苹果g蛋白偶联受体mdgcr1基因的克隆及遗传转化.doc

山東農業大學

学 士 学 位 论 文

苹果G蛋白偶联受体MdGCR1基因的克隆及遗传转化
Cloning and genetic transformation of MdGCR1 gene of apple G protein coupled receptor

学生姓名
：

专业班级
：
2012级园艺五班
学号
：
20125772
学院
：
园艺学院
指导教师
：

2016年 5 月 29日

目 录
中文摘要 1
1前言 1
2材料与方法 2
2.1.1植物材料及仪器 2
2.1.2菌株及载体 2
2.1.3培养基 2
2.1.4酶、试剂 3
2.1.5引物 3
2.1.6溶液和缓冲液 3
2 .2试验方法 4
2.2.1CTAB法提取RNA 4
2.2.2Trizol法提取RNA 4
2.2.3RNA含量与纯度检测 5
2.2.4植物RNA纯化（除DNA）方法 5
2.2.5反转录cDNA第一链的合成 6
2.2.6基因扩增 6
2.2.7PCR产物的回收 6
2.2.8连接反应 6
2.2.9大肠杆菌感受态细胞的转化 7
2.2.10农杆菌感受态细胞的制备 7
2.2.11电击法转化农杆菌 7
2.2.12质粒DNA的提取 8
2.2.13质粒DNA的酶切 8
2.2.14表达载体的构建 9
2.2.15转化烟草 9
2.2.16植物基因组DNA的提取 10
2.2.17基因组DNA含量与纯度检测 10
3结果与分析 10
3.1苹果MdGCR1基因的克隆及进化树分析 11
3.2MdGCR1的表达分析 11
3.3苹果MdGCR1基因植物过表达载体的构建及获得转基因烟草 12
4讨论 13
5参考文献 14
6致谢 15

