堆积的碱基，聚合的阴离子磷酸骨架以及两条由核苷酸形成的大沟、小沟组成了药物小分子识别的位点，药物小分子与DNA识别的位点。药物小分子DNA作用的方式主要有三种：非共价结合、共价结合、剪切结合。（1） 非共价结合包括：.外部静电作用即外源分子或离子与DNA分子的带负电荷的核糖磷酸基骨架之间的静电作用。.沟槽结合是指小分子化合物DNA分子中的大沟或小沟的碱基对边缘直接作用，通过这种选择性的作用非嵌入性地捆缚住DNA，从而阻止了DNA的模板作用，达到抗肿瘤、抗病毒的目的，如纺锤菌素。.嵌插作用是指具有平面或近乎平面结构的芳香环分子体系直接嵌入到DNA的碱基对之间，这是芳环与碱基对间的-体系,偶极-偶极相互作用及疏水作用的结果,如溴化乙锭(ethidium bromide)和柔红霉素等7。（2） 共价结合包括与亲核试剂（如NH2-NH2）的作用与亲电试剂的反应（如DNA的烷基化）与DNA交联作用等，具有特殊识别能力8。（3） 剪切结合是指具有剪切作用的分子特异性选择结合位点并最终DNA断裂。但大多数药物与DNA以较弱的非共价键结合。其中最主要的是氢键、离子键、范德华力和疏水键，这些均属于弱作用键9。1.2.2. 以上分类方法是是根据结合方式分类，也可根据与DNA结合的药物小分子的种类来分：（1）DNA与金属物质的相互作用：一些金属离子,特别是一些过渡金属离子,它们能与DNA发生缔合作用,使某些DNA的结构发生改变10,11。与DNA能发生相互作用的金属物质主要有以下两类:金属配合物无机金属离子配合物,尤其是过渡金属配合物与DNA相互作用的研究一直受到人们的关注。研究表明，这类化合物有望设计合成人工核酸酶,从而实现对DNA链上某些位点的特异性剪切；还可设计成性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒药剂12.金属配合物和DNA的键合通常有以下几种模式:嵌入,非共价沟槽键合,共价键合/杂交键合, DNA断裂,与类似核酸物质的键合。这相互作用致使DNA和物质分子的构象都发生改变以适应配合物的构象。这些金属配合物主要有: 金属卟啉配合物,铂配合物,其他过渡金属配合物13。游离的金属离子可直接与DNA发生相互作用。单价阳离子与DNA分子小沟内的AT区结合会导致DNA的弯曲,并使小沟变得更狭窄。二价金属离子经常对核酸产生特异作用,如能使DNA弯曲,使RNA分子折叠等14。(2) DNA与非金属小分子的相互作用非金属小分子物质,特别是一些药物分子与DNA的相互作用,会影响到DNA的生理和物理化学性质,改变DNA的转录和复制。在医药研究中,DNA与靶向分子相互作用的研究不仅可以阐述一些抗肿瘤、抗病毒药物及致癌物的作用机理,而且对进一步指导人工核酸的合成、DNA高级结构以及新型药物的设计合成的研究都具有重要意义15,16。药物分子与DNA的相互作用主要有以下3种模式17,18: 通过转录因子和聚合酶控制药物与蛋白质的相互作用,从而和DNA发生相互作用。 通过RNA与DNA双链的作用形成核酸三螺旋结构或RNA杂交(特殊位点的键合)与DNA单链的键合形成RNA - DNA杂交体影响转录酶的活性。 芳香族配合物分子与DNA的双链结合,这种结合有3个方面:a.与带负电荷的核酸的磷酸骨架通过静电作用结合。b.平面芳香环体系嵌入核酸碱基对之间。c.沟槽键合。1.3.研究方法1.3.1 光谱法（spectroscopy）紫外/可见吸收光谱是研究DNA与靶向分子相互作用的一种最方便、最常用的技术。因为含有碱基生色团的双螺旋结构DNA分子在260 nm附近处有强吸收1,而且许多DNA靶向分子或本身具有光学活性,或与DNA结合后可以产生光学活性,所以可根据相互作用前后DNA或其他分子的吸收谱带的变化即红移（蓝移）效应或减色（增色）效应对二者相互作用模式进行判断。荧光光谱作为一种快速、灵敏的谱学技术也被广泛用于DNA与其它分子相互作用研究。尤其是对具有荧光特性的靶向化合物,荧光光谱法是一种理想的研究方法,荧光光谱法主要根据相互作用前后反应物荧光强度的变化,对二者作用模式进行判断。