低氧条件下M2型巨噬细胞外...恶性生物学行为的影响及机制_苏英.pdf

基金项目:青海省科技计划项目(2018 ZJ 793)作者简介:苏英，女，1985 06 生，学士，主治医师，E-mail:hutianhong86163 com收稿日期:2022 11 22低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响及机制苏英1，李富娟1*，王洋2(1青海省第五人民医院妇瘤科，西宁810001;2青海省第五人民医院中医科;*通讯作者，E-mail:546658156 qq com)摘要:目的探究低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌细胞生物学功能的影响及机制。方法人单核细胞系THP1 诱导分化为 M2 型巨噬细胞，提取并且鉴定正常培养条件下 M2 型巨噬细胞外泌体(N-M2 exo)以及缺氧培养条件下 M2型巨噬细胞外泌体(H-M2 exo)。SKOV-3 细胞分为 PBS 组、N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组，分别与 PBS、10 g/ml 的 N-M2 exo 和H-M2 exo 共孵育 48 h，CCK-8 法检测各组细胞增殖能力，Transwell 小室检测各组细胞迁移和侵袭能力，流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，Western blot 检测各组细胞 MEK 和 EK 的磷酸化水平。结果相比于 PBS 组，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组SKOV-3 细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显著增加(P0 05)，细胞凋亡水平显著下降(P 0 001)，MEK 和 EK 的磷酸化水平显著增加(P0 001)。相比于 N-M2 exo 组，H-M2 exo 组 SKOV-3 细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显著增加(P 0 05)，细胞凋亡水平显著下降(P0 001)，MEK 和 EK 的磷酸化水平显著增加(P0 001)。结论低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体促进卵巢癌细胞生长和转移，其机制可能与激活 MEK/EK 信号通路有关。关键词:低氧;巨噬细胞;卵巢癌;外泌体;MEK/EK 信号通路中图分类号:73731文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0440 06DOI:1013753/j issn1007 66112023 04 005Effect and mechanism of M2 macrophage exosomes on malignant biological behaviors of ovarian cancer cells under hypoxicconditionSU Ying1，LI Fujuan1*，WANG Yang2(1Department of Gynaecology and Oncology，Fifth People s Hospital of Qinghai Province，Xining810001，China;2Department of Traditional Chinese Medicine，Fifth People s Hospital of Qinghai Province;*Corresponding author，E-mail:546658156 qq com)Abstract:ObjectiveTo explore the effect and mechanism of M2 macrophage exosomes on the biological functions of ovarian cancercells under hypoxic conditionMethodsTHP1 was induced to differentiate into M2 macrophages，and the exosomes secreted by M2macrophages under normal and hypoxic culture conditions were extracted and identified，namely N-M2 exo and H-M2 exo SKOV-3cells were incubated with PBS，10 g/ml N-M2 exo and H-M2 exo for 48 h in PBS group，N-M2 exo group and H-M2 exo group，respectively CCK-8，Transwell and flow cytometry were used to detect the proliferation，the metastasis and the apoptosis，respectivelyThe phosphorylation levels of MEK and EK were detected by Western blotesultsCompared with PBS group，the proliferation，migration and invasion abilities of SKOV-3 cells were significantly increased in N-M2 