中文摘要
以‘嘎啦’（Gala）苹果为材料，采用同源克隆和 PCR技术分离得到苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1。系统进化树分析显示，苹果MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近，同源性最高。基因表达分析显示MdGCR1主要在根、茎和叶中表达，在花和果实中的表达量相对较低；构建了MdGCR1植物过表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1基因的烟草过表达株系。这为深入揭示G蛋白偶联受体基因在植物逆境响应过程中的作用机制提供技术基础。
关键词：苹果；G蛋白偶联受体；MdGCR1
1前言
G蛋白（G protein）全称为GTP结合调节蛋白（GTP binding regulatory protein），又称偶联蛋白或信号转换蛋白,在细胞膜上受体接受胞外信号与膜内侧效应酶产生产生胞内信号之间，在信号传导中起着重要作用（Ji et al., 1998; Burg et al., 2015）。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）能感应胞外信号并将信号传递给G蛋白，后者又将信号传递到下游相应的效应器（Albert androbillard, 2002; 郭志云 等，2004）。
植物GPCRs介导的G蛋白信号转导途径是一种非常保守的信号机制，在植物生长发育中发挥重要作用（Jacoby et al., 2006）。GPCRs广泛存在于真核生物中，是已知最大的一类细胞表面受体（Lee et al., 2001; Pin et al., 2003）。GPCRs种类很多，但具有相似的蛋白结构，通常都是一条包含7个跨膜结构域的多肽链（Liebmann et al., 2004）。其肽链由N末端和C末端组成。N末端在细胞外，包含有7个跨膜α螺旋，反复穿过细胞膜的脂双层，常常被糖基化修饰；C末端在细胞内，有3个胞外环和3-4个胞内环组成，常常发生磷酸化修饰（Pin et al., 2003）。G蛋白偶联的信号传导系统由G蛋白偶联受体GPCRs、异三聚体G蛋白（αβγ三亚基）和效应器组成。当植物受到外界刺激时，细胞膜上的GPCRs受体与信号分子结合并活化，促使Gα-GDP转换成Gα-GTP，同时使异源三聚体-G蛋白复合体解离，通过Gα、Gβ或者Gβγ将信号传递给下游的效应器，最终引起一系列的生理生化应答反应（Urano et al., 2013）。研究表明，GPCRs能够参与植物激素和抗逆反应，并在多种发育过程中发挥调节作用。Dymock等（1998）首先发现拟南芥GCR1基因失活将导致植株的根、茎对细胞分裂素不敏感，根、子叶和叶片的伸展受到抑制。Pandey和Assmann（2004）证明GCR1与GPA1偶联，调控ABA信号通路。最近，又有报道表明，拟南芥GCR1参与多种生物和非生物胁迫响应，并在磷酸盐饥饿响应中发挥重要作用（Chakraborty et al., 2015）。水稻GPCRs研究较少，研究显示，编码G蛋白亚基的基因突变会导致植株矮化（Oki et al., 2009），周宇科等（2011）也证明超量表达水稻OsGPCR的植株对赤霉素反应更敏感。这些研究结果表明G蛋白偶联受体在植物生长发育、激素应答以及抗逆反应中发挥关键作用，但是G蛋白偶联受体的作用机制仍不清楚（Temple and Jones, 2007; Trusov and Botella, 2012）。
目前G蛋白偶联受体的研究主要集中在拟南芥、水稻等草本植物中，作为木本植物中重要的模式植物，G蛋白偶联受体在苹果中的功能研究尚未报道。为探明G蛋白偶联受体在苹果生长发育中的作用，本实验采用同源克隆的方法克隆了苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1，成功构建了MdGCR1超量表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1基因烟草。
2 材料与方法
2.1植物材料及仪器
本实验所用到的植物材料有“嘎拉”（Malus×domestica ‘Gala’），烟草（Nicotiana benthamiana）。嘎啦果实以及检测MdGCR1基因表达所用的组织包括生长根、幼茎、新生叶、初花时的花和花后30天的幼果，都取自栽种在山东农业大学南校区国家苹果工程中心的果树。
实验仪器：天平、恒温水浴锅、恒温金属浴、BioRad PCR仪、农杆菌转化专用电穿孔仪、SDS-PAGE设备、电泳设备、无菌台、摇床、高温灭菌锅、离心机、烘箱等。
2.1.2菌株及载体
本实验所用的菌株为大肠杆菌DH5α，农杆菌为LBA4404，载体为pMD18-T和pCAMBIA 1300。
2.1.3 培养基
LB培养基成分：
成分
比例
用量（g/L)
胰蛋白胨（Tryp Tone)
1.0%
10
氯化钠(Nacl)
1.0%
10
琼脂粉Agar（固体）
1.5%
15
酵母提取物(Yeast Extrhq)
0.5%
5
MS培养基
成分
用量（g/L)
蔗糖
30
MS
4.74
琼脂粉（Agar powder）
7.5
YEP培养基成分：
成分
比例
用量（g/L)
胰蛋白胨（Tryp Tone)
1.0%
10
氯化钠(Nacl)
0.5%
5
琼脂粉Agar（固体）
1.5%
15
酵母提取物(Yeast Extrhq)
1.0%
10
抗生素
氨苄青霉素 （Ampicillin）
100 mg/ml
卡那霉素 （Kanamycin）
50 mg/ml
利福平 （Rifampin）
25 mg/ml
2.14 酶、试剂
限制性内切酶（BamH I、EcoR I）、Easy Taq酶、T4 DNA ligase、DNA Maker DM2000及质粒回收试剂盒、PCR回收试剂盒（PCR Fragment Recovery Kit）、反转录试剂盒购自宝生物（大连）公司、Trizol试剂盒为Invitrogen公司产品、Tris Base、DEPC等DNA和RNA提取试剂为上海生物工程公司试剂、质粒抽提试剂盒为UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒，购自上海生物工程公司、Amp、PVP 、β-巯基乙醇、CTAB、Kan、DEPC、EB、琼脂粉、SDS、Tris、EDTA-Na2·2H2O、琼脂糖等为进口分析纯试剂，购于上海生物工程公司、国产分析纯试剂有：NaOH、浓盐酸、异戊醇、硫酸、氯仿、NaCl、水饱和酚、CaCl2、无水乙醇、异丙醇等。
2.1.5 引物

