船舶压载水取样与检测技术.pdf

BWDLBALLAST WATER DETECTING LABSHANGHAI OCEAN UNIVERSITY船舶压载水E:样与检测技术目录 一、国内外压载水研究现状 二、压载水检测指标与检测标准 三、压载水取样 四、压载水检测国际压载水研究现状19852013年,国际上压 载水研究论文共计389篇。数据来源：Thomson Reuters Web of ScienceTM国际压载水研究现状140 120-Risk AssessmentPort Surveys|g New Tools BWMS BWE Ballast Sampling相关研究有逐年递增的趋势，但受到取样和检测技术的限制，港口调查研究增量明显不足。取样的相关研究有逐年递增趋势。一、国内压载水研究现状中国有关船舶压载水生物的早期研究，主要关注压载水中的微生物（细菌），后来随着国家贸易的发展，促进了航运业的繁荣和港口的 建设，压载水到港量也随之增加，外来物种的发现和潜在生态风险日 益增加，外来物种通过船舶压载水入侵问题日益引起重视。在中国四 大海域陆续开展了各项压载水生物检测工作，主要对压载水中微生物 及浮游生物进行种类组成研究。相关调查研究中，共发现致病菌22种，赤潮藻105种，有毒藻类15种，外来生物56种。这些有害外来生物，对生态适应性强、分布广，一旦环境合适，就可 能爆发赤潮等危害，导致海洋生态系统的结构与功能崩溃。、国内压载水研究现状所属海域调查年份港区调查船只/份数 浮游植物微生物1980-1982大连港210艘V2003辽宁中远船坞10艘VVV2005秦皇岛26艘/52份V2007秦皇岛69艘V I潮母2007-2008大连港6艘V2010秦皇岛黄骅港、京塘港20g矍（其中黄骅港12艘、京塘港8艘）/35份Id苗匈2003-2004日照港23艘V英商2004烟台港17艘V2002-2003宁波港52艘VV2007-2011上海港60艘东海2008-2009上海洋山港19艘V2010舟山2艘V2012宁波港3艘1994-1995窿5艘V1996-1997香港1艘1996-1997香港4艘V2001-2003珠海港58份南海2001-2004湛江港63艘1 V 1V2006-2008福建沿海12艘V2007厦门港5艘2010深圳盐田港49份V2011厦门港20艘V外压载水研究现状-近年来，尽管对压载水相关研究越来越多，但仍存在很多问题。1,目前压载水管理仍没有系统的纳入国家法律体系。2,相比发达国家，中国压载水研究工作较缓。中国多数对于压载水中生物的研究仅停 留于调查其中存在的种类，并未在此基础上进行深入的探索，如休眠匏子、沉积物以 及航线跟踪等研究。3,压载水中存活生物相关研究数据已有一定积累，但对于相关的风险评估研究较少。由于压载水所处环境的特殊性，多种条件因子，如船型、压载地、压载水龄、环境温 度、水化参数、采样方式、采样位置等都可能对其生物的种类及数量产生影响。如何 提高样品的代表性，以及环境因子对压载水生物生长机制的影响还需更深入进行研究。二、压载水的检测指标（G8）二、压载水的检测指标(ETV)ParameterSample Sample Processing/Presen arion3 Nasim；m Ho,dinS olume(mL)Containers 七 Tune2 Conductivity.ten5jerature.pressure,dissolved oxygen,chlorophyll a fluorescence.transmissometiy.Electronic in situ data(Tenttjeratuie.pH.Salinity,etc.)NANA33 细化检测揩标的检测要求Total suspended solids100250 mL HOPE or glassProcess immediately or store at 4.1 weekDissolved organic caibon2540-mL glass vialPass sanq)le through a GF/F;freeze filtrate until analysis.28 daysParticulate organic carbon500Whatman GET in foilPass through a GF/F;freeze filter until analysis.28 daysDissolved oxygen300300 mL glass BOD bottleFix per Oudot et al.