实用仪器分析---9.色谱分析法.ppt

上一内容下一内容回主目录色谱分析法色谱分析法第九章第九章2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录一、色谱分析简介一、色谱分析简介19031903年，俄国科学家茨维特采年，俄国科学家茨维特采用石油醚萃取绿叶植物色素时用石油醚萃取绿叶植物色素时发现；发现；19061906年，正式提出色谱分析概念。年，正式提出色谱分析概念。第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录固定相：起固定相：起分离作用的物质分离作用的物质。流动相：起流动相：起淋洗作用的物质淋洗作用的物质。例如：例如：玻璃管（色谱柱）玻璃管（色谱柱）碳酸钙粉末碳酸钙粉末石油醚石油醚 为流动相为流动相为固定相为固定相第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录二、色谱分离原理二、色谱分离原理1.1.分离系数分离系数被分离物质在固定相和流动相两相被分离物质在固定相和流动相两相达到平衡时的浓度比达到平衡时的浓度比平衡时被分离物质在固定相中浓度平衡时被分离物质在固定相中浓度平衡时被分离物质在流动相中浓度平衡时被分离物质在流动相中浓度第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录流动相流动相混合样品进样混合样品进样组分组分2 2组分组分1 1,K,K大组分大组分组分组分3,K3,K小组分小组分2.2.分离原理分离原理第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录三、色谱分析分类三、色谱分析分类气相色谱分析法气相色谱分析法流动相为气相流动相为气相液相色谱分析法液相色谱分析法流动相为液相流动相为液相第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录四、色谱分析基本术语四、色谱分析基本术语1.1.色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图）混合样品经色谱柱分离后，各个组分随流动相依次混合样品经色谱柱分离后，各个组分随流动相依次流出色谱柱，由检测器转换为信号，再由记录仪将流出色谱柱，由检测器转换为信号，再由记录仪将各个组分浓度各个组分浓度随随时间时间变化关系记录而得到的曲线，变化关系记录而得到的曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。称为色谱流出曲线或色谱图。第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录检测信号检测信号时间时间信号信号1 1信号信号2 2信号信号3 3进样进样0 0色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图）第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录2.2.基线基线实验条件下，流动相流速、压力、温度、实验条件下，流动相流速、压力、温度、记录仪走纸速度保持一致时，色谱柱后无记录仪走纸速度保持一致时，色谱柱后无任何组分进入检测器，只有流动相通过检任何组分进入检测器，只有流动相通过检测器所得的色谱流出曲线。测器所得的色谱流出曲线。理论基线是一条水平线理论基线是一条水平线检测信号检测信号时间时间进样进样0 0色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图）第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录3.3.色谱峰色谱峰组分随流动相进入检测器产生信号所形成的组分随流动相进入检测器产生信号所形成的峰形曲线。峰形曲线。正常色谱峰符合正常色谱峰符合正态分布正态分布检测信号检测信号时间时间信号信号1 1信号信号2 2信号信号3 3进样进样0 0色谱流出曲线（色谱图）色谱流出曲线（色谱图）第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录各个组分在色谱柱中停留时间大小的系列数值。各个组分在色谱柱中停留时间大小的系列数值。4.4.保留值保留值检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录死时间死时间不被固定相滞留组分，从进样到其峰最大值所用时不被固定相滞留组分，从进样到其峰最大值所用时间，间，t tMM表示。表示。检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录保留时间保留时间进样到被测组分出现浓度最大值时所用时间，进样到被测组分出现浓度最大值时所用时间，t tR R表示。表示。检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录调整保留时间调整保留时间扣除死时间的保留时间，扣除死时间的保留时间，t tR R 表示，表示，t tR R=t tR R-t tMM。检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录死体积死体积死时间范围所用流动相体积，死时间范围所用流动相体积，V VMM表示，表示，F FC C为校正为柱温、柱压时流动相流速为校正为柱温、柱压时流动相流速第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录保留体积保留体积进样到被测组分出现浓度最度最大值时所用流动相进样到被测组分出现浓度最度最大值时所用流动相体积，体积，V VR R表示，表示，第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录调整保留体积调整保留体积扣除死体积的保留体积，扣除死体积的保留体积，V VR R 表示，表示，第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录5.5.峰高峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，用色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，用h h表示。表示。检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录6.6.峰面积峰面积色谱峰和基线之间所具有的面积，用色谱峰和基线之间所具有的面积，用A A表示。表示。检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 7.7.区域宽度区域宽度标准偏差：峰高标准偏差：峰高0.6070.607处峰宽度的一半，处峰宽度的一半，表示。表示。第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录半峰宽：半峰宽：峰高峰高0.50.5处的峰宽度，处的峰宽度，Y Y1/21/2表示。表示。检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录基线宽度（峰宽）基线宽度（峰宽）色谱峰两侧拐点处所作切线与基线的两个交点之间的色谱峰两侧拐点处所作切线与基线的两个交点之间的距离，距离，Y Y表示表示检测信号检测信号时间时间基线基线死时间死时间t tR R t tR Rt tMM基线宽度基线宽度保留时间保留时间峰高峰高h hY Y1/21/2 第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录8.8.容量因子容量因子达到平衡时，组分在固定相和流动相中的质量比，达到平衡时，组分在固定相和流动相中的质量比，也称为也称为质量分配比质量分配比:容量因子的值越大，表示组分在色谱柱中停留时间越长；容量因子的值越大，表示组分在色谱柱中停留时间越长；一般要求在一般要求在1-101-10之间，理想为之间，理想为2-52-5。第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录9.9.相对保留值相对保留值相同条件下，被测与参比组分调整保留相同条件下，被测与参比组分调整保留时间的比值时间的比值;温度、固定相不变时，有定值，一般温度、固定相不变时，有定值，一般物质的相对保留值大于物质的相对保留值大于1 1;若相对保留值为零，表示该组分不被固若相对保留值为零，表示该组分不被固定相保留。定相保留。