2.1.6溶液和缓冲液
2×上样缓冲液：0.25 M Tris-HCl， pH 6.8，4% SDS，20%甘油，痕迹量溴酚蓝
乙酰丁香酮：浓度为100 mM，在二甲基亚砜 （DMSO）中溶解
拟南芥侵染液：侵染液加入5%蔗糖，0.03-0.05% Silwet L-77
质粒提取溶液的配制：
（1）STE缓冲液：包括0.1M NaCl，10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA。
（2）Solution I包括50 mM Glucose，25 mM Tris-Cl（pH8.0），10 mM EDTA（pH8.0）。灭菌后，4℃保存。
（3）Solution II包括0.2 M NaOH，1%SDS。需新鲜配制。
(4)Solution III（100 mL）包括5 M KAC 60 mL，HAC 11.5 mL，ddH2O 28.5 mL。-20℃保存。
(5)TE溶液包括10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA。
2.2 实验方法
2.2.1 CTAB法提取RNA
本实验步骤均需在冰上进行。
1）取5g左右新鲜材料，放入提前处理好的无RNA酶的研钵中，液氮研磨后放入预先冷冻的50ml 离心管中。
2）将提取液预热到65℃，加入10ml预热好的提取液，涡旋均匀后，放入65℃水浴锅中30分钟；CTAB法RNA提取缓冲液：25 mmol∙L-1 EDTA（pH=8.0）、2%（w/v）CTAB、100 mmol∙L-1 Tris-HCl（pH=8.0）、2%（v/v）β-巯基乙醇、2%（w/v）PVPK30、2.0 mol∙L-1 NaCl。
3）水浴之后加入等体积10ml水饱和酚和氯仿异戊醇（24:1），振荡30分钟，之后4℃离心机里、12，000 rpm条件下，离心15 min；取上清液，加入等体积10ml水饱和酚和氯仿异戊醇（24:1）再抽提一次。
4）取上清，加入1/5体积4℃预冷的10 mol/L LiCl，4℃放置过夜。
5）4℃离心机，12000 rpm条件下，离心20 min，弃去上清，70%乙醇洗涤两次。
6）配制SSTE缓冲液1 mol/L NaCI、10mmol/L EDTA、0.5%（w/v）SDS用DEPC处理过的水定容到10 ml。
7）500 μl SSTE溶解沉淀，加入1.5 ml的离心管中，放在冰上，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1，250 μl）和水饱和酚（250 μl）提取，离心10min，4℃、10，000rpm。
8）取上清液，加入2.5倍体积的4℃放置的无水乙醇，-80℃沉淀1-2小时。
9）用70%乙醇洗涤2次。
10）4℃离心机，12000 rpm条件下，离心15 min，风干二到三分钟，加入30μl DEPC处理水溶解RNA
11）存放于-80℃。
2.2.2 Trizol法提取RNA
利用Trizol试剂盒提取苹果王林愈伤组织RNA，具体方法如下：
1）在1.5 mL Eppendorf 管中加入1 mL的Trizol试剂。
2）称取约100 mg的植物材料，液氮研磨，转至上述Eppendorf管中。漩涡震荡混匀，室温静置5 min。
3）去除蛋白、脂肪，离心12000g，10min，4℃，取上清。
4）分相
A.加入200uL的氯仿，剧烈震荡15秒，在室温下静置2-3 min。
B.12000g，离心10 min（勿超过12000g），4℃。
5）沉淀、去除多糖。
6）取上清（大约原初Trizol体积的60%，约600 µL至一新的Eppendorf管中，切勿将中间杂质吸收到。
7）加0.25 mL异丙醇，0.25 mL高盐溶液，颠倒混匀，室温静置10 min。
8）离心10 min，12000 g（勿超过12000g），4℃，倾去上清。
9）清洗。离心机离心轻甩，加1mL预冷的70%乙醇漂洗沉淀。
10）离心3min，12000g，4℃。
11）吸净乙醇，37℃挥发乙醇5min。切勿干燥彻底。
12）加适量的DEPC处理的ddH2O（一般20µL），枪打数次溶解。如想彻底溶解RNA
可置于55-60℃溶解5min。迅速冰浴3min，稍离心。
13）RNA提取完成后取1mL稀释至100mL，测定OD值，计算RNA浓度。然后再取2-4mg的总RNA电泳，鉴定RNA的完整性。
2.2.3 RNA含量与纯度检测
吸取1μL总RNA溶液加入到100μL水中，混匀后，吸取1μL用Nanodrop进行测定，在A260/A280条件下测定溶液中RNA浓度（μg∙ml-1），结果乘以100得溶液中RNA浓度。
2.2.4 植物RNA的纯化（除DNA）方法
利用去DNA试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser去除植物总RNA中的基因组DNA。
1）冰上操作，在0.5ml 无RNA酶的离心管中加入如下反应体系：