(1988);titrate 2-24 h later.24 hoursPhytoplankton Enumeration(LiveDead Analysis)43 m3 concentrated to 1000 mLDaric 1000-mL HOPE bottleNo preservation;stain with Fhiorescein Diacetate and CMFDA as described in tbe protocolProcess immediatelyZooplankton Enumeration(LiveDead Analysis)Low Concentration.Discharge3 m3 concentrated to 1000 mLIL flaskNo preservation;Sub-sanq)le into well plate(20 1-mL welk observed).Observe with dissecting microscope and probe organisms to detennine live/dead status.Fix with Lugofs solution for total counts.Process immediatelyBacteria10001 L sterile HOPEPlate on appropriate media.Process immediately.Dissolved inorganic nutrients4060-mL polyethjdene bottlePass through a Nuclqx)re(Whatman Inc.Piscataway.NJ)membrane filter;freeze filtrate until analysis.28 daysz Chlorophyll a and.phaeopigments400Whatman GF/F in foilPass through fix with a saturated MgCOj solution:freezefilter until analysis.4 weeks5”.学33 UUC1 Ulld1 Volume processed fbr analysis:volumes are quantitative.ETV要求,非G8要求Name brand items(e.g.Nuckpore.Whatman)may be substituted wifli co呻arable items from a different manufactuier.“Dinoflagellate methods are under development.压载水的检测标准(国内标准)检测对象序号试验项目检测方法大肠杆菌海洋监测规范第七部分：近海污染生态调查和生物监测GB17378.7-2007/9.1、9.201生活饮用水标准检验方法微生物指标GB/T 5750.12-2006/4.1,4.2微生物02霍乱弧菌霍乱弧菌诊断标准WS 289-200803肠道球菌水质肠球菌的检验和计数第二部分滤膜法ISO 7899-2:200004异养菌总数海洋监测规范第七部分：近海污染生态调查和生物监测GB17378.7-2007/10.1浮游生物0510-50|im海洋监测规范第七部分：近海污染生态调查和生物监测GB17378.7-2007/5.3.2.3浮游生物06 50|_im海洋监测规范第七部分：近海污染生态调查和生物监测GB17378.7-2007/5.3.3.307总悬浮物TSS海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/2708溶解性有机碳DOC海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/34.109PH海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/26水化学参数10溶解氧DO11温度T12浊度NTU13颗粒有机碳POC(mg/L)14盐度s海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/29.1学.2005/4.5.14.1海 湾 生 态 系 统 观 测 方 法中 国 环 境 科海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/30.1海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/5.1海洋监测规范第四部分：海水分析GB17378.4-2007/31二、压载水的检测标准（国际标准）ParameterUnitsInstimmentMethod/ReferenceDissolved ammoniumpMAutoanalyzerAPHA