exo group and H-M2 exo group(P0 05)，theapoptosis was significantly decreased(P0 001)，and the phosphorylation levels of MEK and EK were significantly increased(P 0 001)Compared with N-M2 exo group，the proliferation，migration and invasion abilities of SKOV-3 cells were significantlyincreased in H-M2 exo group(P 0 05)，the apoptosis was significantly decreased(P 0 001)，and the phosphorylation levels ofMEK and EK were significantly increased(P0 001)ConclusionUnder hypoxic condition，M2 macrophage exosomes could pro-mote the growth and the metastasis of ovarian cancer cells，which may be related to the activation of MEK/EK signal pathwayKey words:hypoxia;macrophages;ovarian cancer;exosome;MEK/EK signaling pathway卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤1，由于缺乏有效肿瘤筛查和诊断标志物，近 70%的患者在确诊时就已经处于肿瘤的中晚期，即使接受放化疗，患者预后较差，存在严重的肿瘤复发和转移等问题2，因此，非常需要寻求有效的新型治疗靶点。在肿瘤免疫的研究中，巨噬细胞主要分为 M1 和 M2 两种亚型，其中 M2 型巨噬细胞与肿瘤相关巨噬细胞相似，具有促进肿瘤病理进程的作用3。缺氧是肿瘤微环境的常见特征，可诱导肿瘤的生长、转移、血管新生、免疫逃逸等4。外泌体是一类细胞外纳米级囊泡，具有细胞间信息传递的作用5，研究表明 M2 型巨噬细胞来源的外泌体可促进肝癌等肿瘤生长6，044J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4然而 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌的影响以及缺氧条件诱导 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌的影响尚无研究。本研究通过观察缺氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌生长和转移的影响，探讨其作用机制。1材料与方法1 1材料人卵巢癌细胞系 SKOV-3 和人单核细胞系THP1 购自中国科学院上海细胞库，佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和白介素 4(interleu-kin-4，IL-4)均购自美国 Sigma 公司，FastQuant TKit、ealUniversal Color PreMix、Trizol 试 剂 购 自TIANGEN 公司，CD9、TSG101、CD81、p-MEK、MEK、p-EK、EK、GAPDH、山羊抗兔 IgG 购自武汉三鹰生物技术有限公司，CCK-8 检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒购自沈阳万类生物技术有限公司，HT7700 透射电镜购自日本 Hitachi 公司。1 2方法1 2 1细胞培养及 M2 型巨噬细胞诱导分化取液氮保存的 SKOV3 细胞和 THP-1 细胞迅速解冻，分别培养于含10%FBS 的 DMEM 和 DMEM/F12 培养基中。THP-1 与25 ng/ml 的 PMA 共孵育48 h，诱导THP-1 分化为 M0 型巨噬细胞，分化后的 M0 型巨噬细胞与50 ng/ml IL-4 和20 ng/ml IL-13 共孵育48 h(M0+IL-4+IL-13 组)，诱导 M2 型巨噬细胞分化7。正常条件下的 M2 型巨噬细胞(N-M2)置于含 5%CO2，37 的细胞培养箱中，缺氧诱导的 M2巨噬细胞(H-M2)置于含90%N2，5%CO2的培养箱中培养。1 2 2外泌体的提取与鉴定分别将 N-M2 和 H-M2 细胞以5 106个的量接种至10 cm 的培养皿中，收集细胞培养上清液，300g 离心 10 min，取上清，2 000g离心 10 min，取上清液，10 000g 离心 30 min，然后将上清液以 140 000g 离心 90 min，所得沉淀即为外泌体(N-M2 exo 和 H-M2 exo)，将外泌体用无菌PBS 400 l 重悬，80 条件下保存。所得外泌体滴加 20 l 至透射电镜所用铜网上，在红外灯下烘烤 10 min，使用磷钨酸染色 10 min，在 HT7700 透射电镜下观察外泌体结构。Western blot 法检测外泌体标志蛋白 CD9、TSG101、CD81。1 2 3细胞分组SKOV3 细胞分为 PBS 组、N-M2exo 组和 H-M2 exo 组，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组细胞分别与 10 g/ml 的 N-M2 exo 和 H-M2 exo 共孵育48 h，PBS 组与等体积的 PBS 溶液共孵育48 h。