miR-186-5p通过抑...通路改善脊髓损伤后神经修复_蔡军.pdf

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2018D01C011)作者简介:蔡军，男，1985 09 生，硕士，主治医师，E-mail:181106153 qq com收稿日期:2022 11 18mi-186-5p 通过抑制 HMGB1 信号通路改善脊髓损伤后神经修复蔡军，艾孜孜江买买塔吾拉，张玉新*(新疆喀什地区第一人民医院脊柱外科，喀什844000;*通讯作者，E-mail:zhang_yx1992163 com)摘要:目的探究 mi-186-5p 在脊髓损伤(SCI)中的变化及对神经修复的影响。方法将小胶质细胞分为对照组(正常培养)、脂多糖(LPS)组(1 g/ml LPS 刺激 24 h)、LPS+mi-186-5p-mimic 组(转染 mi-186-5p-mimic 后 1 g/ml LPS 刺激24 h)和 LPS+mi-186-5p-inhibitor 组(转染 mi-186-5p-inhibitor 后 1 g/ml LPS 刺激 24 h)。通过 T-PC 检测细胞中 mi-186-5p 水平，通过 T-PC 和 Western blot 检测细胞中高迁移率族蛋白 1(HMGB1)mNA 和蛋白表达水平，通过 ELISA 检测细胞中肿瘤坏死因子 (TNF-)和白细胞介素 6(IL-6)的水平。将大鼠分为假手术组、SCI+LV-NC 组和 SCI+LV-mi-186-5p 组，每组 10 只大鼠，假手术组大鼠仅行椎板切除术，其余组采用脊髓打击器建立 SCI 模型。建模后，假手术组大鼠正常饲养，SCI+LV-NC 组和 SCI+LV-mi-186-5 组大鼠分别脊髓注射空载体慢病毒和过表达 mi-186-5p 的重组慢病毒。通过T-PC 检测脊髓组织中 mi-186-5p 水平。通过 Western blot 检测脊髓组织中 HMGB1、Toll 样受体 4(TL4)、p-p65、total p65、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、血红素加氧酶 1(HO-1)、超氧化物歧化酶 1(SOD-1)、Bax 和 Bcl-2 的蛋白水平。ELISA 检测脊髓组织中的 TNF-和 IL-6 的水平;免疫荧光检测脊髓组织中的离子钙结合接头蛋白分子 1(IBA-1)、iNOS、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经丝蛋白 200(NF-200)的表达;通过 BBB 评分评价大鼠的运动功能;通过尼氏染色测定脊髓前角运动神经元数量。结果与对照组相比，LPS 组 mi-186-5p 表达降低(P 0 05)，而 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 水平升高(P0 05)。与 LPS 组相比，LPS+mi-186-5p-mimic 组 mi-186-5p 表达升高(P 0 05)，而 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 水平降低(P 005)。与 LPS 组相比，LPS+mi-186-5p-inhibitor 组 mi-186-5p 水平降低(P 0 05)，而 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 水平升高(P0 05)。与假手术组相比，SCI+LV-NC 组大鼠脊髓出现明显损伤，iNOS/IBA-1 比例升高(P 0 05)，TNF-和 IL-6水平升高(P0 05)，Bax 蛋白表达上调(P0 05)，Bcl-2、HO-1 和 SOD-1 蛋白表达下调(P 0 05)，GFAP 和 IBA-1 的阳性染色比例增加(P0 05)，HMGB1 和 TL4 的蛋白水平及 NF-B p65 的磷酸化水平增加(P 0 05)，BBB 评分降低(P 0 05)，脊髓前角运动神经元数量减少(P 0 05)。与 SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组脊髓损伤区域减少，iNOS/IBA-1比例降低(P0 05)，TNF-和 IL-6 水平降低(P0 05)，Bax 蛋白表达下调(P 0 05)，Bcl-2、HO-1 和 SOD-1 蛋白表达上调(P0 05)，GFAP 和 IBA-1 的阳性染色比例降低(P 0 05)，HMGB1 和 TL4 的蛋白水平及 NF-B p65 的磷酸化水平降低(P0 05)，BBB 评分升高(P 0 05)，脊髓前角运动神经元数量增多(P 0 05)。结论上调 mi-186-5p 通过抑制HMGB1/TL4/NF-B 通路提高了脊髓损伤大鼠的运动功能和神经修复。