Standard Method No.4500-NH3/20m editionEPA Method No.349.0 http:www.epa.gov/nerlcwww/m349_0.pdfDissolved inorganic nitrate and inorganic nitriteAutoanalyzerESS Method No.220.3 http:/www.epa.gov/gh5jo/ln1mb/methods/methd22O一pdf APHA Standard Method Nos.4500-N02-B and 4500-N03-F,19*editionEPA Metiiod No.353.4 http:/www.qja.gov/nerlcwww,zm353 4.pdfDissolved inorganic phosphategMAutoanalyzerESS Method No.310.1 http:/www.qja.gov/gliqx)/lmmb/metiiods/methd310.pdfEPA Method No.365.5 http:/www.epa.gov/nerlcwww/m365_5.pdfDissolved inorganic silicateAutoanalyzerEPA Method 366.0 http:/www.epa.gov/nerlcwww/m366_0pdfDissolved organic carbonpMCarbon AnalyzerAPHA Standard Method No.5310-C,20th editionASTM Method Nos.D6317,D2579,D4129,D4839,D513-02 and D5790LMMB Method No.096 http:/www.epa.gov/glnpo/lmmb/methods/docanal2.pdfLMMB Method No.014 http:/www.q)a.gov/gliq)o/lmmb/methods/pocdoc2.pdf EPA Metiiod No.440.0 ht):/www.qa.gov/nerlcwww/m440_0.pdfParticulate organic matterpMCarbon analyzer or CHN AnalyzerLMMB Method No.097 http:www.epa.gov/glnpo4mmb/methods/pocanal2.pdf APHA Standard Method No.5310-C,20th editionLMMB Method No.014 http:/www.epa.gov/glnpo/lmmb/methods/pocdoc2.pdfEPA Method No.440.0 htp:/www.q)a gov/nerlcwww/m440_0 pdfChlorophyll a/phaeopigmenfsPg/LFluorometerEPA Method 445.0 http:/www.epa.gov/nerlcwww/m445_0.pdfEPA Metiiod No.446.0 ht):/www.q)a.gov/nerlcwww/m446_0.pdfEPA Metiiod 447.0 http:www.epa.gov/nerlcwww/m447_0pdf ASTM Method No.3731-87(1998)Total suspended solidsMg/L5-place balanceESS Method No.340.2(LMMB Method No.065)http:www.epa.gov/glnpo/ltnmb/methods/methd340.pdfAPHA Standard Method No.2540D(1998)EPA Method 160.2 http:/www.epa.gov/region09/qa/pd长60_2.pdfDissolved oxygenMg/LRadiometer TitraLabEPA Method No.360.1(Probe Method)APHA Standard Method No.4500-0G(Probe Method)二、压载水取样G8压载水取样要求:Diso=Dm Qiso/Qm等动量取样保证取样管与主管中流速一致，以减少取样过程对生物造成的伤害。