NY∕T 4180-2022 梨火疫病监测规范.pdf

2022?11?11发布2023?03?01实施梨火疫病监测规范16中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.020.01CCS B41802022Specification for surveillance of fire blight of pear中华人民共和国农业农村部发 布N T/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出.本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(T C )归口.本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、新疆维吾尔自治区植物保护站、甘肃省植保植检站.本文件主要起草人:冯晓东、胡白石、李潇楠、王晓亮、姜培、陈冉冉、田艳丽、王俊、胡琴.N T/T 梨火疫病监测规范范围本文件规定了梨火疫病的田间监测原理、区域及植物、时期、方法、诊断、报告、样品与菌株的保存处理等.本文件适用于梨火疫病的田间监测.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 植物有害生物调查监测指南G B/T 植物有害生物发生状况确定指南术语和定义下列术语和定义适用于本文件 梨火疫病 f i r eb l i g h t o fp e a r由梨火疫病菌E r w i n i aa m y l o v o r a(B u r r i l l,)W i n s l o we ta l,引起的病害.梨火疫病菌E r w i n i aa m y l o v o r a(B u r r i l l,)W i n s l o we ta l,属原核生物界P r o k a r y o t a e,变形细菌门P r o t e o b a c t e r i a,变形细菌亚纲(A l p h a P r o t e o b a c t e r i a),肠杆菌目(E n t e r o b a c t e r a l e s),欧文菌科(E r w i n i a c e a e),欧文氏菌属(E r w i n i a),解淀粉欧文氏菌(E r w i n i aa m y l o v o r a),是危害梨、苹果、杜梨、山楂、海棠、榅桲等蔷薇科植物的检疫性有害生物.原理梨火疫病的田间症状,致病菌的生理生化反应、致病性测试和分子生物学反应特征等,是监测、检测与鉴定的重要依据.区域及植物梨火疫病发生区及传入风险高的未发生区.发生区重点监测有代表性果园和边缘区果园,未发生区重点监测寄主植物采穗圃和苗圃、与发生区相邻的周边果园等.监测调查植物包括梨、苹果、杜梨、山楂、海棠、榅桲等蔷薇科果树、砧木等.时期每年月月,重点在果树落花期到果实膨大中期病害发生、危害症状明显时期,尤其是雨后或浇水后.方法 访问调查向当地植保员、农技员、果农等相关人员询问调查梨、苹果等梨火疫病寄主植物种植和病虫害发生情况,应重点关注苗木来源果园有无梨火疫病疑似症状(附录A)及其发生地点、发生时间、危害情况等信息,N Y/T 判断是否存在可疑发生区.每年至少在花期和幼果期各调查次.踏查对访问调查过程中发现的可疑发生区和其他有代表性的梨、苹果等种植田块进行踏查,观察田间有无梨火疫病发病症状,见附录A.踏查发现可疑病害症状立即进行标记,对疑似病株先照相后取样,样品进行实验室鉴定.重点监测 基本要求对传入风险高的果园、采穗圃或苗圃进行重点监测,在监测时期每 d调查次,按以下取样方法进行重点监测,发现疑似症状的,应取样进行实验室鉴定.果园果园面积小于 亩的设置个调查点,面积不少于亩,采取随机或平行线法调查,调查株数不少于 株;果园面积大于 亩,调查点面积原则上不少于总面积的,每个调查点的调查株数不少于总株数的.采穗圃和苗圃逐行逐株调查.定点监测对于发生区,应选择有代表性的果园(采穗圃和苗圃)进行定点调查.采用点取样法,每个点随机调查不少于 株,统计病株率.诊断 田间初判主要检查嫩梢、花、果和枝干,与梨火疫病的典型症状进行比较,也可采用梨火疫病菌快速检测试纸条做初筛,符合典型症状或快速检测结果为阳性的可初步判定并送实验室鉴定.采集样本装在牛皮信封内,样本信息按照附录B填写.实验室鉴定按照附录C执行.记录实验室鉴定结果,按照附录D填写.监测报告按照附录E填写,植物检疫机构对监测结果进行整理汇总形成监测报告.样品与菌株的保存处理样品应在条件下保存个月,其中梨火疫病样品应保存不少于个月,保存期满后,应经灭活处理.亩为非法定计量单位,亩/公顷.N T/T 附录A(资料性)梨火疫病典型症状A 开花期花腐症状.花腐初期为水渍状病斑,花基部或花柄呈暗色,逐渐变褐色或黑褐色,不久萎蔫.病菌可由单朵花扩展至花梗及花簇中其他的花.在温暖潮湿的条件下,花梗上会有菌脓渗出.A 果实膨大期重点调查嫩梢、枝干、果实症状.嫩梢受侵染的最初症状是梢表皮发黑,后叶片、枝尖萎蔫,但萎蔫前不褪色,呈“牧羊鞭”状,潮湿时,枝条、叶柄上出现菌脓,几天内即可造成整枝的死亡.随着病菌不断深入和侵染主干,皮层收缩、下陷,会形成溃疡斑.