5×gDNA Eraser Buffer
2μl
gDNA Eraser
1μl
Total RNA
1-2μl
RNase free ddH2O
Up to 10μl

2) 42℃反应2min。
3）4℃保存。
2.2.5 反转录cDNA第一链的合成

1）配制下列混合液：
Oligo dT Primer (50uM) [or Random 6 mers (50uM)]
1uL *1
dNTP Mixture (10mM each)
1uL
Total RNA (or Poly(A)+ RNA)
Xug
RNase free ddH2O
up to 10ul
2） PCR仪上进行如下的反应：65℃，5min，然后放到冰上急冷。
3） 在反应完的体系中继续配制另一反应液。

上述变性、退火后反应液
10uL
5×PrimeScriptTM Buffer
4uL
RNase Inhibitor (40 U/ul)
0.5uL
PrimeScriptTM RTase (200 U/ul)
1uL
RNase Free ddH2O
4.5uL
Total
20uL
4）在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：
30℃ 10min；42℃(50℃)，60min；70℃，15min；4℃。稍离心，保存于-20℃。
2.2.6基因扩增
使用25µL反应体系，具体如下：cDNA模板1-2µL；10´PCR buffer（含Mg2+）2.5µL；dNTP（2.5mM）2µL；上游引物F（10µM）和下游引物R（10µM）各1µL；Easy-Taq酶0.25µL；ddH2O补齐至25µL。
反应体系应根据引物的退火温度以及目的片段的长度来设定。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增条带是否为目的条带，大小合适切胶回收。
2.2.7 PCR产物的回收
在实验中目的片段的回收利用试剂盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit
1）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳时使用新鲜的电泳缓冲液，在紫外线照射下快速切胶，置于离心管中；
2） 将500μl Buffer GM加入离心管中，室温放置融化胶块，期间应不间断震荡，以使胶块融化；
3） 胶块完全融化后，观察期颜色，若是溶液呈橙色或粉色，则加入10μl 3M醋酸钠溶液，使溶液恢复为黄色；
4） 将Spin Column安置在Collection Tube上；
5） 将融化好的溶液转移到上述Spin Column中，12，000rpm离心1min；
6） 将离心下的液体重新倒入Spin Column中进行再次离心，12，000rpm离心1min后弃废液；
7） 加入700μl GW在12，000rpm条件下离心1min；
8） 重复上述过程；
9） 将废液弃掉，干燥1-2min；
10）12，000rpm条件下离心1min。
2.2.8连接反应
将目的基因连接到pMD18-T载体。pMD18-T载体来自Takara，插入片段与载体的摩尔数比为5-10:1，将反应体系混匀，置于16℃水浴锅中反应过夜连接，然后4℃保存。

