抗肿瘤药物体内筛选试验基础标准操作专项规程SOP.doc

抗肿瘤药品体内筛选标准操作规程概述：抗肿瘤药品是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖一类药品，作用机制包含抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包含和抗肿瘤药品申请临床试验和申请上市相关非临床有效性和安全性研究内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间关联性，和非临床研究和临床试验之间关联性。意在首先为抗肿瘤药品非临床研究提供技术参考；其次，经过技术要求引导科学有序研发过程，使中国这类药品研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表现在对抗肿瘤药品非临床研究通常性认识。具体药品非临床研究应在本指导标准基础上，依据药品本身特点制订研究方案。研究目标：建立一套包含抗肿瘤药品体内作用药效学研究和评价体系及对应标准操作规程和抗肿瘤药品安全性和作用新机制研究。 有效性研究抗肿瘤药品有效性研究目标关键在于探索受试物作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为以后安全性评价和临床试验中适应症、给药方案选择提参考信息。 安全性评价安全性评价目标关键包含：（1）估算 I 期临床试验起始剂量；（2）估计药品毒性靶器官或靶组织；（3）估计药品毒性性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案制订提供参考。研究计划：(a)小鼠急性毒性测试 根据急性毒性测试常规方法，选择昆明种小鼠，经过腹腔注射方法给药，测定体外抗肿瘤活性突出化合物半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重改变情况，评价化合物急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试给药剂量。(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 依据动物体内抗肿瘤活性测试标准方法，选择昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低化合物，设定适宜剂量经过腹腔注射方法给药，以临床常见抗肿瘤药品环磷酰胺作为阳性对照药品，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。(c)专利保护范围内化合物继续合成申请保护范围较大专利，合成部分可能含有良好活性新化合物，拓展研究范围，发觉活性更强化合物，并申请新发明专利。并可针对具体化合物申请隶属专利，延长高活性化合物保护期限。（d）体外抗肿瘤活性广泛筛选 采取MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多个人肿瘤细胞株增殖抑制活性，确定化合物在不一样瘤株间抗肿瘤活性选择性，为裸鼠模型试验提供依据。（e）抗肿瘤作用机理深入研究 依据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型试验活性化合物作用机理特征，选择微管蛋白聚合等试验从分子水平确定化合物作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架影响及诱导凋亡途经，从细胞水平上说明化合物作用机理。 依据抗肿瘤新药审批措施要求，采取裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物抗肿瘤活性。（g）动物体内药品代谢动力学试验 选择在人癌裸鼠移植瘤模型试验中活性良好化合物，开展动物体内药品代谢动力学试验，考查化合物吸收、分布、代谢、排泄性质。（h）动物亚急性，长毒试验 依据抗肿瘤新药审批措施要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药品安全性评价。基础方法：小白鼠灌胃法 以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内，然后沿着上颚壁轻轻插入食管，稍感有阻力时（大约灌胃管插入1/2，相当于食管过膈肌部位），即可推进注射器，进行灌胃（图1）。