1 2 4qT-PC 检测 CD86、TNF-、CD163、IL-10、GAPDH mNA 表达量使用 Trizol 试剂提取 M0 巨噬细胞以及 M2 型巨噬细胞总 NA，然后使用核酸定量仪定量，取 2 l 的总 NA，使用 FastQuant TKit 将 NA 逆转为 cDNA，所得 cDNA 于80 条件下保存。使用 ealUniversal Color PreMix 试剂盒进行 qT-PC 反应，引物序列见表 1。反应体系为:SYB Green 20 l、Primer forward 0 8 l、Primerreverse 0 8 l、DEPC 水 6 l、Dye 0 4 l、cDNA 模板 2 l，反应条件为:95 预变性30 s，95 预变性15 s，60 退火1 min，72 延伸 1 min，循化 40 次后，72 彻底延伸 10 min。记录 Ct 值，以 GAPDH为内参，计算并比较 2 Ct值。表 1CD86、TNF-、CD163、IL-10 引物序列Table 1Primer sequences of CD86，TNF-，CD163，IL-10基因序列CD86Forward:5 TGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTC 3everse:5 ATCATTCCTGTGGGCTTTTTGTG 3TNF-Forward:5 GACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTA 3everse:5 CAGCCTTGGCCCTTGAAGA 3CD163Forward:5 TTTGTCAACTTGAGTCCCTTCAC 3everse:5 TCCCGCTACACTTGTTTTCAC 3IL-10Forward:5 GAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGA 3everse:5 AGGCTTGGCAACCCAGGTAAC 3GAPDHForward:5 ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 3everse:5 GCCATCACGCCACAGTTTC 31 2 5CCK-8 法检测细胞增殖能力取 SKOV3 细胞，以2 103/孔的接种量接种于96 孔板，细胞贴壁后，将孔内培养基更换为含 10 g/ml N-M2 exo、10 g/ml H-M2 exo 以及等体积 PBS 的 DMEM 完全培养基(N-M2 组、H-M2 组以及 PBS 组)，细胞继续培养，并且 24，48，72 h 取出对应的 96 孔板，每空加5 l CCK-8，混匀并孵育 4 h，酶标仪检测 450 nm 处各孔吸光度值(OD 值)。1 2 6流式细胞术检测细胞凋亡取 N-M2 exo组、H-M2 exo 组和 PBS 组 SKOV3 细胞 5 105个，根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，500 l Binding Buffer重悬 SKOV3 细胞，5 l Annexin-FITC 和 5 l PI室温染色15 min，并设置单阳性管和空白管，孵育后流式细胞仪检测各组细胞荧光值。1 2 7Transwell 小室法检测细胞迁移与侵袭能力144山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期将 Transwell(或铺有 50 l Matrigel 胶的 Tran-swell)放置于含 600 l DMEM 完全培养基的 24 孔板中，小室上层分别接种 5 000 个 PBS 组、N-M2 exo组和 H-M2 exo 组 SKOV39 细胞，细胞培养箱中培养24 h 后取出，用 PBS 清洗后，使用棉签擦除小室内部未贴壁细胞，然后用 4%多聚甲醛室温固定 15 min，用结晶紫染液室温染色 10 min，清洗晾干后拍照并计数。1 2 8Western blot 检测 CD9、TSG101、CD81、p-MEK、MEK、p-EK、EK 蛋白表达水平IPA 蛋白裂解液提取 N-M2 exo、H-M2 exo 及三组 SKOV3 细胞蛋白质，并取 10 g 进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，蛋白质条带明显分离后，湿法转至无水甲醇激活过的PVDF 膜上，转膜条件为 150 mA 电流下 1 5 h，转膜后 PVDF 膜室温封闭2 h 后，与 CD9、TSG101、CD81、p-MEK、MEK、p-EK、EK、GAPDH 一抗(稀释比为1 1 000)4 孵育过夜，然后与山羊抗兔 IgG 二抗(稀释比为1 2 000)室温孵育1 5 h，按照 ECL 试剂盒显影并拍照。1 3统计学分析使用 GraphPad prism 软件进行统计学分析与绘图，数据以均数 标准差表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，P 0 05 表示差异具有统计学意义。2结果2 1IL-4 和 IL-13 诱导 M2 型巨噬细胞的分化M0+IL-4+IL-13 共培养巨噬细胞中 CD163、IL-10 高于 M0 型巨噬细胞(t=15 86，11 34，P 0 001)，CD86、TNF-低于 M0 型巨噬细胞(t=24 62，51 96，P 0 001，见图 1)。