压载水取样模拟试验的取样点分布（岸基）压载水取样模拟试验的取样点分布（船上）SIIn:waterQ QQBWMSbeginning2tluee replicate samplesTreated tankL-排放水S2 Discharge treated waterendmiddleId el X 3B QQQ3 x beginning3 x middle/压载水取样1,Measurement Sample Location and Approach”Class Challenge Water Post TreatmentTemperatureCoreIn situ,continuousIn situ,continuousSalinityCoreIn situ or Discrete grabIn situ or Discrete grabTotal suspended solidsCoreDiscrete grabDiscrete grabParticulate organic matterCoreDiscrete grabDiscrete grabJissolved organic matterCoreIn situ,continuous,discreteIn situ,continuous,discreteDissolved oxygen必 CoreIn situ,discreteIn situ,discretePH测COTeCoreIn situ,continuousIn situ、continuousAmbient Organism ConcentrationDiscreteDiscreteBallast System Flow RateCoreIn situ,continuousIn situ,continuousBallast System PressureCoreIn situ,continuousIn situ,continuousSanling Flow RatesCoreIn situ,continuousIn situ,continuousChlorophyll a(biomass)CoreIn situ,continuousIn situ,continuousDissolved nutaientsAuxiliaryNADiscrete/(N,P,Si)|zj辅助参数一In situ,continuousContinuous as availableIn situ,continuousContinuous as availableATP 由业ig必terial)Auxiliary ETV针对各检测指 标分别提出了取样 要求。-连续、在线检测和 分阶段取样两种方 式 必测参数和辅助参 数压载水取样Challenge Water 450 tonsHolding Sample TankTFlow SplitterControl Holding Tank 200 m3Discharge.Control SampleDischarge-r.ETV提出了 大样本量 要求，如 何操作？压载水取样岸基试验取样量要求sampling periodCategoryIMO G8ETV Generic ProtocolIntakeWater Sample 5020L3m310 50 pmILBacteria500mLPost Treatment Sample 50 pm-30m310 50 pm-Bacteria-Discharge Water Sample 50 4mIm330m310 50 pm10LBacteria500mL二.压载水取样船上试验取样量要求Sampling periodCategory 50Intake Water10 50 pmSampleBacteria 50Discharge Water Sample10 50 pmBacteriaIM0G8ETV Generic Protocollm310L500mLlm310L500mL压载水取样VentB.Soiuiding pipe,with pump tubing inserted测深管二、压载水取样有机玻璃采水器Niskin bottle sampler 卡盖式采水器Syringe sampler 针筒式采水器二、压载水取样取样装i二、压载水取样SGS在线取样装置Scheme for OnbMrt二、压载水取样三、压载水检测技术-海洋生物基础知识-10-50检测方法 50检测方法-微生物检测方法Xm同一KMKM海洋生物基础知识海洋生物生态类群Dmopnysis Jortu漂浮于海水表层 1、漂浮生物 2、浮游生物 3、游泳动物 4、底栖生物压载水中的主要生物类群幼体各门类特征比较贮存物质形态结构色素、色素体蓝藻门无细胞核；细胞壁成分有：纤维 素（内层）、果胶质（外层）、黏质缩氨肽（特有）等。叶绿素a、B-胡萝卜素、蓝藻黄 素、蓝藻叶黄素、蓝藻藻蓝蛋 白、蓝藻藻红蛋白。无色素体。隐藻门多具2条鞭毛，细胞很小（3-6Hm）,前端具沟。多不具纤 维素细胞壁。叶绿素a、叶绿素c、藻胆素等;色素体1-2个，大型，叶状。