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RT-PCR原理与实验操作步骤
关键词：RT-PCR 逆转录酶 reversetranscriptase 聚合酶 链式反应 引物设计 DNA 聚合酶
一、知识背景：
1、基因表达：DNA RNA Protein
单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；
B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；
3依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
二、RT-PCR的准备：
1、引物的设计及其原则：
1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c、 3'端要求：3'端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3'端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3'端不应超过2个。
f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g、5'端无严格限制：5'末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。
3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活 性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异 硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。
实验操作步骤
一、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）
1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
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14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
三、试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml？ pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE （贮存液）
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
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30%甘油
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：
1、1.0%：
1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:
同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的RT-PCR材料：
（生工. Tel. [phone].）
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
正义：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反义：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正义：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反义：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
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3、退火温度计算
2（A T） 4（G C）
正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、引物稀释：
加DEPC水量为（μl）
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
TRIzol法抽提总RNA
细胞1×107
组织100mg
↓
加1mlTRIzol
细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
匀浆（要彻底，后转至EP管）
（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃离心7500g，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）

注：
1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解
2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
RT-PCR原理与实验操作步骤
两步法RT-PCR
（第一步：逆转录反应）
试剂 浓度 体积 终浓度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
（稀释10倍后用）
↓
混匀，离心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓
试剂 浓度 体积 终浓度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
总体积40μl（20μl）
↓
混匀，离心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min（破坏MLV）
↓
4℃保存
两步法RT-PCR
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（第二步：PCR反应）
总体积20μl(50μl)
试剂 浓度 体积 终浓度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X