与 M0+PBS 组细胞比较，P0 001图 1qT-PC 检测 IL-4+IL-13 共培养巨噬细胞中 CD163、IL-10、CD86、TNF-表达Figure 1Expression of CD163，IL-10，CD86，TNF-of macrophages after co-culture with IL-4 and IL-13 by qT-PC2 2外泌体鉴定结果透射电镜下观察到 N-M2 exo 和 H-M2 exo 粒径约 100 nm，“杯托”样(见图 2A)，Western blot 检测到 N-M2 exo 和 H-M2 exo 表达外泌体标志蛋白CD9、TSG101、CD81(见图 2B)。A 透射电镜观察外泌体结构B Western blot 检测外泌体中标志蛋白表达图 2外泌体形态和标志蛋白鉴定结果Figure 2Identification results of exosomes morphology and marker proteins244J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 42 3低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体促进卵巢癌细胞增殖与 PBS 组比较，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组SKOV3在 48，72 h 的 OD 值均增加(P 0 05，见图3)，说明 N-M2 exo 和 H-M2 exo 均能促进 SKOV3 细胞的增殖。与 N-M2 exo 组比较，H-M2 exo 组 SKOV3在24，48，72 h 的 OD 值也均增加(P 0 05)，说明缺氧条件能够促进 M2 exo 诱导 SKOV3 的增殖能力。2 4低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体抑制卵巢癌细胞的凋亡与 PBS 组比较，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组SKOV3凋亡水平均降低(P 0 001)，说明 N-M2 exo和 H-M2 exo 可抑制 SKOV3 细胞的凋亡。与 N-M2exo 组比较，H-M2 exo 组 SKOV3 细胞凋亡水平均亦降低(P 0 001)，说明缺氧条件能够促进 M2 exo对 SKOV3 凋亡的抑制作用。与 PBS 组比较，*P0 05，P0 001;与 N-M2 exo 组比较，#P0 001图 3N-M2 exo 和 H-M2 exo 对 SKOV3 细胞增殖能力的影响Figure 3Effects of N-M2 exo and H-M2 exo on the prolif-eration of SKOV3 cells与 PBS 组比较，P0 001;与 N-M2 exo 组比较，#P0 001图 4N-M2 exo 和 H-M2 exo 对 SKOV3 细胞凋亡的影响Figure 4Effects of N-M2 exo and H-M2 exo on the apoptosis of SKOV3 cells2 5低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体促进卵巢癌细胞迁移和侵袭与 PBS 组比较，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组SKOV3细胞迁移和侵袭数均增加(P 0 001)，说明N-M2 exo 和 H-M2 exo 可促进 SKOV3 细胞的迁移和侵袭能力，而 H-M2 exo 组 SKOV3 细胞的迁移和侵袭能力均高于 N-M2 exo 组(P 0 001，见图 5)。2 6低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体激活 MEK/EK 信号通路Western blot 检测结果显示，与 PBS 组比较，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组 SKOV3 细胞中 MEK 和EK 磷酸化水平显著增加(P 0 001)，说明 N-M2exo 和 H-M2 exo 均可显著激活 MEK/EK 信号通路。与 N-M2 exo 组比较，H-M2 exo 组 SKOV3 细胞中 MEK 和 EK 磷酸化水平亦增加(P 0 001，见图6)，说明缺氧调控可促进 M2 exo 对 MEK/EK 信号通路的激活。3讨论肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要免疫细胞之一8，研究表明肿瘤相关巨噬细胞所浸润的肿瘤组织中 T 细胞等免疫细胞浸润明显减少且抗肿瘤功能被显著抑制，对多种肿瘤的生长、转移、耐药等均发挥着关键的调控作用9。在卵巢癌中，Nowak 等 10 研究指出，肿瘤相关巨噬细胞能够促进肿瘤的发展，并且促进卵巢癌的化疗耐药。Yin 等 11 研究指出，肿瘤相关巨噬细胞在卵巢癌腹腔转移过程中促进肿瘤转移微球的形成。研究发现更多肿瘤344山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期与 PBS 组比较，P0 001;与 N-M2 exo 组比较，#P0 001图 5N-M2 exo 和 H-M2 exo 对 SKOV3 细胞迁移和侵袭能力的影响(10 倍)Figure 5Effects of N-M2 exo and H-M2 exo on the migration and invasion of SKOV3 cells与 PBS 组比较，P0 001;与 N-M2 exo 组比较，#P0 001图 6N-M2 exo and H-M2 exo 对 MEK/EK 信号通路激活的影响Figure 6Effects of N-M2 exo and H-M2 exo on the the activation of MEK/EK signal pathway相关巨噬细胞的调控机制对于寻找卵巢癌治疗的方法及新靶点至关重要。