幼果在感病初期果实呈水渍状,湿度大时可见大量乳白色至褐色的菌脓,发病后期变黑褐色,呈僵果状.A 苗期重点调查嫩梢是否出现萎蔫枯死,枯叶不落的“牧羊鞭”症状.嫩梢、叶片、花器、幼果、枝干症状见图A 图A .图A 嫩梢叶片症状N Y/T 图A (续)图A 花器症状图A 幼果症状N T/T 图A 枝干症状N Y/T 附录B(规范性)样品采集记录表样品采集记录表见表B .表B 样品采集记录表采样机构:采样时间:采样人:编号采样地点作物种类作物品种作物生育期采样部位发病症状发病面积亩备注 N T/T 附录C(规范性)梨火疫病菌实验室鉴定方法C 免疫学检测采用商品化E L I S A试剂盒进行检测,按照产品说明书进行操作及结果判定.若检测结果为阴性,判定为未检出梨火疫病菌.若检测结果为阳性,且有典型症状,判定为检出梨火疫病菌;若检测结果为阳性,而症状非典型,应进行分离培养及致病性测定鉴定.C 分子生物学检测根据实验室条件,可选择P C R凝胶电泳检测、实时荧光P C R检测等.C P C R凝胶电泳检测C P C R引物序列(表C )表C P C R引物序列引物序列目标p E A A C G G T T T T T AA C G C T G G G p E A B G G G C AAA T A C T C G GA T T p E A 质粒C P C R反应体系及扩增条件 L反应体系:P C R反应预混液 L,上游引物(m o l/L)L,下游引物(m o l/L)L,模板L,补充超纯水至 L.P C R反应程序:m i n,m i n,m i n,m i n,个循环;m i n;保存.C 琼脂糖凝胶电泳P C R产物用 琼脂糖凝胶进行电泳,电泳结束后,凝胶成像系统观察、拍照.扩增产物片段为 b p.结果判定:在阳性对照在预期大小位置产生明显条带,阴性对照和空白对照在预期大小位置未产生条带的情况下,如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性;如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性.C 实时荧光P C RC 实时荧光P C R引物及探针序列根据实际情况选择引物和探针,实时荧光P C R引物及探针序列见表C .表C 实时荧光P C R引物及探针序列序号引物或探针序列E a l s c F C G C T AA C A G C A GA T C G C A E a l s c R AAA T A C G C G C A C GA C C A T E a l s c PF AM C T GA T AA T C C G C AA T T C C A G GA T G B HQh p E a F C C G T G GA GA C C GA T C T T T T A h p E a R AA G T T T C T C C G C C C T A C GA T h p E a PF AM T C G T C GAA T G C T G C C T C T C T MG BC 实时荧光P C R反应体系及程序N Y/T L反应体系:P r e m i x L,引物(m o l/L)各L,探针(m o l/L)L,模板L,补充超纯水至 L.实时荧光P C R反应程序:第一个循环为 m i n;随后 个循环,s,m i n.注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整.C 结果判定在阳性对照C t,阴性对照和空白对照的C t 前提下:如果检测样品的C t 时,则判定为阳性;如果检测样品的C t 时,则判定为阴性;如果 C t 时,增加模板用量倍倍再次测试,C t,判定为阳性;其余情况判定为阴性.检测结果若为阴性,判定为未检出梨火疫病菌.若检测结果为阳性,且有典型症状,判定为检出梨火疫病菌;若检测结果为阳性,而症状非典型,应进行分离培养及致病性测定鉴定.C 分离培养鉴定将制备样品悬浮液或样品富集培养液,在L B培养基平板上划线分离,菌落白色,较大而凸起,光滑呈透镜状.在 恒温培养 h h,挑取可疑单菌落进行纯化,转接次次,随后进行致病性测定、B i o l o g鉴定、免疫学或分子生物学鉴定.C B i o l o g鉴定利用B i o l o g微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定,按照产品说明书进行操作及结果判定.C 致病性测定根据实验室条件,可选择杜梨苗、梨苗、未成熟梨幼果或梨嫩枝梢接种试验,进行致病性测定.N T/T 附录D(规范性)植物有害生物样本鉴定报告植物有害生物样本鉴定报告见表D .表D 植物有害生物样本鉴定报告样品编号植物名称品种名称植物生育期样品数量取样部位样品来源送检日期送检人送检单位联系电话鉴定方法:鉴定结果:备注:鉴定人(签名):审核人(签名):鉴定单位盖章:年月日注:本单一式三份,检测单位、受检单位和检疫机构各一份.N Y/T 附录E(规范性)梨火疫病田间调查记录表梨火疫病田间调查记录表见表E .表E 梨火疫病田间调查记录表调查机构:调查时间:调查人:编号调查地点作物生育期种植面积亩调查面积亩发生面积亩调查株数株发病株数株病株率备注 注:备注栏可填写田间症状描述、抽样检测情况等信息.