关键词:脊髓损伤;mi-186-5p;高迁移率族蛋白 1;HMGB1/TL4/NF-B 通路;神经修复中图分类号:363文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0470 10DOI:1013753/j issn1007 6611202304009Mi-186-5p improves nerve repair after spinal cord injury by inhibiting HMGB1 signaling pathwayCAI Jun，Aizizijiang Maimaitawula，ZHANG Yuxin*(Department of Spinal Orthopaedics，First People s Hospital of Kashi，Kashi844000，China;*Corresponding author，E-mail:zhang_yx1992163 com)Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of mi-186-5p in spinal cord injury(SCI)and its effect on nerve repairMethodsThe microglia were divided into control group(normal culture)，lipopolysaccharide(LPS)group(1 g/ml LPS for 24 h)，LPS+mi-186-5p-mimic group(1 g/ml LPS for 24 h after transfection with mi-186-5p-mimic)and LPS+mi-186-5p-inhibitor group(1 g/ml LPS for 24 h after transfection with LPS+mi-186-5p-inhibitor)The level of mi-186-5p in cells was detected by T-PC，the expression of high mobility group protein 1(HMGB1)mNA and protein was detected by T-PC and Western blot，and thelevels of tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin-6(IL-6)were detected by ELISA The rats were divided into shamgroup，SCI+LV-NC group and SCI+LV-mi-186-5p group，with 10 rats in each group The rats in sham group only received lami-nectomy，and SCI model was established using impactor in the other groups After modeling，the rats were fed normally in sham group，the rats were injected with empty vector lentivirus and recombinant lentivirus overexpressing mi-186-5p in SCI+LV-NC group and SCI+LV-mi-186-5 group，respectively The level of mi-186-5p in spinal cord tissue was detected by T-PC The protein levels ofHMGB1，Toll-like receptor 4(TL4)，p-p65，total p65，induction nitric oxide synthase(iNOS)，heme oxygenase-1(HO-1)，super-074J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4oxide dismutase-1(SOD-1)，Bax and Bcl-2 in spinal cord tissue were detected by Western blot The levels of TNF-and IL-6 in spinalcord tissue were detected by ELISA The expression levels of ionized calcium-binding adapter molecule 1(IBA-1)，iNOS，glialfibrillary acidic protein(GFAP)and neurofilament-200(NF-200)in spinal cord tissue were detected by immunofluorescence The motorfunction of rats was evaluated by BBB score The number of motoneurons in the anterior horn of spinal cord was measured by NisslstainingesultsCompared with control group，the expression of mi-186-5p was decreased in LPS group(P0 05)，while thelevels