肿瘤相关巨噬细胞与 M2 型巨噬细胞相似，因此在体外可诱导 M2 型巨噬细胞来模拟肿瘤相关巨噬细胞，本文使用 IL-4 将 M0 型巨噬细胞诱导为 M2 型巨噬细胞，诱导后 M2 型巨噬细胞标志物 CD163 和 IL-10 表达上调，M1 型巨噬细胞标志物 CD86 和 TNF-表达下调，说明 M2 型巨噬细胞诱导成功，故收集诱导后的 M2 型巨噬细胞进行后研究。外泌体是一类由多种活细胞分泌的纳米级囊泡，可作为细胞间信息传递的载体而作用于靶器官和靶细胞。本文通过差速离心法提取 M2 型巨噬细胞的外泌体，在透射电镜下观察到 M2 型巨噬细胞外泌体形态呈“杯托样”，且表达外泌体标志蛋白，符合外泌体结构及生物学特征。将 M2 型巨噬细胞外泌体与卵巢癌细胞共孵育后发现，卵巢癌细胞SKOV3 的生长和转移能力均显著增加，所以推测M2 型巨噬细胞外泌体具有促进卵巢癌生长和转移的功能。已有研究表明肿瘤相关巨噬细胞分泌的外泌体可调控多种肿瘤的病理进程，例如，Zheng等12，13 研究表明，肿瘤相关巨噬细胞外泌体能够促进胃癌细胞的转移，亦可以通过转移 mi-21 而促进胃癌的顺铂耐药，与本研究结果相似。缺氧是实体瘤微环境的重要特征，是诱导肿瘤生长和转移的重要因素。Gu 等14 研究表明，缺氧时，肿瘤相关巨噬细胞外泌体能够促进肾透明质细胞癌的发展。本研究发现，缺氧诱导的 M2 型巨噬细胞外泌体相比于 M2 型巨噬细胞外泌体，能显著促进卵巢癌细胞 SKOV3 的增殖能力、迁移能力、侵袭能力，更显著抑制 SKOV3 的凋亡水平。在卵巢癌中，缺氧可通过多种途径诱导肿瘤的发生发展，Ding等15 研究表明，缺氧诱导的 HIF1 调控 COX2 促进卵巢癌进展，Feng 等16 发现，缺氧诱导的 mi-27a上调可促进卵巢癌的紫杉醇耐药，KDP 等17 研究表明，缺氧诱导的外泌体有助于形成更具侵袭性和耐药性的卵巢癌表型，本研究结果提示，缺氧环境中巨噬细胞外泌体是调控卵巢癌发展中重要途径，并且由于外泌体内含多种遗传物质，所以我们从外泌体444J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4中发现重要的调控基因，并将其作为靶点可能为针对卵巢癌缺氧相关治疗提供重要的思路。MEK/EK 信号通路是参与肿瘤病理过程的经典信号通路，同时也对巨噬细胞的活性有着关键的影响。Travs 等18 研究表明，MEK/EK 信号通路的激活与巨噬细胞的代谢密切相关，Kang 等19 研究表明，抑制 MEK/EK 信号通路可抑制 M2 型巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞。在卵巢癌中，Lu等20 研究发现，激活 MEK/EK 信号通路可促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究发现，M2 型巨噬细胞外泌体可激活 MEK/EK 信号通路，而缺氧诱导的 M2 型巨噬细胞所分泌的外泌体对MEK/EK 信号通路的激活作用更加显著。综上所述，M2 型巨噬细胞以及缺氧条件下诱导的巨噬细胞外泌体均可促进卵巢癌细胞的生长和转移，且缺氧条件下诱导的巨噬细胞外泌体作用更加显著，并且对 MEK/EK 信号通路的激活更显著。但是本研究也存在局限性，例如研究内容仅在细胞水平进行，后续研究还会进一步补充动物体内研究。并且本研究并未对外泌体中发挥调控作用的遗传物质进行进一步探究，所以本课题组也会在后续的研究中继续探究是外泌体中的何种物质发挥的上述功能及详细机制。参考文献:1Stewart C，alyea C，Lockwood S Ovarian cancer:an integratedreview J Semin Oncol Nurs，2019，35(2):151 156 2Morand S，Devanaboyina M，Staats H，et al Ovarian cancerimmunotherapy and personalized medicineJ Int J Mol Sci，2021，22(12):6532 6550 3Yamaguchi T，Fushida S，Yamamoto Y，et al Tumor-associatedmacrophages of the M2 phenotype contribute to progression ingastric cancer with peritoneal disseminationJ Gastric Cancer，2016，19(4):1052 1065 4Jing X，Yang F，Shao C，et al ole of hypoxia in cancer therapyby regulating the tumor microenvironmentJ Mol Cancer，2019，18(1):157 161 5Zhang H，Lu J，Liu J，et al Advances in the discovery of exo-some inhibitors in cancerJ J Enzyme Inhib Med Chem，2020，35(1):1322 1330 6Tian B，Zhou L，Wang J，et al mi-660-5p-loaded M2 macro-phages-derived exosomes augment hepatocellular carcinoma deve-lopment through regulating KLF3JInt