若注射器推进困难，应重插。若灌胃器误插入气管给药，可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽出灌胃管。此法1次给药量为0.01-0.03ml/g。 图1.小白鼠捉持及其灌胃法小白鼠皮下注射法 通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起，注射针刺入皮下，把针尖轻轻左右摆动，易摆动表示已刺入皮下，然后注射药液。拔针时，以手指捏住针刺部位，以预防药液外漏（图2）。该法对小白鼠1次注射药量为0.01-0.03ml/g。图2.小白鼠皮下注射法小白鼠静脉注射法 通常采取尾静脉注射法。事先将小白鼠或大白鼠置于固定筒内或铁丝罩内，或扣于烧杯内，使其尾巴露出（图3）。将尾置于45-50温水中浸泡或用75%酒精棉球擦之，以使血管扩张。然后，选择尾巴左、右两侧静脉进行注射。注射时若出现隆起白色皮丘，说明药品未注入血管。这时，注射器应向尾根部位移动，重新注射。该法对小白鼠1次注射量为0.005-0.01ml/g。图3小白鼠尾静脉注射法小白鼠腹腔注射法以左手捉持小白鼠，让其腹部向上，右手将注射器针头刺入皮肤，刺入部位距离下腹部腹白线稍向左或右位置（图4）。向前推进注射器3-5mm,，接着使注射针和腹部皮肤面呈45刺入小白鼠腹肌，继续向前刺入，针头经过腹肌进入腹腔后阻力消失，这时即可慢慢注入药液。对小白鼠1次注射量为0.01-0.02ml/g。图4.小鼠腹腔注射法试验动物标识试验用较大动物如兔、猫、犬等可用特制号码牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,可用黄色苦味酸（3%-5%）涂于毛上标号。其编号方法无统一要求，以下方法可供参考。如给小鼠标识1-10号，可将小鼠背部分前肢、腰部、后肢，按左、中、右分为九个区,从右到左标识1-9号，第10号不标识（图5a）。如给小鼠标识1-20号，则（图b）。1号右前肢 11号腰部及右前肢2号左前肢 12号腰部及左前肢3号左后肢 13号腰部及左后肢4号右后肢 14号腰部及右后肢5号头部 15号腰部及头部6号头部及右前肢 16号腰、头部及右前肢7号头部及左前肢 17号腰、头部及左前肢8号头部及左后肢 18号腰、头部及左后肢9号头部及右后肢 19号腰、头部及右后肢10号腰部（背中间 20号尾根部图5.小鼠、大鼠皮毛标识编号法(a) 小鼠急性毒性测试目标：测定LD50了解受试物毒性强度、性质和可能靶器官，为深入进行毒性试验剂量和毒性观察指标选择提供依据，并依据LD50进行毒性分级。结果判定：如LD50小于人可能摄入量100倍，则放弃该受试物。如LD50大于或等于100倍者，则可考虑进入下一阶段毒理学试验。 如动物未出现死亡剂量大于或等于10g/kg BW（涵盖人体推荐量100倍），则可进入下一阶段毒理学试验。 对人可能摄入量较大和其它部分特殊原料，按最大耐受量法给最大剂量动物未出现死亡，也可进入下一阶段毒理学试验。范围：本方法要求了急性毒性试验基础技术要求。术语和定义：下列术语和定义适适用于本方法。半数致死量（LD50）是经口给受试物后，预期能够引发动物死亡率为50%单一受试物剂量，该剂量为经过统计得出估量值。其单位是每千克体重所摄入受试物质毫克数、克数或毫升数，即mg/kg BW、g/kg BW 、mL/kg BW。最大耐受剂量法(MTD)：用最大使用浓度和最大灌胃容量给20只动物后，连续观察7-14天，未见任何动物死亡，则MTD大于*g/kg BW。原理经口一次性给或24h内数次给受试物后，在短时间内观察动物所产生毒性反应，包含致死和非致死指标参数，致死剂量通常见半数致死剂量LD50来表示。试验动物通常均分别用两种性别成年小鼠或大鼠。小鼠体重为18-22g，大鼠体重为180-220g。如对受试物毒性已经有所了解，还应选择对其敏感动物进行试验，如对黄曲霉素选择雏鸭。动物购置后适应环境3-5天。操作步骤受试物处理：受试物应溶解或悬浮于适宜介质中。通常采取水或食用植物油作溶剂，能够考虑用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式（如糊状物等）。必需时可采取二甲基亚砜。但不能采取含有显著毒性有机化学溶剂。