有的药物的荧光发射可被DNA猝灭或增强。固定药物浓度，然后滴加一定浓度DNA至荧光发射强度不再变化为止。根据Stern-Volmer方程19可计算猝灭常数Ksv：F。/F=1+KsvCDNA。式中F。和F分别是DNA不存在和有DNA存在时的荧光强度，Ksv是猝灭常数，用来衡量DNA猝灭效率。 在偏振光激发下，荧光体所发射的荧光亦是偏振光。时间分辨荧光法可用来区别药物DNA的结合方式和猝灭类型，可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨并分别测定。圆二色谱法（circular dichroism）：是利用不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同而进行结构分析的方法。一般药物嵌插结合到DNA上由于它们不对称的环境而导致被诱导CD出现，由此被诱导CD谱带的符号和方向可获得一定的药物分子的结构信息以及其对核酸够性的影响20。拉曼光谱发具有灵敏度高，所需样品浓度低，反映结构信息量大等特点。药物与DNA的嵌插作用可以引起其RRS的却色性，即拉曼光谱峰强度的变化；而DNA沟槽键合的药物，不仅能引起其RRS的缺色性，而且光谱还会产生频移。由于共价键联的药物的RRS无缺色性，因此可以把RRS的缺色性作为区分插入作用、共价键联和沟槽作用的依据21。 表面增强拉曼光谱法（surface-enhanced ramam spectroscopy）技术灵敏度高，对于电化学及气相环境界面的现场表面振动光谱识别具有其独特的优点及指纹印迹能力，是进行药物及金属配合物与靶标物作用研究的有效手段之一22。 红外光谱法：二十世纪初人们进一步系统地了解了不同官能团具有不同红外吸收频率这一事实。通过图谱解析可以获取分子结构的信息。任何气态、液态、固态样品均可进行红外光谱测定，这是其它仪器分析方法难以做到的。由于每种化合物均有红外吸收，尤其是有机化合物的红外光谱能提供丰富的结构信息，因此红外光谱是有机化合物结构解析的重要手段之一。红外光谱最重要的应用是中红外区有机化合物的结构鉴定。通过与标准谱图比较，可以确定化合物的结构；对于未知样品，通过官能团、顺反异构、取代基位置、氢键结合以及络合物的形成等结构信息可以推测结构。1.3.2 黏度测定方法(Viscosity)在缺少晶体结构资料的情况下，黏度测定是检测配合物与DNA是否以插入结合的最有效的方法，其结果比光谱数据更具说服力。小分子与配体形成的配合物通过经典插入方式与DNA作用时，DNA相临碱基对的距离会变大以容纳插入配体，导致DNA双螺旋伸长，DNA溶液的黏度增加；当以静电、沟槽结合等非插入方式与DNA作用时，DNA溶液的黏度无明显变化；以部分插入方式与DNA作用时，则可能使DNA双螺旋发生扭结，使其黏度减少23。1.3.3 序列凝胶电泳及足印迹分析技术(foot printing)序列凝胶电泳及足印迹分析技术是生物学中用来研究DNA 与其它分子相互作用最基本的两种手段。凝胶电泳可以考察DNA 剪切或其它分子与DNA 螺旋共价结合留下的永久性“痕迹”, 研究其它分子与DNA 作用的序列特异性; 而对于多数与DNA 发生非共价结合分子来说, 足印迹法及转录足印迹法是确定其结合位点的比较好的实验方法, 其中转录阻断的方法更易判断序列特异性较高的药物结合位点。1.3.4 磁共振法（nuclear magnetic resonance NMR）磁共振法开创了研究小分子配合物键合DNA的新阶段。NMR能表征药物与DNA作用时磁共振光谱中峰形状和化学位移的改变，两者作用时药物的构型和动力学性质的变化，同时能得到药物键合类型和反应基团等信息。1.3.5.电化学法（electrochemistry analysis）采用电化学方法研究其它分子与DNA 的相互作用, 虽然在一定程度上受分子电活性与否的限制, 但对于一些吸收光谱比较弱, 或由于其电子跃迁谱带与DNA 的发生重叠而无法用诸如紫外-可见等方法来研究的分子, 却有可能用直接或间接伏安法方便地进行研究. 