Immunopharmacol，2021，101(12):108157 108168 7Pritchard A，Tousih S，Wang Y，et al Lung tumor-derived exo-somes promote M2 macrophage polarizationJ Cells，2020，9(5):1303 1322 8Vitale I，Manic G，Coussens LM，et al Macrophages andmetabolism in the tumor microenvironmentJCell Metab，2019，30(1):36 50 9Peng LS，Zhang JY，Teng YS，et al Tumor-associated mono-cytes/macrophages impair NK-Cell function via TGF1 in humangastric cancerJ Cancer Immunol es，2017，5(3):248 256 10Nowak M，Klink M The role of tumor-associated macrophages inthe progression and chemoresistance of ovarian cancer J Cells，2020，9(5):1299 1310 11Yn M，Li X，Tan S，et al Tumor-associated macrophages drivespheroid formation during early transcoelomic metastasis of ovariancancer J J Clin Invest，2016，126(11):4157 4173 12Zheng P，Luo Q，Wang W，et al Tumor-associated macrophages-derived exosomes promote the migration of gastric cancer cells bytransfer of functional apolipoprotein EJCell Death Dis，2018，9(4):434 447 13Zheng P，Chen L，Yuan X，et al Exosomal transfer of tumor-associated macrophage-derived mi-21 confers cisplatin resis-tance in gastric cancer cellsJ J Exp Clin Cancer es，2017，36(1):53 65 14Gu W，Gong L，Wu X，et al Hypoxic TAM-derived exosomalmi-155-5p promotes CC progression through Hu-dependentIGF1/AKT/PI3K pathwayJ Cell Death Discov，2021，7(1):147 159 15Ding Y，Zhuang S，Li Y，et al Hypoxia-induced HIF1dependentCOX2 promotes ovarian cancer progress J J Bioenerg Biomembr，2021，53(4):441 448 16Feng L，Shen F，Zhou J，et al Hypoxia-induced up-regulationof mi-27a promotes paclitaxel resistance in ovarian cancerJ Biosci ep，2020，40(4):BS20192457 BS20192466 17Dorayappan K，Wanner，Wallbillch JJ，et al Hypoxia-inducedexosomes contribute to a more aggressive and chemoresistant ova-rian cancer phenotype:a novel mechanism linking STAT3/abproteins J Oncogene，2018，37(28):3806 3821 18Traves P，De Atauri P，Marin S，et al elevance of the MEK/EK signaling pathway in the metabolism of activated macropha-ges:a metabolomic approachJ J Immunol，2012，188(3):1402 1410 19Kang H，Zhang J，Wang B，et al Puerarin inhibits M2 polariza-tion and metastasis of tumor-associated macrophages from NSCLCxenograft model via inactivating MEK/EK 1/2 pathway J IntJ Oncol，2017，50(2):545 554 20Hua F，Li Ch，Chen X，et al Daidzein exerts anticancer activitytowards SKOV3 human ovarian cancer cells by inducing apoptosisand cell cycle arrest，and inhibiting the af/MEK/EK cascadeJ Int J Mol Med，2018，41(6):3485 3492544山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期