如采取有毒性溶剂应单设溶剂对照组观察。受试物给路径：经口。试验前空腹：动物应隔夜空腹（通常禁食16h左右，不限制饮水）。容量：各剂量组灌胃容量相同（ml/kg BW），小鼠常见容量为20 mL/kg BW；大鼠常见容量为10ml/kg BW。 方法：通常一次性给受试物。也可一日内数次给（每次间隔4-6h，24内不超出3次，尽可能达成最大剂量，合并作为一次剂量计算）。常见急性毒性试验设计方法霍恩氏（Horn）法预试验：可依据受试物性质和已知资料，选择下述方法：通常多采取0.1、1和10g/kg BW剂量，各以2-3只动物预试。依据24内死亡情况，估量LD50可能范围，确定正式试验剂量。也可简单地采取一个剂量，如215mg/kg BW，用5只动物预试。观察24h内动物中毒表现。如症状严重，估量多数动物可能死亡，即可采取低于215mg/kg BW剂量系列，反之症状较轻，则可采取高于此剂量剂量系列。如有对应文件资料时可不进行预试。动物数：通常每组用5只。常见剂量系列： 1.002.1510t t=0,1, 2, 34.64因为剂量间距较1.00/3.1610t t=0,1, 2, 3为小，所以结果较为正确。通常试验时，可依据上述剂量系列设计)个组，即较原来方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这么在查表时轻易得出结果。 正式试验：将动物在试验动物房喂养观察3-5天，使其适应环境，证实其确系健康动物后，进行随机分组。给受试物后通常观察7或14天，若给后第4天继续有死亡时，需观察14天，必需时延长到28天。统计死亡数，查表求得LD50，并统计死亡时间及中毒表现等。 该方法优缺点：优点是简单易行，节省动物；缺点是所得LD50可信限范围较大，不够正确。但经多年来实际应用和验证，同一受试物和寇氏法所得结果极为相近。所以对其测定结果应认为是可信和有效。 最大耐受量试验：适宜条件：相关资料显示毒性极小或未显示毒性受试物，给动物最大使用浓度和最大灌胃容量受试物时，仍不出现死亡。 动物：最少雌、雄各10只。剂量：受试物最大使用浓度和灌胃容量（一个剂量组）。方法：动物购置后观察3-5天，给最大使用浓度和最大灌胃容量受试物（一日内1次或数次给，一日内最多不超出3次），连续观察7-14天，动物不出现死亡，则认为受试物对某种动物经口急性毒性剂量大于某一数值（g/kg BW）。最大灌胃容量小鼠为20 mL/kg BW，大鼠为20 mL/kg BW。(b) 小鼠体内抗肿瘤活性测试体内试验用于确定受试物对特定类型肿瘤细胞杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用给药剂量、路径、频率、周期等。 体内试验通常采取动物肿瘤移植模型和人癌移植模型。 因为动物肿瘤移植模型和临床疗效之间相关性不强，仅可用于侯选化合物初步筛选。通常情况下，以人癌移植模型试验结果来评价抗肿瘤药品有效性。1、 模型建立细胞毒类抗肿瘤药品临床前体内试验通常最少应选择 6 种人癌移植瘤模型，其中应包含 II期临床试验中拟筛选肿瘤组织类型。模型建立和使用应注意： 移植瘤复苏后通常应传 2-3 代后再用于体内抗肿瘤试验；为了保持移植瘤生物学特征和遗传特征，复苏后移植瘤体内传代应少于15-20 代。2、 试验设计肿瘤移植部位关键在皮下，也包含腹腔、肾囊下和原位等。通常待移植肿瘤生长至100-300mm3后将动物随机分组给药。 通常包含高、中、低 3个剂量诊疗组、阳性对照组和阴性对照组。诊疗组受试物剂量选择应能够表现出药品量效关系， 高剂量不宜超出受试物最大耐受剂量。 应依据受试物药动学特点和毒性反应等确定给药频率和周期；给药路径应尽可能和推荐临床用药路径相同。阳性对照药通常应满足以下条件：（1）和受试物作用机制相同或相近；（2）对移植肿瘤敏感；（3）临床广泛应用且疗效确切。阳性对照药给药方案应能够表现出药品最好诊疗作用，其剂量通常不宜超出最大耐受剂量。阴性对照组给对应溶剂。 3、检测指标 推荐使用测量瘤径方法，动态观察受试物抗肿瘤效应。肿瘤直径测量次数依据移植瘤生长情况而定，通常为每七天 2-3次。在试验中还应该观察和药品安全性相关指标，如动物体重增加和死亡率，将诊疗组这些数据和标准诊疗对照组进行比较，对于判定药品安全性和开发前景含相关键意义。 试验中应统计检测指标改变和给药时间关系，方便了解药品作用特点，降低单次统计试验结果可能引发误差。