of HMGB1，iNOS，TNF-and IL-6 were increased(P 0 05)Compared with LPS group，the expression of mi-186-5p inLPS+mi-186-5p-mimic group was increased(P0 05)，while the levels of HMGB1，iNOS，TNF-and IL-6 were decreased(P 0 05)Compared with LPS group，the level of mi-186-5p was decreased in LPS+mi-186-5p-inhibitor group(P0 05)，while thelevels of HMGB1，iNOS，TNF-and IL-6 were increased(P 0 05)Compared with sham group，there was obvious spinal cordinjury in SCI+LV-NC group Compared with sham group，the proportion of iNOS/IBA-1 in SCI+LV-NC group was increased(P 005)，the levels of TNF-and IL-6 were increased(P0 05)，the expression of Bax protein was increased(P0 05)，the expres-sion levels of Bcl-2，HO-1 and SOD-1 protein were decreased(P0 05)，the positive staining proportions of GFAP and IBA-1 wereincreased(P0 05)，the protein levels of HMGB1 and TL4 and the phosphorylation level of NF-B p65 were increased(P0 05)，the BBB score was decreased(P005)，and the number of motoneurons in the anterior horn of spinal cord was decreased(P0 05)Compared with SCI+LV-NC group，the area of spinal cord injury in SCI+LV-mi-186-5p group was decreased，the proportion ofiNOS/IBA-1 was decreased(P0 05)，the levels of TNF-and IL-6 were decreased(P 0 05)，the expression of Bax protein wasdecreased(P 0 05)，the expression levels of Bcl-2，HO-1 and SOD-1 protein were increased(P 0 05)，the positive stainingproportions of GFAP and IBA-1 were decreased(P 0 05)，the protein levels of HMGB1 and TL4 and the phosphorylation level ofNF-B p65 were decreased(P005)，BBB score was increased(P 0 05)，and the number of motoneurons in the anterior horn ofspinal cord was increased(P0 05)ConclusionUp-regulation of mi-186-5p improves the motor function and nerve repair of SCIrats by inhibiting the HMGB1/TL4/NF-B pathwayKey words:spinal cord injury;mi-186-5p;high mobility group protein 1;HMGB1/TL4/NF-B pathway;nerve repair脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)会导致长期的身体损伤和残疾，严重影响患者的生活质量1。神经炎症是脊髓继发性损伤中的主要生物学事件2。损伤后，血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)的破坏会诱导血管炎性细胞进入脊髓病变区域3，而小胶质细胞则活化并释放大量的细胞因子，从而增加活性氧(reactive oxygen species，OS)的水平并进一步引起神经元死亡4。微小 NA(miNA)是由 20 24 个核苷酸组成的非编码小 NA 分子，主要参与各种靶基因的转录调控5。miNA 的异常与肿瘤形成、血管生成和脂质代谢改变等多种生理现象相关6。先前的研究表明 miNA 在脊髓损伤发生过程中发生变化，并且与多种神经病理学改变有关7。