第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录高效高效五、五、HPLCHPLC分析法特点分析法特点高效填充剂、均匀填充技术使其分离效率高，高效填充剂、均匀填充技术使其分离效率高，可达到每米可达到每米10104 4理论塔板数；理论塔板数；高速高速高压泵输送流动相、梯度洗脱装置、柱后直接高压泵输送流动相、梯度洗脱装置、柱后直接 检测等技术使分离速度非常快，一般只需要几检测等技术使分离速度非常快，一般只需要几 十分钟；十分钟；第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录高灵敏度高灵敏度使用紫外、荧光、电化学等高敏检测器，使其使用紫外、荧光、电化学等高敏检测器，使其 成为十分灵敏的分析方法；成为十分灵敏的分析方法；高度自动化高度自动化配备计算机，可自动处理数据、绘图和打印分配备计算机，可自动处理数据、绘图和打印分 析结果，可程序控制全部操作（流动相选择、析结果，可程序控制全部操作（流动相选择、流速、柱温、检测器波长选择、进样、梯度洗流速、柱温、检测器波长选择、进样、梯度洗 脱等），成为全自动化分析仪器。脱等），成为全自动化分析仪器。第一节第一节 色谱分析概述色谱分析概述2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录 日立日立L-8800L-8800全自动氨基酸分析仪全自动氨基酸分析仪L-8800L-8800内部结构图内部结构图第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录输输液液系系统统储液器储液器高压泵高压泵压力表压力表梯度洗脱梯度洗脱样品样品进样器进样器色色谱谱柱柱组分收集器组分收集器检测器检测器记录仪记录仪数据处理机数据处理机 典型典型HPLCHPLC色谱仪结构色谱仪结构第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Direct pressure pumpDirect pressure pumpGas pressure is applied from an Gas pressure is applied from an external gas tank using a high external gas tank using a high pressure regulator.pressure regulator.For this systemFor this systemNo pressure pulses are produced.No pressure pulses are produced.The solvent reservoir is limited.The solvent reservoir is limited.Low cost system.Low cost system.Major problem is introduction of gas into Major problem is introduction of gas into the solvent.the solvent.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Motor driven syringeMotor driven syringeAnother non-pulsating system with a limited reservoir.Another non-pulsating system with a limited reservoir.Stepper motor/gear system allows for very fine flow control.Stepper motor/gear system allows for very fine flow control.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Reciprocating pumpReciprocating pump第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录One of the most common type of systems.One of the most common type of systems.Unlimited reservoir system but expensive.Unlimited reservoir system but expensive.Another problem is that it produces variable pressure-Another problem is that it produces variable pressure-must reverse stroke to refill.must reverse stroke to refill.Reciprocating pumpReciprocating pump第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Pressure variationsPressure variations第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Since the pump must spend at least a portion of its Since the pump must spend at least a portion of its time filling,there is a pressure drop during this phase.time filling,there is a pressure drop during this phase.This effect must be This effect must be minimized or your peaks will minimized or your peaks will all have pulses in them.all have pulses in them.That would greatly affect your That would greatly affect your sensitivity and detection limit.sensitivity and detection limit.Reciprocating pumpReciprocating pump第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录One approach is to have a more rapid fill cycle compared One approach is to have a more rapid fill cycle compared to the pump cycle.to the pump cycle.This does not eliminate the problem but does reduce it.This does not eliminate the problem but does reduce it.Reciprocating pumpReciprocating pump第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录One could also use two or more pumps working in tandem.One could also use two or more pumps working in tandem.This is a more expensive option.This is a more expensive option.Reciprocating pumpReciprocating pump第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Pulse DampenersPulse DampenersOne approach to minimizing the pulses associated with One approach to minimizing the pulses associated with reciprocating pump.reciprocating pump.Goal Goal Absorb the peak of the pressure pulse and Absorb the peak of the pressure pulse and minimize the trough.minimize the trough.Several approaches can be used.Several approaches can be used.