体内抗肿瘤试验结果中还应同时附有对应照片。4、评价标准 对于体内试验结果评价应综合考虑受试物作用机制、模型临床相关性、 每一个模型具体试验结果和受试物和阳性对照药品试验结果比较。 针对每一个人癌移植瘤模型， 推荐采取相对肿瘤增殖率T/C （%）作为试验评价指标，评价标准通常为：T/C（%）40 %为无效；T/C（%） 40%，并经统计学处理 P 0.05 为有效。在体内有效性试验采取全部人癌移植模型中，通常最少应有1/3 达成有效标准，才提醒药品有必需进入临床试验。在评价时还应关注受试物和阳性对照药试验结果比较。在毒性相当（在有效性研究中关键表现为动物体重下降相当）情况下，对受试物诊疗组和阳性对照药组肿瘤增殖率比较也是评价受试物是否有必需进入临床试验指标之一。附：相对肿瘤增殖率T/C（%） ：针对每一个人癌移植瘤模型抗肿瘤活性评价指标。计算公式以下：T/C % = TRTV / CRTV*100%。（TRTV：诊疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV）。 肿瘤体积(tumor volume,TV)计算公式为：V = 1/2ab2 或/6abc。其中a、b、c分别表示长宽高。因为此两公式相关性极好，可采取任一公式。依据测量结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV） ，计算公式为： RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时肿瘤体积。鼠S180移植瘤抑制作用试验1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试验用药品1.1.2 动物及瘤株肉瘤S180；试验用昆明小鼠18-22 g。1.1.3 仪器设备灌胃器、手术器械、天平、离心机1.2 方法1.2.1 肿瘤模型建立小鼠S180细胞接种于昆明种小鼠腹腔后，取腹水传代保留。取腹水传代第7日荷瘤小鼠，脱颈椎处死小鼠，消毒腹部皮肤，无菌注射器吸收乳白色腹水，用生理盐水调整肿瘤细胞浓度为1107 /mL，用酒精棉球消毒昆明种小鼠右侧腋下皮肤，于皮下接种上述瘤细胞悬液（0.2 mL/只），常规喂养。1.2.2 药品对小鼠S180抑制作用昆明种小鼠50只，腋下接瘤，次日将荷瘤小鼠随机分为5组，每组10只。分别为模型组、环磷酰胺（CTX）组、药品高、中、低剂量组。干后,称取瘤重，计算抑瘤率：小鼠接瘤后第二日开始按表1所表示剂量和方法给药，CTX组于接瘤后第2日给药，隔天一次，药品组每日给药一次，连续10天，给药体积为0.2 ml/20g体重。末次给药二十四小时后，脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织,去除血污、脂肪等非肿瘤组织，用滤纸吸抑瘤率%=（1给药组平均瘤重/ 对照组平均瘤重）100 %表1 荷瘤小鼠给药剂量和方法组别剂量（mg/kg B.W.）给药方法模型CTX20腹腔注射药品高灌胃中灌胃低灌胃1.2.3 对荷瘤小鼠免疫器官影响动物接种S180瘤株为第0天，第1天开始灌胃，连续灌胃10天 ，第11天处死动物，正确称量动物体重、胸腺重量、脾脏重量，计算胸腺指数和脾脏指数，脏器指数= 脏器重量/体重。表2 药品对免疫指数影响(s)组别剂量(mg/kg B.W.)动物数（n）胸腺指数（110-3）脾指数（110-3）空白对照10CTX20 i.p.10药品1010101.2.4肿瘤组织学观察取部分瘤组织用10中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，经苏木精伊红染色，光镜观察。 试验步骤固定液、染色液配置固定液： (1)10%中性福尔马林（pH7.0） 甲醛 100 ml NaH2PO4H2O 4 g Na2HPO4 13 g 蒸馏水 900 ml(2) Harris苏木素: 配方： 苏木素 1 g 无水乙醇 10 ml 蒸馏水 200 ml 钾明矾 20 g HgO 0.5 g 先将苏木素溶于无水乙醇中，备用。把明矾放入蒸馏水，加热溶解，再加入备用苏木素，煮沸 2 分钟，先加入少许氧化汞，预防氧化过程中苏木素外溢，玻棒搅拌，然后，边搅拌边加入氧化汞。加完后，立即移至冰水中，加速其冷却，静置一夜后，过滤。用前以 5% 百分比加入冰醋酸。 (3)伊红（醇溶性） 配方： 伊红 （醇溶性） 2.5-5g 75%酒精 1000 ml 加几滴冰醋酸至半透明状。 伊红有水溶和醇溶，假如用是水溶，应该在脱水前进行染色，假如是醇溶，应使用和溶解伊红等浓度酒精开始脱水。(4)盐酸酒精分化液： 浓盐酸0.51 ml 75%酒精99 ml(5) 蛋白甘油： 蛋白甘油是粘贴蜡片用粘片剂。配方以下：取一新鲜鸡蛋蛋白，充足搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。试验用具：解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。病理标本采集和制作(l)取材脱颈椎处死小鼠，剥取瘤组织,去除血污、脂肪等非肿瘤组织。(2)固定和修块快速将胰腺放入4%中性甲醛(用PH 7.0一7.2磷酸缓冲液配制)中固定48小时，组织块直径应小于7mm。(3)脱水和透明在以下过程，要求常常晃动组织块，以确保组织块能够充足地和乙醇或二甲苯接触，在每一步骤以后，要充足滤干组织块，通常见筒纸吸干组织块上液体，以免影响其它液体浓度，但要预防组织块干燥。全过程约需要4.5h（270min）。175%乙醇 50min285%乙醇 50min395%乙醇 （I） 30min495%乙醇 （II） 30min5100%乙醇（I） 30min6100%乙醇（II） 30min 7 1/2 二甲苯（乙醇和二甲苯等体积） 20min8二甲苯（I） 20min9二甲苯（II） 10min（可依据透明效果而定） 透明效果判定：如组织块颜色加深透明，二甲苯溶液颜色透明，即表明脱水效果很好；如脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。使用过酒精或二甲苯倒入烧杯里方便回收。(4)浸蜡、包埋和修蜡块1浸蜡：可在脱水和透明进行时，将60恒温箱打开，使大烧杯内石蜡充足溶解，待脱水和透明结束后，可将脱水篮整个或包裹在纱布内组织块转入充足溶解石蜡里，于60恒温箱放置120分钟。 2包埋：包埋有多个器具，比较简练廉价方法是采取纸盒。可在浸蜡同时将纸盒做好，包埋时将60石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定次序排列好，使切面朝下。我们提议，不一样组别同一组织包埋于一个蜡块中，以确保切片和染色条件一致，且方便读片和比较。为预防倒入纸盒内石蜡底部立即凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块蜡要反复冻融很好。组织包埋方法可参见表2。3修蜡块：待纸盒内蜡凝固后(若需要使蜡块快速凝固，可将包埋好蜡块置于4冰水混和物中)。将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，通常蜡块大小视组织多少而定，为确保切片顺利，组织块和蜡块边缘之间距离不得小于2mm。修剪下来残蜡应回收，方便再用。(5)切片在载玻片上擦少许甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充足抹匀，呈半干状为佳。切片厚约48m，通常厚约6m，细胞小而密组织如胸腺，能够切45m，而细胞疏组织，以下丘脑可切10m。将切片在55左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白载玻片从水浴中捞取切片，斜放在木架上，立即放入37烘箱中过夜，通常时间越长久有效果越好，以切片紧贴于载玻片上呈半透明状为佳。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面试验。(6)脱蜡、染色和脱水取出玻片架后，应将玻片架倾斜，以使载玻片上试剂流尽，然后用筒纸将玻片架和载玻片下缘试剂吸干，以免影响其它试剂浓度。全过程约需要50min。1脱蜡到水（1）二甲苯（I） 15分钟（2）二甲苯（II） 15分钟（3）100%乙醇 2分钟（4）95%乙醇（I） 1分钟（5）95%乙醇（II） 1分钟（6）蒸馏水浸洗 1分钟2染色（7）苏木精 30秒钟（8）自来水冲洗1分钟，但应注意不能用水直接冲在玻片上，以免冲走切片。