其他研究显示，mi-186-5p 是一种与 CXCL13 共定位的 microNA，脊髓中 mi-186-5p 过表达可降低 CXCL13 的表达水平，并降低神经病理性疼痛以及脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞活化8。另外，mi-186 可通过调节 NLP3 炎性小体信号抑制完全弗氏佐剂(com-plete Freund s adjuvant，CFA)诱导的小鼠三叉神经病理性疼痛9。还有一项研究表明，上调 mi-186-5p 可抑制脊髓缺血 再灌注损伤诱导的神经炎症10。上述研究提示，mi-186-5p 可能在脊髓损伤中扮演重要角色。因此，本研究检测了脊髓损伤模型大鼠中 mi-186-5p 的表达变化，并探讨可能涉及的分子机制。1材料与方法1 1材料大鼠小胶质细胞购自美国 ATCC;10%的胎牛血清(FBS)、1%的青霉素、1%的链霉素、DMEM/F12 培养基购自美国 Gibco 公司;Lipofectamine 2000购自美国 Invitrogen 公司;mi-186-5p 模拟物(mi-186-5p-mimic)或阴性对照模拟物(NC-mimic)以及mi-186-5p 抑制剂(mi-186-5p-inhibitor)或阴性对照抑制剂(NC-inhibitor)由生工生物工程(上海)股份 有 限 公 司 合 成;PGL3-HMGB1-WT 和 PGL3-HMGB1-MUT 荧光素酶报告载体由上海吉玛制药技术有限公司合成;双荧光素酶报告基因测定系统购自美国 Promega 公司;TIzol 试剂、NA 逆转录试剂盒、总蛋白提取试剂盒、苏木精 伊红(HE)染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;Quanti-Fast SYB Green T-PC 试剂盒购自德国 QIAGEN公司;StepOnePlusTM实时荧光定量 PC 系统购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司;尼氏染色液购自上海吉至生化科技有限公司;HMGB1 一抗、TL4 一抗、p-p65 一抗、total p65 一抗、iNOS 一抗、SOD-1 一抗、Bax 一抗、Bcl-2 一抗、IBA-1 荧光一抗、iNOS 荧174山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期光一抗、GFAP 荧光一抗、NF 200 荧光一抗、肿瘤坏死因子 (TNF-)ELISA 试剂盒、白细胞介素 6(IL-6)ELISA 试剂盒购自英国 Abcam 公司;HO-1 和GAPDH 一抗购自美国 Cell Signaling Technology 公司;HP 标记的山羊抗兔 IgG 购自北京义翘神州科技股份有限公司;DAPI 购自美国 SouthernBiotech 公司。1 2方法1 2 1小胶质细胞的培养将大鼠小胶质细胞培养在包含 10%的 FBS、1%的青霉素和 1%的链霉素的 DMEM/F12 培养基中。将所有细胞在含有 5%CO2的细胞培养箱中于 37 孵育至 85%融合。然后将细胞用于后续实验。1 2 2细胞分组及处理为了调控 mi-186-5p 在小胶质细胞中的表达水平，将小胶质细胞分为对照组、NC-mimic 组、mi-186-5p-mimic 组、NC-inhibitor组和 mi-186-5p-inhibitor 组。根据说明书，使用Lipofectamine 2000 将 NC-mimic、mi-186-5p-mimic、NC-inhibitor 和 mi-186-5p-inhibitor 分别转染至对应组的小胶质细胞，对照组细胞不进行转染。为了考察脂多糖(LPS)和 mi-186-5p 对小胶质细胞中 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 的影响，将小胶质细胞分为对照组、LPS 组、LPS+mi-186-5p-mimic 组和 LPS+mi-186-5p-inhibitor 组。对照组细胞不用 LPS 处理，其他组细胞用 LPS(1 g/ml)刺激 24 h，并收集蛋白质或 NA 提取物。1 2 3荧光素酶报告基因检测为了揭示 mi-186-5p 与 HMGB1 的靶向调控关系，将小胶质细胞分为 PGL3-HMGB1-WT+NC-mimic 组、PGL3-HMGB1-WT+mi-186-5p-mimic 组、PGL3-HMGB1-MUT+NC-mimic 组和 PGL3-HMGB1-MUT+mi-186-5p-mimic组。本研究通过生物信息学数据库(TargetScan)预测了 mi-186-5p 与 HMGB1 的 3UT 区存在多个结合位点。使用 Lipofectamine 2000 分别将 PGL3-HMGB1-WT 和 PGL3-HMGB1-MUT 与 mi-186-5p-mimic 或 NC-mimic 一起共转染到细胞中。48 h 后，使用双荧光素酶报告基因测定系统对转染细胞中的荧光素酶活性进行检测，用于确定小胶质细胞中mi-186-5p 和 HMGB1 的靶向调控关系。