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录In-line metal coil systemIn-line metal coil systemReduces pulse to Reduces pulse to 3%at 240 psig.3%at 240 psig.Low cost system.Low cost system.Flow passes through tubeFlow passes through tube-possible contaminationpossible contamination-Limited range-about Limited range-about 50-100 50-100 psipsi.tube is flattenedtube is flattenedPulse DampenersPulse Dampeners第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录T type metal coil.T type metal coil.With this design,flow does not pass through the With this design,flow does not pass through the dampnerdampner.It still has the previous limitations.It still has the previous limitations.Pulse DampenersPulse Dampeners第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Adjustable spring loaded dampenerAdjustable spring loaded dampenerAllows the user to minimize pulsing under actual Allows the user to minimize pulsing under actual operational conditions.operational conditions.Can reduce pulses to 0.1%.Can reduce pulses to 0.1%.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Bellows DampenerBellows DampenerReduces pulses to 0.1%.Reduces pulses to 0.1%.Pressure source can be a gas Pressure source can be a gas or a liquidor a liquidExternal pressure can be monitored and controlled by the External pressure can be monitored and controlled by the system.system.Most expensive approach but the best usually is.Most expensive approach but the best usually is.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Single reciprocating pump systemsSingle reciprocating pump systemsThe gradient is produced by controlling a valve.The The gradient is produced by controlling a valve.The valve determines the relative amounts of each solvent valve determines the relative amounts of each solvent pulled into the pump.pulled into the pump.Gradient controllerGradient controller第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Dual pumping systemsDual pumping systemsA valve system can be used on each pump can A valve system can be used on each pump can provide a different solvent.provide a different solvent.Gradient controllerGradient controller第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录A very common approach is the use of sampling valves A very common approach is the use of sampling valves and loops.and loops.Injection systemsInjection systems第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Injection systemsInjection systemsAutomated syringesAutomated syringesThis method allow for adjustment of sample size.The This method allow for adjustment of sample size.The motor driven syringe can provide sufficient pressure to motor driven syringe can provide sufficient pressure to inject sample past the check valve.inject sample past the check valve.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Guard columnGuard columnA small column added between the injection system and A small column added between the injection system and the analytical column.the analytical column.It helps prevent entry of materials that might want to stay It helps prevent entry of materials that might want to stay on the column from your sample or solvent.on the column from your sample or solvent.Used to extend column life.Used to extend column life.Should be the same packing as the analytical column.Should be the same packing as the analytical column.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录The columnThe columnHPLC has seen significant improvement over the last HPLC has seen significant improvement over the last 10 years primarily due to improved column 10 years primarily due to improved column technology.technology.PackingsPackings are more uniform and smaller.are more uniform and smaller.Phases are commonly chemically bound to the Phases are commonly chemically bound to the packing.packing.Packing methods have improved.Packing methods have improved.