（显微镜下观察效果）（9）伊红（着色即可） 10秒钟（10）蒸馏水浸洗 1分钟3脱水（10）95%乙醇（I）1分钟（11）95%乙醇（II） 1分钟（12）100%乙醇 2分钟（13）二甲苯（I） 2分钟（14）二甲苯（II） 35分钟(7)封片将载玻片从玻片架上取下，滴加12滴中性树胶，用眼科镊夹住盖玻片一角，轻轻盖上盖玻片，让中性树胶沿着盖玻片充足展开，以后倾斜载玻片，用筒纸将多出中性树胶吸干，同时注意避免有气泡产生，平放载玻片，室温下长久保留。1.2.5 数据处理全部试验设3个平行组或反复3次，结果以s表示，用SPSS 13.0统计分析软件对各组数据及数据间差异显著性水平进行统计学分析。注意事项相关腹水传代，观察到第一代种鼠肚子较大后（通常约8-9天左右），能够传代，传代时取1ml注射器，用2ml注射器针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取 腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽可能浅一点，还能够把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，通常抽个0.5ml就能够了，不用离心，直接 用PBS 3-6倍稀释后，接种到新老鼠腹腔，腹水颜色为白色或略有发黄全部是正常，不过血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽可能6-7天时候传代，不要等时间太久，不然腹水轻易血性。三代后可用于试验。相关接种进行试验，这个时候抽取腹水需要量比较多，通常需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子拎起腹部肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或去掉针头注射器吸收腹水。稀释后，接种到小鼠 腋下。相关稀释量，最好探索一下，开始时候能够合适计数，污染。不过要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，不过不要 深入到腋窝里面，会给以后操作带来麻烦。接种时进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不轻易细胞接种量控制在1106 /只时，小鼠腹水出现情况通常以下：56 d出现腹水，79 d抽取传代最好，1012 d出现血性腹水，1415 d小鼠开始死亡。假如动物固定不佳, 注射肿瘤细胞时针头在皮下往返游动, 结果是肿瘤长成后不能成为一个球形或半球形, 而是成为有多个小瘤体组成长条或不规则形状。相关观察指标，关键是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后第6天左右了，第10天就结束时间，瘤体积数据意义就不大。根据SFDA要求，平均瘤重小于1g，或 单个瘤重小于200mg，认为肿瘤生长不良，试验作废。（d）体外试验法：用培养肿瘤细胞系进行。体外试验关键用于对候选化合物进行筛选， 初步了解受试物作用机制、敏感肿瘤类型和作用强度， 为随即进行体内试验提供参考。在体外培养不一样人肿瘤细胞系中加入不一样浓度待测药品， 采取磺酰罗丹明染色法（SRB法） 、四氮唑盐还原法、集落形成法等方法进行检测，计算药品半数抑制浓度（IC50） ，并和标准诊疗药品进行比较，能够初步估计抗肿瘤药品抗瘤谱和作用强度。应依据化合物结构特点和作用机理确定体外试验采取研究方法。 比如，以线粒体为作用靶点药品不宜采取四氮唑盐还原法。试验中，在选择肿瘤细胞系时应考虑到细胞生长和增殖速率，通常最少应选择 12 种人癌细胞系。药品和细胞共培养时间通常为4872 小时，贴壁细胞需先贴壁 24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照为标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。试验最少应反复一次。1、噻唑蓝（MTT）法 在培养活细胞线粒体中和NADP相关脱氢酶可将黄色四氮唑（MTT）催化成不溶性蓝紫色甲替，将甲替用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，利用酶标仪（试验波长570nm，参比波长450nm）测定光密度值，根据公式 试验组光密度值肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1 ）100% 对照组光密度值计算药品对肿瘤细胞生长抑制率。