1 2 4实验动物从新疆维吾尔自治区实验动物研究中心(许可证号:SYXK(新)2016 0001)购买Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，6 8 周龄，平均体质量 210 g)，本研究内容经新疆喀什地区第一人民医院伦理委员会科研伦理委员会审批通过 2019 科研审(第 26 号)。为大鼠提供标准饲料和水，并在20 26、湿度为 55%65%、12 h/12 h 昼夜循环的条件下饲养。所有研究程序均经动物保护与使用委员会批准。1 2 5动物分组及处理将动物随机分为 3 组(每组 n=10):假手术组，仅进行椎板切除术;脊髓损伤组(SCI+LV-NC 组)，SCI 建模后注射5 l滴度为 3 0 108TU/ml 的空载体慢病毒(LV-NC);SCI+过表达 mi-186-5p 的重组慢病毒组(SCI+LV-mi-186-5p 组)，SCI 建模后注射 5 l 滴度为 3 0 108TU/ml 携带 mi-186-5p 的重组慢病毒(LV-mi-186-5p)。SCI 大鼠模型建立步骤:首先通过异氟烷吸入麻醉大鼠(4%诱导，2%维持，流量 0 6 L/min)。经过皮肤准备和消毒后，在 T10 脊髓节段处切开背部皮肤并暴露椎板。椎板切除后，将大鼠的 T10 脊髓节段用 Impactor Model脊髓打击器以中等撞击力(撞击头直径为 2 5 mm，质量 10 g，高度为 5 cm)撞击。撞击后，脊髓撞击区域水肿、出血，大鼠摆尾且呈痉挛样表明建模成功。重组慢病毒注射程序:用异氟烷吸入麻醉后，将大鼠其固定于立体注射架上，分别于脊髓受损处头、尾侧距损伤边缘 3 cm 处各取一个注射点，使用10 l微量注射器在每个注射点注射2 5 l LV-mi-186-5p 或 LV-NC，深度约为 1 5 mm。1 2 6大鼠 Basso、Beattie 和 Bresnahan(BBB)评分按 Basso 等 11 创立的评分方法对大鼠进行 BBB 评分，评分时间点为脊髓损伤后第1，3，7，14，21，28 天。12 7酶联免疫吸附测定脊髓组织中炎症介质在脊髓损伤建模 7 d 后，每组取 5 只大鼠，分离脊髓组织，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测脊髓组织中炎症介质的水平。脱颈处死大鼠，取出新鲜脊髓并置于 PBS 中。用 PBS 洗涤后，将以损伤为中心的脊髓节段(0 6 cm，约 60 mg)研磨成匀浆并在4 1 500 r/min 离心 10 min，收集上清液。按照说明书使用 ELISA 试剂盒检测小胶质细胞和脊髓组织中的炎症介质肿瘤坏死因子 (TNF-)和白细胞介素 6(IL-6)的水平。1 2 8免疫荧光测定脊髓组织中神经元标志物、小胶质细胞标志物和星形胶质细胞标志物的表达在脊髓损伤建模 7 d 后，每组取 5 只大鼠，分离脊髓组织并制作脊髓切片。通过免疫荧光分析神经元标志物神经丝蛋白 200(NF-200)、小胶质细胞标志物(IBA-1和 iNOS)和星形胶质细胞标志物(GFAP)的表达。用牛血清白蛋白对脊髓切片进行封闭，然后与一274J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4抗在 4 过夜孵育，荧光一抗包括 IBA-1(1 500)、iNOS(1 100)、GFAP(1 500)和 NF 200(1 200)。洗涤切片后，将样品与荧光二抗室温下避免光孵育1 h，并使用 DAPI 对细胞核染色。然后在显微镜下观察样品。使用 ImageJ 软件分析 IBA-1 或 GFAP 的阳性区域。1 2 9脊髓组织学染色评价脊髓组织形态和神经元数量在脊髓损伤建模 28 d 后，每组取 5 只大鼠，分离脊髓样品并固定在 4%多聚甲醛中，梯度乙醇中脱水，石蜡包埋，并切成 6 m 厚的切片。通过苏木精 伊红(HE)染色评价脊髓组织形态。通过尼氏染色测定脊髓前角运动神经元数量。使用德国Leica DM2000 显微镜获取图像。1 2 10T-PC 检测脊髓和小胶质细胞中 mi-186-5p 水平按照说明书使用 TIzol 试剂来提取脊髓和小胶质细胞的 NA，根据说明书使用 NA逆转录试剂盒对目标 NA 进行逆转录。使用QuantiFast SYB Green T-PC 试剂盒和 StepOne-PlusTM实时荧光定量 PC 系统进行定量分析。mi-186-5p 和 U6 的引物序列如下:mi-186-5p 正向引物:5 CTAGGTGGGCATAAATTTGATTAA 3，反向引物:5 TCAAGTGGATGTGGTCCTAG 3;U6正向引物:5 CTCAGGCTGGTGGAGTCCGCTT 3，反向引物:5 CTCGGGAGTGCTGGGGCAGCGC 3。12 11蛋白质印迹实验检测脊髓和小胶质细胞中HMGB1、TL4、p-p65、total p65、iNOS、HO-1、SOD-1、Bax 和 Bcl-2 的蛋白表达采用总蛋白提取试剂盒从大鼠脊髓组织和小胶质细胞中提取蛋白。BCA方法确定蛋白质浓度后，将等量的蛋白质通过 12%SDS-PAGE 分离，并将其转移至 PVDF 膜。然后与一抗在4 过夜孵育，本研究中使用的一级抗体如下:HMGB1(1 250)、TL4(1 500)、p-p65(1 1 000)、total p65(1 1 000)、iNOS(1 2 000)、HO-1(1 500)、SOD-1(1 300)、Bax(1 1 000)、Bcl-2(1 1 000)和GAPDH(1 2 000)。