切胶回收产物
2.0mL
Solution I
5.0mL
pMD18-T Vector（50 ng）
1.0mL
ddH2O
2.0mL
总体积
10.0mL

2.2.9大肠杆菌感受态细胞的转化
1) 将大肠杆菌感受态细胞从-70℃冰箱中取出，置于冰上。
2) 在超净工作台上进行转化反应，一般回收产物3-4μl，加入大肠杆菌感受态DH5α，20-30μl， 用枪头吸打混匀。
3) 冰浴30min后42℃，1min 30s，然后重新置于冰上2min，加入LB 1ml，37℃震荡1h， 30 min。
4) 离心1min，弃上清，用灭菌枪头吸打混匀，涂在Amp或其他抗性LB固体培养基上。
5) 将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养。
6) PCR反应。
2.2.10农杆菌感受态细胞的制备
1） 在平板培养基上挑取GV3101或LBA4404的单菌落，接种于5mL YEP（50mg∙L-1利福平）液体培养基中，在28℃恒温培养箱中，大于200rpm的速度，摇床上培养8-10小时；
2） 取出1 mL培养液，加到100 mL不加抗生素的YEP液体培养基中，28℃恒温培养箱中，大于200 rpm的速度，摇床上培养，使OD600值达到大约0.9；
3） 将培养液放在冰上，冰浴，可以剧烈摇晃，小心不要将菌液摇出，在冰上放置20min左右，是菌液快速的降低温度；
4） 把菌液分装到80ml离心管中，4℃低温离心机，4000×g的速度，离心5min；
5） 弃掉上清，加入50ml预先冷却好的10%甘油，用枪头吸打，使菌体很好的悬浮。4℃低温离心机，4000×g的速度，离心5min；
6） 弃掉上清，加入25ml预先冷却好的10%甘油，用枪头吸打，使菌体很好的悬浮。4℃低温离心机，4000×g的速度，离心5min；
7） 弃掉上清，加入10ml预先冷却好的10%甘油，用枪头吸打，使菌体很好的悬浮4℃低温离心机，4000×g的速度，离心5min；
8） 弃掉上清，用10%的甘油重悬浮菌体，使菌液最终体积达到2-3ml，分装，每管中60μL的量进行分装，液氮冻融后，-70℃冰箱保存。
2.2.11电击法转化农杆菌
1）将农杆菌感受态从-70℃冰箱中取出，置于冰上。
2）将灭菌离心管置于冰上，并加入2μl质粒，然后将20-50μl农杆菌感受态与其混匀（在超净工作台上冰上操作）。将混合的液体转入电击杯中，以进行电击反应。
3）对电穿孔容器进行电击（电转移输出电压为1.8千伏）。
4） 将电转后的液体转入灭菌离心管中，加入1ml YEP，在28℃恒温震荡培养箱中震荡3h。
5） 离心1min，弃上清，用灭菌枪头吸打混匀，涂在含有利福平的YEP固体培养基上。
6） 将培养皿置于28℃恒温培养箱中培养。
7） PCR反应；
8）测序。选取阳性克隆，送样，测序由华大生物工程公司完成。
2.2.12 质粒DNA的提取
1）溶液的配制：
A. STE缓冲液：0.1M NaCl，0.01M Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA（pH8.0）。
B. Solution I：50 mM Glucose，25 mM Tris-Cl，10 mM EDTA。灭菌后，4℃保存。
C. Solution II：0.2M NaOH，1% SDS。需现用现配。
D．Solution III（100mL）：5 M KAC 60mL，HAC 11.5mL，ddH2O 28.5mL。
E. TE：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA。
2）提取步骤
a) 取1ml菌液，室温，12，000rpm离心15s，收集菌体，弃上清。重复一次。
b) 用1ml STE溶液悬浮菌体，离心，倒掉上清。
c) 加入100μl Solution I悬浮菌体，剧烈摇晃混匀。
d) 加入200μl新鲜的Solution II，上下颠倒温和混匀，室温放置3min。
e) 加入150μl冷的Solution III，上下颠倒温和混匀，室温放置5min。
f) 室温，12，000rpm离心10min，取上清，加入等体积的CI，混匀。
g) 室温离心10min，取上清加入2倍体积冷的无水乙醇，混匀，室温静置10min。
h) 12，000 rpm离心10min，弃上清。
i) 沉淀用冷的70%乙醇洗涤2次，室温干燥。
j) 适量TE溶解沉淀，-20℃保存。
2.2.13质粒DNA的酶切
酶切反应体系如下表所示：
质粒DNA
10 ´ Buffer
核酸内切酶
ddH2O
总体积
10.0µL
2.0µL
1.0µL
7.0µL
20.0µL
37℃反应2-3h，电泳观察酶切片段大小，以判断所鉴定的质粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。
2.2.14表达载体的构建
1）连接DNA的准备
根据基因序列设计特异引物，以红星果皮总RNA的反转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系如上所述，反应条件为95℃预变性5min；循环参数为95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90min，35个循环；后延伸72 ℃ 5min。PCR产物凝胶电泳，切胶回收。
将目的片段连接到pMD18-T载体上。转化DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，摇菌后测定其基因序列。
　　提取菌落质粒，酶切。反应体系在37℃温育1小时。
2）目的DNA片段的回收
将酶切产物分别凝胶电泳，切下含有目的基因的片段，回收DNA。
3）目的DNA片段连接到过表达载体
反应体系为10μL，含下列成分：