用系列浓度药品可制作肿瘤细胞生长抑制率量效曲线。2、染料排斥法 本方法是依据活细胞含有排斥一些染料功效，而死细胞因胞膜破坏而易于被染料着色原理，在培养对数生长久细胞悬液中加入伊红、台盼蓝、或苯胺黑等染料，在室温下放置5分钟后，在15分钟用血球计数板计数200个细胞。依据公式未染细胞数活细胞率（%）= 100% 细胞总数3、生长曲线法 本方法是依据肿瘤Gompertzian生长曲线而设计。培养肿瘤细胞在早期为指数增殖期，伴随细胞密度增加，因代谢产物积聚和营养物质消耗，增殖趋于减缓乃至停止，进入所谓平台期。在培养后立即、1、2、3、4、5、7天细胞，用台盼蓝染色，细胞计数，然后取细胞对数对培养时间作图可获细胞生长曲线。1）将生长曲线外延至Y轴可取得截距No，用公式计算药品对增殖细胞杀伤力（No是对照组截距）2）用Nt代表接种后t小时细胞数， 用公式TD = 0.301t / logNt - LogNo 计算药品对细胞增增时间（TD）影响。3）取平台期每毫升细胞均数，比较细胞生长饱合密度（Ns）。4、集落形成法 本方法利用分裂6代以上克隆原单细胞子细胞可形成集落成簇（每簇细胞数50）能力，比较药品对单个肿瘤细胞增殖能力影响。本方法有贴壁法和半固体培养法两种。1）贴壁法 需要选择贴壁生长细胞， 按500细胞/ml浓度接种到35mm培养皿中，培养后弃去培养基，用瑞氏-姬姆萨染色后，在20解剖显微镜下计数含有50i个细胞细胞集落。2）半固体软琼脂培养法 取对数生长细胞，用含小牛血清培养液稀释成1000细胞/ml悬液；溶化5%琼脂液，并按1：9百分比和含小牛血清新鲜培养液混合，倒入35mm培养皿（1ml/皿），室温下待琼脂凝固，取0.94ml细胞悬液，加0.04ml5%琼脂, 加到已制备琼脂平皿中，室温下凝固。移入培养箱培养。在16解剖显微镜下计数直径大于75m细胞集落。以集落形成抑制百分率对对数剂量作图，可得“S”型曲线，从曲线上求取半数抑制浓度IC50；以集落存活分数和剂量作图，可取得克隆原细胞存活曲线，方程为S=1-(1-e-D/Do)n，S为存活分数， D 为剂量， Do为存活分数每下降1/e时所需药品剂量， n为外推值。Do越小， 药品杀伤力越大，N越大杀死细胞药品剂量越大。5、硫化若丹明B法（SRB）法 硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉红色，溶于水，可和生物大分子碱性氨基酸结合，这种结合物在波长515nm时读数和细胞表现出良好线性关系，可用于细胞定量。测试细胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室温下静置， 然后去除未结合SRB， 用非缓冲tris碱液溶解结合SRB，在自动化分光光度平板读数仪（515nm波长）测定OD值。可依据下述公式计算: T - T0 生长率（%）= 100% C - T0C、T和To分别为对照组细胞，为给药组细胞，另外对照平板加药时细胞OD值。 T - T0杀伤率(%) = 100% T T - T050%生长抑制所需药品浓度(GI50) = 100% C - T0 T - T0杀死50%细胞所需药品浓度(LC50)= 100% T0（e）抗肿瘤作用机理深入研究（一）药品作用周期特异性研究进行药品作用细胞周期性试验必需首先制备同时化细胞，常见体外培养细胞同时化方法有机械振荡法、双胸苷同时法、含羞草氨酸俘获法和离心洗脱法。1、机械振荡法 机械振荡法分离同时化细胞是基于单层贴壁生长细胞在进入有丝分裂期时, 胞形变圆，松散地附在支持物上，利用摇摆或拍击培养瓶能够剥离出这些细胞，利用此方法能够得到较纯M 期细胞。双胸苷同时法原理是先以高浓度TdR处理细胞，使细胞内dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP转变，DNA复制受阻，S期细胞停滞在S 期，其它期细胞积聚在G1/S边界；撤TdR，让原处于S期细胞完全越过S期，再给TdR，让越过S期细胞进入G1/S边界，然后撤去TdR，让细胞重新生长，同时进入S期。所以，本方法能够得到较纯S期细胞。2、含羞草氨酸俘获法 含羞草氨酸可将细胞集结于G1/S边界，阻止细胞进入S期。