甲藻门大多单细胞、有鞭毛的运动个体,细胞裸露或具纤维素细胞壁。纵 裂甲藻：细胞壁由左右两片组成 横裂甲藻：细胞壁由许多小板片 组成，具横沟和纵沟，沟内各具 1鞭毛。叶绿素a、叶绿素c、佚胡萝卜 素、甲藻素、多甲藻素等。色 素体多个，盘状、棒状、带状 或片状，金藻门大多具鞭毛（多2条，等长或不 等长）；细胞裸露或在表质上具 硅质化鳞片、小刺或囊壳。叶绿素a、叶绿素c、0-胡萝卜 素、叶黄素及金藻素；色素体 1-2个，片状，侧生。黄藻门游动的营养细胞核生殖细胞具2 卷不等长的鞭毛，长的一条向前,短的一条向后。叶绿素a、叶绿素c、0-胡萝卜 素、叶黄素；色素体一至多个,盘状、片状，少数带状或杯状。硅藻门细胞壁由硅质和果胶质组成，高 度硅质化而成为坚硬的壳体，分 上下两壳，套合在一起。叶绿素a、叶绿素c、0-胡萝卜 素、岩藻黄素、硅藻黄素等；色素体粒状、片状、叶状、分 枝状或星状，分布化细胞体内。裸藻门无细胞壁；细胞前端由胞口与外 界相通。鞭毛1条或2条，罕见3 条。叶绿素a、叶绿素b、0-胡萝卜 素等，有的具裸藻红素。色素 体多数，盘状、片状或星状。绿藻门细胞壁由纤维素（内层）、果胶 质（外层）组成，少数无细胞壁。叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和 胡萝卜素等；色素体有盘状、杯状、星状、带状和板状等，常具1至多个蛋白核。繁殖方式蓝藻淀粉、主要是群体或丝状 营养繁殖：1个母细胞分成2个子细胞;蓝藻颗粒体。体，很少单细胞。或1个母群体分成2个或多个子群体。体制无性繁殖：产生匏子。有内生袍子、外生袍子或休眠匏子（厚壁袍子）。淀粉、油滴。多为单细胞的运动 个体，少数种类型 呈不定形群体。游动种类：细胞纵分裂；群体或不具鞭毛种类：产生游动匏子。淀粉、油滴。多为单细胞具鞭毛 的运动个体，少数 为群体或丝状体。主要是细胞分裂：纵分裂、横分裂或 延板片连接线斜分裂。少数种类可形 成动匏子或不动匏子；仅少数种类具 有畦生殖。白糖素、油 滴。多为单细胞或群体,少数为丝状体。游动单细胞种类：细胞纵分裂；群体种类：群体断裂成2个或更多的 小片，然后分别长成新个体；不动种类：产生动袍子或内壁袍子（客匏字）。白糖素、油 滴。单细胞、群体、多 核管状体或丝状体。游动种类：细胞纵分裂；丝状种类：丝体断裂繁殖；无性繁殖产生动袍子、似亲袍子或不动匏子；有性繁殖种类 少，常为同配。油滴多为单细胞，或形 成放射状、链状、带状等群体、丝状 体，或埋十胶质块 中。细胞分裂：2个子细胞各以母体的上 下壳为上壳，形成新细胞。产生复大匏子、小袍子或休眠袍子。副淀粉（裸 藻淀粉），兼有脂肪。大多为单细胞运动 个体，少数营固着 生活。通常为细胞纵分裂，也可形成休眠匏 囊。淀粉体型复杂，有单细 胞、群体、胶群体、丝状体、膜状体、异丝体、管状体等 类型。营养繁殖、无性繁殖和有性生殖均有。“0-50|im活体生物（浮游植物）检测45 6A以硅藻为例，剖析藻类的 立体形态-如何度量10-50m粒径 生物的尺寸？“0-50|im活体生物（浮游植物）检测“0-50|im活体生物（浮游植物）检测“0-50|im活体生物（浮游植物）检测样本采集、浓缩移入计数板显微观察，20min内“0-50|im活体生物（浮游植物）检测 50klm活体生物（浮游动物）检测-concentrated subsample30m3-1L-20mLN50|im活体生物（浮游动物）检测部分50 m活体生物已肉眼可见，因此该类生物的详细分析方法为直接观通过运动、呼吸、心脏跳动等体征判别其死活状态。目前，美国海岸警卫队推荐使用差减法，即浓缩样品后通过生物的生命体征判断其死活，记录死亡个体数量（D）,然后利 用样本固定剂将所有生物杀死，记录个体总数（D,个体总数（T）与死亡个体数的差值记为活体数量。活体数量=总个体数（T）-死体个数（D）50klm活体生物（浮游动物）检测L1样本收集移入计数板样本采集、浓缩检测流程显微观察海洋微生物-海洋微生物种类繁多，目前发现的海洋微生物主要包括病毒、古菌、细菌、真菌等。据统计有100万至2亿种，海洋微生物在海洋环境广泛 分布，随着海水深度的增加，海洋环境微生物的物种 丰度和数量呈递减的趋势。在表层海水或近岸沉积环境海洋微生物的数量达 106109个/,而在大于1000米水深的深海环境，微生物数量约在个/ml。压载水微生物检测-1、大肠埃希氏菌多管发酵法 滤膜法-2、肠道球菌滤膜法-3、霍乱弧菌（01和0139型）诊断法，试剂盒法-4、细菌总数平板法压载水微生物检测压载水活体生物检测方法根据压载水检测目的，可将检测方法大致分为详细分析法和指示性分析法两种。指示1性分析是指，对代表性压载水样品进行快速的直接或间接指标的分析来反应 水体的存活生物情况。