10×Buffer
1µL
目的片段
7µL
pBIN
1µL
T4 DNA Ligase
1µL
总体积
10µL

16℃反应过夜。
4）转化，PCR筛选。
5）将构建好的表达载体转化农杆菌。
2.2.15转化烟草
1）将生长一月左右的的烟草放在16/8h生长条件下，促进转化。
2）摇农杆菌，用5ml加入抗性素的培养基在28℃，180rpm条件下振荡过夜。然后，取500ul的菌液活化到50ml的液体培养基中摇至浓度OD值为0.8左右。
3）准备好材料用于侵染。
4）收集菌体，700-1000g， 常温离心5min，倒掉上清液。
5）配置浸染液，用来将菌体悬浮，使最终侵染浓度为OD值在0.8左右。
6）将侵染液侵染烟草叶片，侵染10-15sec，然后将植株在黑暗培养一天。第二天取出放到光下继续生长。根据浸染过的植株的长势，隔5-7天再浸一次。
2.2.16 植物基因组DNA的提取
1)取新鲜植物愈伤材料1g左右，放于研钵中，加入液氮，充分研磨；
2)将样品迅速转移到预先装有700ul 的65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀，然后置离心管于65℃水浴20min，期间颠倒混匀数次；
3)吸入700μl氯仿，充分混匀，12，000rpm ，离心5min；
4)将离心管中上清移入一新的tube中，加入700μl的GP2，充分混匀；
5)将上述液体用枪头吸入一个吸附柱中，13，000rpm，离心30sec，弃废液；
6)将600μl缓冲液GD加入到吸附柱中，13，000rpm 离心30sec，倒掉废液，继续将吸附柱放回原管；
7)向吸附柱中 加入600μl 漂洗液PW，12，000rpm 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回原管；
8)重复步骤7；
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm 离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干漂洗液；
10)加入TE buffer 20μl，12，000rpm 离心30sec 得总DNA。
2.2.17基因组DNA含量与纯度检测
PCR反应体系：
样品
体积
10×PCR buffer（含Mg2+）
2.5μl
dNTP
（2.5 mM）2μl
引物1-F
5μM
引物1-R
5μM
Taq酶
0.25μl
DNA
1.0μl
ddH2O
补至 25μl

PCR程序为：95℃，5 min；然后进行多个PCR循环：95℃，30 sec，56℃，30 sec，72℃，90 sec，共进行32个cycles；PCR最后设置72℃反应5min。DNA电泳，验证目的克隆。
3 结果与分析
3.1 苹果MdGCR1基因的克隆及进化树分析
RT-PCR克隆到一条大约1000 bp的条带（图1），与预期大小一致。对克隆得到的片段测序分析，结果表明，该基因片段的开放阅读框（ORF）长度为960 bp，编码319个氨基酸和一个终止子，命名为MdGCR1。这是从苹果中分离到的第一个G蛋白偶联受体基因。

图1 苹果MdGCR1基因RT-PCR扩增产物电泳
MdGCR1:MdGCR1基因扩增产物， Mark:分子量标记DM2000
Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products for cloning of MdGCR1
MdGCR1: RT-PCR products of MdGCR1, Mark: DM2000
利用MEGA5软件将苹果MdGCR1蛋白序列与梨、梅花、拟南芥、碧桃等20个不同物种的GCR1蛋白序列进行分析构建进化树。进化树分析结果（图2）显示，苹果MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近，同源性最高。

图2 苹果G蛋白偶联受体基因 MdGCR1 及其同源基因的进化分析
Fig.2 Evolution analysis of G protein-coupled receptors gene MdGCR1 in apple and its homologous
3.2 MdGCR1的表达分析
利用实时荧光定量PCR技术分析了MdGCR1基因在“嘎啦”苹果幼苗不同组织中的表达量，结果显示MdGCR1基因在根、茎和叶组织中的表达水平高于花和果实组织（图3）。