二抗是 HP 标记的山羊抗兔IgG(1 10 000)，将样品与二抗室温下避光孵育 1 h。使用增强的化学发光(ECL)试剂进行显影，GAPDH作为内参，使用 ImageJ 软件进行蛋白质定量分析。1 3数据分析使用 SPSS 18 0 统计软件进行数据分析，并将获得的数据表示为均值 标准差。使用单因素方差分析及 LSD 事后检验进行多组之间的比较，使用 t检验进行两组间的比较。P 0 05 表示差异具有统计学意义。2结果2 1HMGB1 是 mi-186-5p 的直接靶标荧光素酶报告基因检测结果显示，与 PGL3-HMGB1-WT+NC-mimic 组比较，PGL3-HMGB1-WT+mi-186-5p-mimic 组荧光素酶活性显著降低(P 0 05，见图 1)。与对照组和 NC-mimic 组比较，mi-186-5p-mimic 组 mi-186-5p 高表达;与对照组和NC-inhibitor 组 比 较，mi-186-5p-inhibitor 组 mi-186-5p 水平低表达(P 0 05，见图 2)。与对照组和NC-mimic 组比较，mi-186-5p-mimic 组 HMGB1 的mNA 和蛋白水平低表达;与对照组和 NC-inhibitor组比较，mi-186-5p-inhibitor 组 HMGB1 的 mNA和蛋白水平高表达(P 0 05，见图 2)。与 PGL3-HMGB1-WT+NC-mimic 组比较，P0 01图 1mi-186-5p 靶向调控 HMGB1Figure 1Mi-186-5p targets and regulates HMGB12 2mi-186-5p 对 LPS 诱导的小胶质细胞中HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 的影响与对照组相比，LPS 组 mi-186-5p 表达降低，而 HMGB1 和 iNOS 蛋白水平升高，TNF-和 IL-6 水平也显著升高(均 P 0 05，见图 3)。与 LPS 组相比，LPS+mi-186-5p-mimic 组 mi-186-5p 表达升高，而 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 的水平降低(均P 0 05，见图 3)。与 LPS 组相比，LPS+mi-186-5p-inhibitor 组 mi-186-5p 水平降低，而 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 水平升高(均 P005，见图3)。374山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期与对照组比较，P0 01;与 NC-mimic 组比较，#P0 01;与 NC-inhibitor 组比较，P0 05，P0 01图 2mi-186-5 对小胶质细胞中 HMGB1 表达的影响Figure 2Effects of mi-186-5 on the expression of HMGB1 in microglia与 control 组比较，*P0 05，P0 01;与 LPS 组比较，#P0 05，#P0 01图 3mi-186-5p 对 LPS 诱导的小胶质细胞中 HMGB1、iNOS、TNF-和 IL-6 的影响Figure 3Effect of mi-186-5p on HMGB1，iNOS，TNF-and IL-6 in LPS-induced microglia474J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 42 3mi-186-5p 在 SCI 大鼠脊髓中下调在建立 SCI 大鼠模型后 1 周内评估 mi-186-5p水平的变化，与假手术组比较，随着时间增加，SCI模型组大鼠脊髓中 mi-186-5p 的表达水平明显降低(P 0 05，见图 4)。2 4mi-186-5p 对 SCI 大鼠脊髓中小胶质细胞活化和炎症的影响与假手术组相比，SCI+LV-NC 组 iNOS/IBA-1比例和 TNF-、IL-6 水平均明显升高(P 0 05);与SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组 iNOS/IBA-1 比例和 TNF-、IL-6 水平均明显降低(P 0 05，见图 5)。与假手术组比较，*P0 05，P0 01图 4脊髓损伤后大鼠脊髓中 mi-186-5p 表达水平变化Figure 4Changes of mi-186-5p expression in spinal cordof rats after SCI与假手术组比较，*P0 05，P0 01;与 SCI+LV-NC 组比较，#P0 05，#P0 01图 5mi-186-5p 对 SCI 大鼠脊髓中小胶质细胞活化和炎症的影响Figure 5Effect of mi-186-5p on activation and inflammation of microglia in spinal cord of SCI rats574山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期2 5mi-186-5p 的过表达可稳定脊髓损伤后的抗氧化性并减少细胞凋亡与假手术组相比，SCI+LV-NC 组 Bax 蛋白表达上调，而 Bcl-2、HO-1 和 SOD-1 蛋白表达下调(P 005);与 SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组 Bax 蛋白表达下调，而 Bcl-2、HO-1 和 SOD-1蛋白表达上调(P 0 05，见图 6)。