尤其是对于一些主要通过静电结合模式与DNA 作用的分子, 采用表面电化学方法可获得许多其它方法无法得到的信息. 基于DNA 修饰电极发展起来的表面电化学方法 , 具有简便、可靠、用量少等优点. 仅用3 15 Lg的DNA 即可获得许多相互作用的热力学及动力学参数. 而常规的溶液电化学方法, 需用数百毫克的DNA , 并且一些参数无法得到. 最近我们还以C60为对象, 用电化学方法研究了非电活性分子与DNA 的相互作用, 拓展了电化学方法在其它分子与DNA 相互作用研究中的应用。常用的电化学研究方法有：极谱和伏安分析法、电位法、阻抗法、电化学发光法（ECL）等。1.3.6.其他方法： 除了上述方法外, X 射线晶体衍射、平衡渗析、激光光谱、pH滴定、DNA解旋技术、微热量法、微孔滤膜碱洗脱法、傅立叶红外光谱法、二维傅立叶转换法、细胞呼吸法等方法也用来研究配合物与DNA的相互作用。一般，药物与DNA相互作用的研究同时采用多种方法，相互补充，相互印证，而不是仅仅靠一种方法。 1.4 拟解决的问题 希望能够通过研究药物小分子与小牛胸腺DNA的作用模式来进一步掌握以DNA为作用靶的抗癌药物的作用机理，同时能够设计改变诸多有毒害作用药物的结构，改善其弊端.1.5 立题依据 发展高效、低毒的抗癌药物一直是药物化学家追求的目标。抗癌药物与DNA 相互作用的研究是认识癌症的致病机制和药物的治病机理的基础，在阐明DNA结构和功能方面也具有重要意义。核酸的分子识别研究在抗癌药物设计方面有其特殊的意义，以DNA 或RNA 为靶点的药物设计已经成为药物化学非常重要的研究领域之一。有机锗化合物具有广谱抗癌活性和低毒副作用，引起了药物化学家的极大兴趣，成为寻找高效低毒抗癌药物的重要领域。尽管国内外学者合成了大量有机鍺化合物，进行了多方面的抗癌活性研究，取得了许多有意义的成果，但至今尚未出现临床应用的高效低毒的有机鍺抗癌新药，分子结构与抗癌活性关系及抗癌作用机理仍不清楚。本论文通过研究有机锗化合物与DNA的相互作用，目的探索它们之间的作用模式，有助于揭示有机锗化合物的抗癌作用机理，为合成高效低毒的抗癌药物提供理论依据。2 实验部分21 实验材料211 仪器仪 器厂 家型 号低速离心机北京医用离心机厂LD4-2A高速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司H-1650电热真空干燥箱北京化玻联医疗器械有限公司Z系列干燥器四川蜀玻集团有限公司可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司UV754NF-4500荧光光谱仪日本日立公司5J2-003超声波细胞粉碎机上海新芝生物技术研究所JY92-微量移液器上海安亭微量进样器厂D2220006电子分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司BS224S212 试剂试剂名称生产厂家级别有机锗化合物本研究室合成小牛胸腺DNA(CTDNA)美国Sigma公司A. R二氧六环天津市天河化学试剂厂A. R浓盐酸济南试剂总厂A. R乙醇莱阳经济技术开发区精细化工厂A. R丙酮烟台三和化学试剂有限公司A. R磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司A. R磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司A. REDTA盐（乙二胺四乙酸二钠）江苏徐州试剂二厂A. R酚氯仿中国医学科学院生物工程医学研究所A. R溴化乙锭（EB）上海生化研究所A. R22试剂和样品处理2.2.1有机锗化合物 选用的有机锗化合物的结构式如下： 所有实验均在BPE缓冲溶液（BPE buffer：6mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4, 1mM EDTA, pH 7.0）中进行。上述有机锗化合物（GN1和GN2）溶于BPE缓冲溶液中，最后达到要求的浓度，为保证化合物充分水解成单体，使用前应放置20小时以上（随时测定溶液的吸光度，直到其不再变化为止）。