图3 MdGCR1基因在苹果不同组织中的表达分析
Fig.3 Analysis of the expression of MdGCR1 gene in different tissues of apple

苹果幼苗用NaCl、Mannitol、H2O2、ABA、MeJA处理6 h后，植株中MdGCR1基因的表达量受到诱导而增强，而用4℃低温处理6 h后，基因表达受到抑制（图4）。

图4 MdGCR1基因在不同胁迫处理和激素响应中的表达分析
Fig.4 Analysis of MdGCR1 expression in the apple in response to various stresses and hormones
3.3 苹果MdGCR1基因植物过表达载体的构建及获得转基因烟草
利用引物中引入的BamH I和Pst I酶切位点，将MdGCR1基因从pMD18-T载体切出回收，并对pCAMBIA 1300进行同样酶切，将两者在16 ℃连接，转化大肠杆菌，鉴定阳性单菌落。成功构建MdGCR1-pCAMBIA-1300植物过表达载体。其结构如图所示：

图5 35S:MdGCR1结构示意图
Fig.5 Schematic diagram of the 35S promoter: MdGCR1 construct

将构建的MdGCR1过量表达载体转化农杆菌LBA4404，将烟草叶片在菌液中浸泡，浸泡后放到黑暗环境培养，24小时后放到光下正常生长，一周后取新叶检测。半定量RT-PCR分析检测转基因株系MdGCR1基因表达，烟草L2，L4和L5转基因株系基因（图6）被鉴定出来。

图6 RT-PCR分析MdGCR1 基因在转基因烟草L2，L4, L5株系中的表达水平
Fig.6 RT-PCR analysis of the expression level of MdGCR1 in L2, L4 and L5 transgenic tobacco
4 讨论
为了适应复杂多变的外界环境，生物在进化过程中形成了一系列复杂的机制来感知外部信号，其中GPCRs介导的G蛋白信号通路作为重要组成部分参与多种代谢调控过程（金国萍 等，2012）。迄今为止，在人类和动物中已经发现有1000多种GPCRs。相对于动物界来说，目前对植物GPCRs的研究比较少（Bradford et al., 2013）。由于GPCRs序列的低保守性，从植物中分离和鉴定新的受体非常困难（Moriyama et al., 2006）。公认的来自植物中的GPCRs仅有拟南芥的GCR1，水稻中仅克隆了编码G蛋白亚基的基因，对水稻GPCRs信号通路细节的研究仍处于探索阶段。
研究显示，拟南芥G蛋白偶联受体GCR1作为重要的膜受体，调控着植物细胞对多种激素信号和外界胁迫的响应过程。Pandey和Assmann (2004)发现，拟南芥GCR1的突变体植株表现出对干旱胁迫不敏感的表型，并且失水率显著减少；Chakraborty 等（2015）也证明拟南芥GCR1突变体植株中胁迫相关基因的表达量较野生型差异明显，说明GCR1影响胁迫基因的表达。这些结果说明，G蛋白偶联受体基因在植物胁迫响应中发挥重要作用。
本研究通过分子克隆的方法，在苹果中成功克隆了一个G蛋白偶联受体基因MdGCR1。系统进化树分析显示，苹果MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近，同源性最高；基因组织表达分析显示，MdGCR1基因主要在营养器官（根、茎和叶）中大量表达，在生殖器官（花和果实）中的表达量较低。同时，研究了苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1在胁迫诱导和激素响应中的作用。基因表达分析结果表明，在NaCl、Mannitol、H2O2、4℃低温逆境处理以及ABA、MeJA激素处理后，苹果中MdGCR1基因表达量明显受到影响说明MdGCR1基因在植物逆境胁迫中发挥重要作用；4℃低温逆境处理使MdGCR1基因表达量下降，说明低温能抑制MdGCR1基因的表达，具体原因还需继续研究。为进一步研究MdGCR1基因的作用，成功构建了MdGCR1超量表达载体，并且通过农杆菌介导的遗传转化，获得了转MdGCR1基因烟草，为揭示G蛋白偶联受体在植物生长发育和逆境响应中的作用机制提供了理论基础。
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