与假手术组比较，*P0 05，P0 01;与 SCI+LV-NC 组比较，#P0 05，#P0 01图 6mi-186-5p 对 SCI 大鼠脊髓中细胞凋亡和氧化应激的影响Figure 6Effect of mi-186-5p on apoptosis and oxidative stress in spinal cord of SCI rats2 6mi-186-5p 对 SCI 大鼠神经修复的影响与假手术组相比，SCI+LV-NC 组 GFAP 和 IBA-1的阳性染色比例显著增加(P 0 05);与 SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组 GFAP 和 IBA-1的阳性染色比例显著降低(P 0 05，见图 7)。2 7mi-186-5p 对 SCI 大鼠脊髓中 HMGB1/TL4/NF-B 通路活化的影响与假手术组相比，SCI+LV-NC 组 HMGB1 和TL4 的蛋白水平及 NF-B p65 的磷酸化水平均显著增加(P 0 05)。与 SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组 HMGB1 和 TL4 的蛋白水平及NF-B p65 的磷酸化水平均显著降低(P 0 05，见图 8)。2 8mi-186-5p 对 SCI 大鼠运动功能和组织学修复的影响脊髓损伤14，21，28 d 时，与假手术组相比，SCI+LV-NC 组大鼠的 BBB 评分显著降低(P 0 05);与SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组大鼠的 BBB 评分显著升高(P 0 05，见图 9)。在脊髓损伤 28 d，与假手术组相比，SCI+LV-NC 组大鼠的脊髓出现明显损伤，脊髓组织排列疏松，空泡化;与 SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组大鼠的损伤区域明显减少，脊髓组织排列更紧密规则(见图 10)。尼氏染色显示，与假手术组相比，SCI+LV-NC 组脊髓前角运动神经元数量减少，形态紊乱(P 0 05);与 SCI+LV-NC 组相比，SCI+LV-mi-186-5p 组大鼠的脊髓前角运动神经元数量明显增多(P 0 05，见图 10)。674J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4与假手术组比较，*P0 05，P0 01;与 SCI+LV-NC 组比较，#P0 05，#P0 01图 7mi-186-5p 对 SCI 大鼠神经修复的影响Figure 7Effect of mi-186-5p on nerve repair in SCI rats与假手术组比较，*P0 05，P0 01;与 SCI+LV-NC 组比较，#P0 05，#P0 01图 8mi-186-5p 对 SCI 大鼠脊髓中 HMGB1/TL4/NF-B 通路活化的影响Figure 8Effect of mi-186-5p on the activation of HMGB1/TL4/NF-B pathway in spinal cord of SCI rats774山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期与 SCI+LV-NC 组比较，#P0 05图 9mi-186-5p 对 SCI 大鼠损伤 4 周 BBB 评分的影响Figure 9Effect of mi-186-5p on BBB score of rats within4 weeks after SCI图 10mi-186-5p 对 SCI 大鼠损伤 28 d 脊髓形态的影响Figure 10Effect of mi-186-5p on the morphology of spinalcord in SCI rats at 28 d3讨论miNA 的异常改变可调节脊髓损伤后多种病理基因的表达。研究表明，靶向调节几种 miNA 可以促进神经功能恢复。例如，mi-133b 改善了小鼠脊髓损伤后的功能恢复12，mi-126 促进大鼠挫伤性脊髓损伤后的血管生成并减轻炎症13。尽管尚无文献报道 mi-186-5p 在脊髓损伤中的相关调节机制，但该分子已被证实是抗炎性靶标。本研究首先考察了脊髓损伤后 mi-186-5p 水平的变化，发现脊髓损伤后 mi-186-5p 被抑制。高迁移率族蛋白 1(high mobility group box-1protein，HMGB1)是一种众所周知的炎症反应调节因子，并且在脊髓损伤后异常表达。已有报道