指示性分析多为间接分析，包括生物、化学或物理参数（例 如溶解氧水平、残留的氯水平、腺甘三磷酸（ATP）、核酸、叶绿素a等）,通过试 验获得这些指标的阈值并与D-2排放标准相比较，可获得间接的比较结果。直接指 示性分析即是直接获得每单位体积活体生物数量的结果，可以直接与D-2排放标准 相比较，具有高检出限和置信区间大的特点。详细分析法较指示性分析来说更加复杂，并且是直接测量代表性的压载水样品来 确定单位体积内的活体生物的浓度。具有以下特点：测试结果可直接与D-2标准比 较；能够进行精确的生物体浓度测定；具备合适的方法检测限。详细分析法与指示分析法比较指示性分析详细分析目的一种快速、粗略的评估样 品中生物数量的方法严格的、详细的分析活 体生物数量的方法取样体积不同分析方法间取样体积 差异较大根据方法的要求取样代表性样品需要采集代表性样品需要采集代表性样品分析方法分析参数物理、化学、生物直接计数生物数量耗时耗时短耗时长技术要求技术要求低技术要求局精确程度精确程度低精确程度局与D-2标准的符合性符合性低符合性高指示性分析检测指标一般方法50 pm活体生物个体计数/立体显微观察目视观察”0-50pm活体生物活体荧光法 50 pm和210-50Hm光度法，核酸法，三磷酸腺甘 法，荧光法（FDA）,叶绿素法活体生物流式细胞法肠道球菌荧光诊断试剂盒大肠埃希氏菌有毒霍乱弧菌（01 和 0139 型）试剂盒法标准方法优/缺点置信区间、检出 限、参考文献暂无压载水 检测的国际 专用标准昂贵，对检测人员的 技术要求高待研究只能直接计数个体大 于1000即1的生物只能计数浮游植物，会出现偏低的结果半定量的方法，可能 出现假阳性结果昂贵培养时间为6h,且为 半定量方法详细分析法检测指标一般方法标准方法优/缺点置信区间、检出 限、参考文献 50|imO10-50|im活体生物体式显微镜观察法（配合活体染色剂或运动观察）暂无压载水检测的国际专用标准；US EPA ETV Protocol,v.5.1 中有提及昂贵、耗时长、对检测人 员的技术要求高N10-50um活体生物活体染色观察法暂无压载水检测的国际专用标准；US EPA ETV Protocol,v.5.1 中有提及专业技术要求高”0-50nm活体生物 50 pm和210-50pim活体生物流式细胞法（结合叶绿素和染色 剂法）暂无压载水检测的国际专用标准昂贵，专业技术要求高 50 pm和210-5001活体生物再生长培养法专业技术要求高、耗时长肠道球菌培养法ISO 7899-1ISO 7899-2专业技术要求高、至少需培养44h待研究大肠埃希氏菌培养法ISO 9308-3ISO 9308-1专业技术要求高、至少需 要培养24h有毒霍乱弧菌（。1和 0139 型）培养法、分子生物学法、荧光法ISO/TS 21872-1/13专业技术要求高、至少需 要培养24-48h肠道球菌、大肠埃希 氏菌、有毒霍乱弧菌（01 和 0139 型）荧光原位杂交法（FISH）暂无压载水检测的国际专用标准专业技术要求高，耗时8h 50 pmO10-50pm活体生物立体显微观察、流式细胞法指示性分析设备HACH(LE 60Cellular BWI as a Function of Cell VolumeLog Cell volume(pm3)STANDARD OPERATING PROCEDUREVariable chlorophvll a fluorescence as a rapid ballast water compliance testfMEPC 66/INF.27)指示性分析设备Bulk FDA fluorescein productionru 二006j)uo-onpojd uloosejon-u.60,Cellular Auorescein Production as a Function of Cell Volume1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4 0 4.5 5.0 5.5Log Cell UXume(um)STANDARD OPERATING PROCEDURE Bulk FDA viability assay(MEPC 66/INR27)指示性分析设备Speedy breedy Vibrio Cholera,E.Coli and Enterococci To see how accurate and useful in real life itwill be Furthertests will be carried out on Speedy详细分析设备小结-取样 有待建立具体的、统一的船上取样要求 开展管道取样装置的研发-检测 到港船舶压载水快速检测技术研发 培训抽检人员SHANGHAI OCEAN UNIVERSITY