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一文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项. 导语试验室花花师姐正在教导新来师弟：“想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话：“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈教育.免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，经过使标识抗体显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性试验技术。免疫组化关键用是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包含石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保留好，保留时间也长，即使对组织抗原暴露有影响，但能够抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选标本制作方法。 免疫组化步骤详解 免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮免疫组化片子。不过却不知道怎样正确地分析，得出理想结果。这实在是一件憾事。以下图，正常结果应该是这么：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一棕色。结果分析关键有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。免疫组化结果分析是毛博专长，以下是她传授独门绝技。1.对照染色和做试验时候必需设置对照组一样，免疫组化也必需设置对照染色。没有对照染色免疫组化结果是不可信。对照通常有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，本身对照。通常来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。2.定位抗原表示必需在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位阳性着色，不能视为确切阳性结果。有可能是非特异性染色或假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到对照染色了。3.半定位现在通常见图像分析系统进行定量。假如你试验室不幸没有那么高大上话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化半定量通常就分为三级：弱（+），中（+），强（+）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、显著绿色荧光和亮绿色刺眼荧光。弱（+）=1，中（+）=2，强（+）=3。最少随机观察5-10个HPF。然后依据（+）% x 1 +（+）% x 2 +（+）% x 3计算出数值；总数值1.5者为(+)。4.图像分析仪假如要进行正确定量话，就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想盛大推荐是一款图像分析软件：Image J。毛博当年在米国做博士猴时候，就是用这款软件。这是NIH开发无偿软件。通常免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到了1.50版。网上能够无偿下载。其界面很简练，以下图所表示。现在，依据一个实例来看看怎样用Image J来进行图像分析。以下图所表示，我们有一张细胞免疫荧光染色照片。那么，怎样用Image J来计数细胞个数呢？首先，要把彩色图像转换成黑白图像。步骤以下：ImageType16-bit。转换成黑白图像后，将要计数部分用高亮标示出来。步骤以下：ImageAdjustThreshold。然后拖动鼠标，直到全部细胞被标示出来。有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候能够采取Image J水洗功效。步骤以下：ImageBinaryWatershed。以下图蓝色箭头所表示，这些是原来计数成一个细胞，经过水洗以后，愈加正确地被计数成了2个细胞。然后，就能够正式开始分析了。步骤以下：AnalyzeAnalyze Particles。在得出最终结果之前，还有部分选项需要选择。假如想要计数全部细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity默认值为“0.00-1.00”。通常就取默认值。最终结果以下图所表示。软件自动测量了每个细胞大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，还要常常接触有毒致癌物质。大家辛辛劳苦染出了漂亮片子，最终全部期望得出自己想要结果。以上，毛博介绍了部分自己心得体会。期望广大试验狗们全部能做出自己想要结果，早点发文章。 非特异性染色八大原因然而，结果却未必全部是那么如意，常常出现下面这种情况，好好一张片子染得脏脏，这就是最常见非特异性染色。1. 抗体问题，真是一分钱一分货啊！一抗用多克隆抗体轻易出现非特异性染色，提议用高纯度，高效价针对更具特异性抗原决定簇单克隆抗体来处理。单克隆抗体很贵，不过结果真很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体使用期。2. 抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特异性染色常见原因。处理措施就是预试验。每次使用新抗体前应该多做预试验，探索出最理想工作浓度，不能简单地根据说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。处理措施就是定时器。加上抗体后，立即调好定时器，提醒自己立即终止反应，就会避免这个问题。3. DAB染色时间太长/变质DAB孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。DAB显色时间不是一成不变，关键靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅棕色时候，就要立即冲洗。出现棕色时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色时间过长，表明抗体浓度过低。DAB要保留于避光干燥地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗有些晚了；图2就是刚刚好，染色效果棒棒哒!4. 内源性酶和生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，尤其是部分内源性酶生物素含量丰富组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。处理措施为：灭活碱性磷酸酶：最常见方法是将左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，能够用50 mmol/L酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，能够用0.9%双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 g/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。也能够24 mg/mL卵白素封片15分钟。5. 组织变干一下子染太多片子时候，轻易出现这种情况。处理措施就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充足覆盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。6. 浸泡时间过长切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引发杯具。这全部是偷懒做法。不过有时候也是能够偷一下懒。毛博独门秘技就是4C冰箱。只要把容器放在4C冰箱里，过夜完全没有问题。7. 清洗不充足清洗一定要充足。PBS液一定要双蒸水新配，用之前再次测PH值。缓冲液用0.05 mol/LTris-HCL，0.15 mol/LNaCl即可。假如加一点去垢剂Tween-20就愈加好了。8. 封闭血清问题是否选择了正确封闭血清。标准是选择二抗动物非免疫血清，比如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为3-10%溶液孵育切片，37C 10-30分钟。这里不用洗，直接甩掉即可。毛博再贡献一个独门绝招，直接用奶粉也能够。用5%脱脂奶粉就能够了。而且效果还不错。怎么样？简单吧。师傅领进门，造化看个人了。