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录PackingsPackings Originally,these were irregular silica and alumina.A Originally,these were irregular silica and alumina.A range of synthetic,regularly shaped range of synthetic,regularly shaped packingspackings are now are now available.available.PorousPorous-channels through packing-channels through packingSuperficially porousSuperficially porous-rough surface-rough surfaceSmoothSmooth-bead like.-bead like.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Packing size Packing size As packing size is decreased,efficiency and pressure As packing size is decreased,efficiency and pressure requirements are increased.requirements are increased.Common diameters for analytical workCommon diameters for analytical workdiameters platesdiameters plates10m 10m 5 m 5 m 3 m 3 m 50005000900090001500015000All are for a 15cm4.6mm id column.All are for a 15cm4.6mm id column.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Column stationary phases Column stationary phases Today,most packing fall into four categories.Today,most packing fall into four categories.Silica or aluminaSilica or aluminaBound phases on either alumina or silicaBound phases on either alumina or silicaGels Gels Controlled-pore glass or silicaControlled-pore glass or silica第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Adsorption phases Adsorption phases aluminaaluminacommon mobile phasescommon mobile phaseshexane,chloroform,2-propanolhexane,chloroform,2-propanolexample applications-aminesexample applications-aminessilicasilicacommon mobile phasescommon mobile phaseshexane,chloroform,2-propanolhexane,chloroform,2-propanolexample applications-ethers,example applications-ethers,esters,esters,porphyrinsporphyrins,fat-soluble,fat-soluble vitaminsvitamins第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Partition phases Partition phases Can be broken down intoCan be broken down intoNormal phaseNormal phase-polar materials bound to the support.-polar materials bound to the support.Reverse phaseReverse phase-non-polar materials bound to the support.-non-polar materials bound to the support.Mixed phaseMixed phase-may have some of each.-may have some of each.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Normal Normal AminoAminoCyanoCyanoDiolDiol(-NH(-NH2 2)(-CN)(-CN)(glycidoxy-glycidoxy-ethylmethoxysilaneethylmethoxysilane)Reverse Reverse C-2 or RP-2C-2 or RP-2C-8 or RP-8C-8 or RP-8C-18 or RP-18C-18 or RP-18(-Si-CH(-Si-CH2 2 CHCH3 3)(-Si-(CH(-Si-(CH2 2)7 7CHCH3 3)(-Si-(CH(-Si-(CH2 2)1717CHCH3 3)Increasing the C number results in a Increasing the C number results in a thicherthicher,more retentive,more retentive phase.phase.Partition phases Partition phases 第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Ion exchange phases Ion exchange phases Strong Strong cationcationStrong anionicStrong anionicWeak anionWeak anionWeak Weak cationcation-sulfonicsulfonic acid group acid group-quarternaryquarternary amine amine-primary amine-primary amine-COOH-COOH第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Size exclusion phases Size exclusion phases Gels-organic or aqueous basedGels-organic or aqueous basedControlled-pore-silica or glassControlled-pore-silica or glassMust be selected based on pressure requirements and Must be selected based on pressure requirements and size range required for your application.size range required for your application.第二节第二节 HPLCHPLC色谱仪色谱仪2024/5/25 周六上一内容下一内容回主目录Detector systems Detector systems Virtually every chemical and physical property that can Virtually every chemical and