2.2.2小牛胸腺DNA（CT DNA）的制备从SIGMA公司购得的小牛胸腺DNA，按文献方法破碎和纯化24，：首先配置500毫升BPE缓冲溶液，具体方法是分别取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）钠盐6毫摩尔、2毫摩尔、1毫摩尔溶于蒸馏水中，调节其Ph值在7.0左右。将小牛胸腺DNA从冰箱中取出后，带上洁净透明的手套，将成团的小牛胸腺DNA撕成细条状，再用手术剪将细条剪成均匀片段，置于已配好的BPE缓冲溶液中，缓缓振摇使其全部浸润于缓冲液中，密封，置于暗处让其充分溶解约48小时后，再置于0的冷藏箱中以防其变性。利用JY92-型超声波细胞粉碎机对溶解在BPE缓冲液中的DNA进行超声破碎，在冰浴0，功率240瓦，脉冲4S,超声破碎时间30S的条件下超声破碎了9次，其中每次破碎间隔时间为35分钟，因为超声处理时，DNA被切断无需再加DNA酶I，超声时产生大量的热，故需在冰水浴中间断进行。预期的效果是破碎后DNA片段在200800bp的范围内。破碎完成后，从外观判断：超声前是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈；液体的粘滞性：超声后溶液从枪头滴下不粘连。将经过超声破碎的小牛胸腺DNA用酚氯仿（酚：氯仿：异戊醇 25：24:1）提取，将DNA与酚氯仿等体积混合并不停振荡，使其中的蛋白质等成分酚氯仿的作用下变性，静置2小时。再用高速离心机离心（5000r/min,离心10 min），离心完毕后，可看出上层为透明液体，中间为变性蛋白质，下层为酚氯仿提取的各种杂质，取上清液，置于冷藏箱中保存。经紫外吸收光谱测定，CTDNA的A260/ A2801.9，说明样品中已不含蛋白，CTDNA的浓度（以碱基对表示）由260nm处的吸光值计算得出（260 = 12824 cm-1M-1）。2.3 紫外可见吸收光谱（UV-Vis）UVVis实验在普析TU1901 UVvis 分光光度计上完成。测定时，控制有机锗浓度为25M（2.510-5M），以不加药物的含相同浓度DNA的溶液为参比，观察药物的吸光值随滴加的DNA量的变化。2.4荧光光谱及荧光滴定化合物的荧光及滴定在日本日立公司F-4600荧光光谱仪上于室温下完成。固定有机锗药物的浓度，逐渐滴加CTDNA，记录药物的荧光光谱。所有实验均在BPE缓冲溶液中进行。GN-1和GN-2, ex = 294nm, 狭缝宽度5nm，em（max）456nm。 荧光滴定数据经最小二乘法拟合处理得到结合常数25, 26。3 结果与讨论3.1紫外可见吸收光谱（UV-Vis）DNA 加入后，视其与药物不同的结合模式，会对药物的电子结构产生微扰， 进而使吸收光谱发生变化， 因而吸收光谱法是检验配合物与DNA 结合的一种常用而又简便的方法，由加入DNA前后药物的紫外可见吸收光谱的变化，可以判断药物DNA的结合方式。图1为GN-1和 GN-2在CT-DNA滴加前后的UV-Vis光谱。可见2种化合物的UVVis均发生了不同程度的减色效应和红移。减色现象被认为是由于DNA碱基和药物生色团之间的*电子堆积，使后者*空轨道上也有一定的电子填充，从而使电子跃迁的几率减小，而这种电子相互作用的大小与药物生色团与DNA碱基对的距离有直接关系，由于药物小分子插入到DNA碱基对之间，并造成*电子重叠，影响了药物小分子的吸收，同时使药物小分子的电子能级减小，因而其吸收向长波方向移动（红移）。当CCT-DNA/Cdrug由0逐渐增大为30时，GN1的最大吸收波长由227nm红移到232nm，增加5nm，最大吸光值由0.55较弱为0.46，降低16；而对于GN2，最大吸收波长由229nm红移到231nm，增加2nm，最大吸光值由0.92较弱为0.78，降低15。图1 GN-1和 GN-2在滴加CT-DNA前后的Uv-Vis光谱（Cdrug2.510-5M, BPE 缓冲液, 室温）通过上述分析，我们认为2种有机锗化合物可能通过插入方式与DNA发生作用。