在撤消含羞草氨酸后，细胞可同时进入S 期。3、离心洗脱法 离心洗脱法原理是进入细胞周期体积呈线性增加。G1期细胞体积最小，离出口最近而被最先洗出。G2/M细胞体积最大离进气口最近而被后洗出。在上述同时化处理尚需配合以同时化程度检测，检验方法有两种：流式细胞光度技术和放射性同位素技术。前者经过测定细胞荧光强度来定量细胞DNA量； 后者则利用测定掺入到DNA中3H-胸苷（3H-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）量来获知处于S 期细胞量。（二）药品抗微管作用 利用微管蛋白在37聚合，在冰浴上解聚特点，测定微管蛋白或微管液OD值，分别取得S型聚合曲线和倒S型解聚曲线， 比较药品对曲线影响， 用下式计算抑制率。 试验组光密度值抑制率（%）=（1 - ）100% 对照组光密度值（三）药品和DNA结合能力检验 吸收光谱移动法 原理是DNA和药品形成复合物后吸收光谱发生改变，吸收峰产生位移，位移波长随DNA/ 药品复合物量增加而增加。利用紫外分光光度计进行紫外吸收光谱扫描，可观察到这些改变。荧光光谱移动法 原理是在激发光激发下，DNA-药品复合物荧光发射光谱发生改变，谱峰向短波方向移动，荧光强度增强，同时激发光谱说发生改变。用荧光分光光度计测定激发光谱和发射光谱可观察到这些改变。（四）药品造成DNA损伤彗星（Comet）微凝胶单细胞电泳法 正常DNA为负超螺旋结构， 在pH12.0时则完全解链。DNA受损后链断裂, 成为一个松散结构, 在电场作用下,松散DNA离开细胞核向正极移动, 形成彗星似拖尾,变换不一样pH缓冲液可检测断裂是双链还是单链。碱洗脱法 搜集细胞于滤膜上，用细胞溶解液裂解细胞并洗去RNA和蛋白质，暴露DNA，用洗脱液进行洗脱，若DNA发生链断裂，则易于经滤膜洗出。（五）药品对DNA拓扑异构酶影响DNA拓扑异构酶是调整DNA空间结构动态改变关键性核酶，分成拓扑异构酶I和II，抑制拓扑异构酶I能够造成DNA单链断裂，抑制拓扑异构酶II，可造成双链断裂，进而干扰DNA复制、重组和基因表示。试验原理是用从肿瘤细胞核提取拓扑异构酶II处理PBR322DNA，后者是一个质粒DNA，关键存在有超螺旋、缺口状和线性DNA三种形式，琼脂糖电泳上显示出三条带，在拓扑异构酶作用下超螺旋DNA解旋、断裂，电泳时超螺旋带减弱或消失，对应缺口环状或线性DNA增加。假如药品对拓扑异构酶含有抑制作用，则可见超螺旋带保留。此方法亦可改善为观察药品对拓扑异构酶功效促进和抑制作用。方法是选定不能使一定量DNA完全断裂量拓扑异构酶处理PBR322DNA后电泳可见超螺旋带，同时加入不一样浓度药品，假如药品抑制拓扑异构酶，则超螺旋带增强，若药品增强拓扑异构酶活性，则见螺旋带减弱或消失。（六）药品对细胞核酸代谢影响 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素标识前体物如3H-TdR，3H-UR可分别掺入到细胞DNA 和RNA中去， 用液闪法测定其同位素活性则可知细胞DNA和RNA 合成情况。（七）药品对肿瘤细胞凋亡诱导作用细胞凋亡是一个受基因调控细胞程序性死亡过程，细胞凋亡时表现为细胞体缩小，染色质浓缩成大小不等块状，并裂解为小片段。DNA断裂长度为核小体核苷酸长度(180200碱基对)整倍数，提取后一般琼脂糖电泳表现为特殊云梯状，凋亡小体形成。检验细胞凋亡方法有：1、荧光显微镜形态学检验 该方法是利用凋亡细胞染色质浓缩，DNA广泛裂解特征和荧光化合物可嵌入DNA分子或以静电相互作用和DNA分子结合原理，建立DNA荧光探针。常见方法是用Hoechst33342和PI联合染色，然后在荧光显微下用紫外光激发。凋亡细胞对Hoechst33342含有高摄取比，加之染色质高度浓缩，呈强蓝色荧光；正常细胞呈微弱荧光，坏死细胞则呈红色荧光（被PI染色）。2、流式细胞光度术 该方法原理是用DNA结合性荧光染料标识DNA， 因为细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶降解、断裂DNA，断裂生成小分子量DNA溢出细胞外，细胞内DNA总量降低，利用流式细胞光度术能够检测出DNA这种结构和量改变。3、琼脂糖电泳分析法 利用该方法可检测出呈云梯状寡聚核小体。（g）动物体内药品代谢动力学试验了解受试物在体内吸收、分布和排泄速度和蓄