3.2荧光光谱（Fluorescence）我们测定了上述2种化合物的荧光以及滴加DNA后的相对荧光强度变化，以进一步考察化合物与DNA的结合强度。对于GN-1和GN-2，本身荧光较强，加入DNA后荧光则显著降低。图2和图3分别示出了滴加CT-DNA前后，药物GN-1和GN-2的荧光光谱，图4和图5则为GN1和GN2的相对荧光强度随Log C CT-DNA 的变化曲线。图2 GN-1用CT-DNA滴定时的荧光光谱（Cdrug = 1M, BPE buffer，room temperature，ex = 294nm） 图3 GN-2用CT-DNA滴定时的荧光光谱（Cdrug = 1M, BPE buffer，room temperature，ex = 294nm） 图4 GN-1的相对荧光强度随Log C CT-DNA 的变化曲线 图5 GN-2相对荧光强度随Log C CT-DNA 的变化曲线GN-1 (110-6M)GN-2 (110-6M)CCTDNA(E-6M)FCCTDNA(E-6M)F1E-30.00150.0030.0060.010.0150.030.040.060.10.150.30.611.53610153060100150300600100041.7443.643.4442.2842.9842.943.7642.5643.442.942.8540.4839.9739.2738.1736.4134.4231.0628.624.6721.0119.2118.4618.3517.9217.721E-30.00150.0030.0060.010.0150.030.040.060.10.150.30.611.5361015306010015030060010001200150035.2835.0135.1634.7834.7934.7234.6134.6734.6334.3534.534.2234.3134.3234.3934.0933.9433.3332.5331.5929.8827.3524.0420.1116.9515.615.3715.16表1列出了CTDNA荧光滴定GN1和GN2时的有关数据。表1 CT-DNA荧光滴定GN-1和GN-2的相关数据 5nm slit, ex=294nm; F为相对荧光强度对以上滴定数据进行处理，得到GN-1，GN-2CT-DNA的结合常数，分别为 9.51104 M 和 2.28104M。不含甲基的化合物与DNA的结合常数明显大于含甲基的化合物；说明甲基的存在不利于化合物与DNA的插入结合。3.3药物对溴化乙锭(EB)的荧光强度的影响为了进一步确认有机锗化合物与小牛胸腺DNA的插入结合方式,我们研究了有机锗化合物对溴化乙锭(EB)荧光强度的影响。EB作为典型的DNA插入试剂，被用来研究药物小分子与DNA的相互作用。与DNA结合后, EB的荧光强度显著增强（图6所示），加入有机锗药物，EB的荧光强度逐渐减弱，说明药物同EB相似，与DNA发生插入结合，而使EB脱离DNA，造成其荧光强度的减弱。 图6 EB的荧光变化曲线（ex=525nm;em=540-640nm；狭缝宽度5nm；电压700V）4结论我们选取了有机锗二元化合物，应用紫外吸收光谱（UVVis）荧光光谱（Fluorescence）和用溴化乙锭作探针等方法，研究了它们与CT-DNA相互作用；得出了以下2点结论：1、研究的有机锗二元化合物（GN-1，GN-2）是以插入结合方式与CTDNA发生作用，不含甲基的化合物与DNA的结合常数明显大于含甲基的化合物。2、研究的有机锗化合物，由于引入了有机基团，它们与DNA发生明显的相互作用，很可能改变原有的有机锗倍半氧化物的抗癌作用机理，而产生直接细胞毒作用，相信有机锗链和引入的活性基团之间会产生协同作用，提高整体的抗癌活性。5参考文献1 沈同, 王镜岩等，生物化学（第2版）. 北京:高等教育出版社,1990, P1-56.2 Devan, P.B. 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