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洋葱多糖提取工艺及其抗氧化活性研究摘 要 对洋葱多糖提取最适工艺条件、洋葱多糖脱蛋白方法及其抗氧化活性进行了研究。结果表明，提取洋葱多糖工艺条件为：提取时间5 h，提取温度80，料液比1：25。洋葱多糖最好脱蛋白方法为胰蛋白酶+Sevag法。洋葱多糖含有较强还原力，对超氧阴离子自由基、羟基自由基均表现出很好清除能力，且在一定范围内对二者清除作用展现良好量效关系。关键词 洋葱，多糖，提取，抗氧化Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Onion PolysaccharideAbstract The optimum extraction process and optimum method of removing protein and antioxidant activity of onion polysaccharide was investigated in this paperThe results showed that the optimum extraction condition was extracting time 5hextracting temperature 80 and the solid to liquid ratio of 1：25The optimum method of removing protein of onion polysaccharide was typsin combined with sevag methodThe onion polysaccharide had strong reducing power，and scavenging rate was liner with its concentration to a certain extentKey words onion，polysaccharide，extraction，antioxidation目 录1 材料和方法11.1 试验材料和试剂11.2 仪器11.3 试验方法11.3.1 洋葱多糖提取工艺11.3.2 洋葱多糖提取工艺正交试验设计21.3.3 洋葱多糖及蛋白质含量测定21.3.4 脱蛋白方法优选21.3.5 洋葱多糖判定31.3.6 洋葱多糖抗氧化活性测定32 结果和分析32.1 洋葱多糖提取正交试验结果和分析32.2 脱蛋白方法探讨42.3 多糖判定结果42.4 抗氧化测定结果52.4.1 洋葱多糖对超氧阴离子自由基清除效果52.4.2 洋葱多糖对羟基自由基清除效果52.4.3 洋葱多糖还原能力测定结果63 结 论6洋葱(Allium cepa L)为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)植物，近代医学研究发觉，洋葱含有硫化物、类黄酮、苯丙素酚类、甾体皂苷类、含氯化合物、前列腺素类和多糖等多个化学成份，含有消炎抑菌、防癌抗癌、利尿止泻及降血糖、降血脂、降胆固醇、降血压、抗血小板凝聚、预防心脑血管病、抗氧化、美容等多个药理作用。现在，对洋葱中活性成份研究还关键集中在含硫化合物上，对洋葱多糖研究极少，中国在此方面研究更少。多糖是一类广泛存在于动植物、微生物细胞中关键生物大分子物质。伴随分子生物学研究进展，大家逐步发觉不一样起源多糖含有广泛而复杂生物学活性，已引发医药界高度重视，并成为当今生命科学研究热点之一。本试验以热水浸提、乙醇沉淀方法从洋葱中提取多糖，为深入开发洋葱保健作用提供理论依据。1 材料和方法1.1 试验材料和试剂新鲜洋葱，购于凤阳县农贸市场；无水乙醇，上海振企化学试剂；苯酚，国药集团化学试剂；葡萄糖，中国医药集团上海化学试剂企业；1-一萘酚，中国医药集团上海化学试剂企业；NBT，国药集团化学试剂；L一甲硫氨基酸，国药集团化学试剂；硫代巴比妥酸，国药集团化学试剂；核黄素，中国医药集团上海化学试剂企业；FeSO4，中国医药集团上海化学试剂企业。1.2 仪器HH-4水浴锅，国华电器；TDL一5离心机，上海安亭科学仪器厂；Phs一3C精密pH计，上海精密科学仪器；UV一3501紫外一可见分光光度计，天津港东科技发展。1.3 试验方法1.3.1 洋葱多糖提取工艺残渣加去离子水水浴抽滤滤液旋转蒸发浓缩Sevag法去蛋白糖液中加入4倍无水乙醇静置过夜4200rmin离心20min残渣中倒入无水乙醇搅拌4200rmin 离心2Omin 残渣中加入丙酮搅拌420Ormin离心20min残渣在40 温度下烘干洋葱多糖粗品1.3.2 洋葱多糖提取工艺正交试验设计已经有研究结果表明，影响多糖提取得率关键原因有：温度、时间、液料比等。依据预试验结果，选择浸提时间、浸提温度、液料比3项为考察原因，取3个较优水平，进行正交试验设计，原因水平见表1。1.3.3 洋葱多糖及蛋白质含量测定多糖含量测定：苯酚一硫酸法。蛋白质含量测定：紫外吸收法。1.3.4 脱蛋白方法优选水提法提取多糖，其蛋白质占有很大百分比。所以，尽可能多地除去蛋白质而保留多糖就显得比较关键。为了探讨洋葱多糖脱蛋白最好方法，本试验以蛋白质清除率及多糖损失率为指标，优化出洋葱多糖脱蛋白方法。（1） Sevag法依据蛋白质在CHC1 等有机溶剂中变性特点，取50 mL多糖液，加入多糖溶液体积15CHCl3，再加入CHC13体积15正丁醇，混合后，猛烈振荡20 min，4 500 rmin离心10min除去变性蛋白质沉淀，取水相。反复2次，脱蛋白液醇沉，离心，低温干燥。（2） 三氯乙酸法取50 mL多糖液，用10 三氯乙酸调整pH至30，放置过夜。在4 500 rmin条件下离心10min，弃去沉淀，反复2次，脱蛋白液醇沉，离心，低温干燥。1.3.4.3 胰蛋白酶+Sevag法取50 mL多糖液，调整pH到85，按ES=5将酶加入多糖溶液中，于37 恒温磁力搅拌器中保温5 h，再按1341方法脱蛋白。1.3.5 洋葱多糖判定(1)观察多糖形状、颜色，并将少很多糖加入水、乙醇、乙醚、丙酮和正丁醇等试剂中，观察其溶解性。(2)将多糖溶解在蒸馏水中，配制成浓度为1mgmL溶液，在220400 nm波长下扫描，观察其扫描图谱。(3)经过Molish反应、Fehling试剂反应、碘一碘酸钾反应来判定洋葱多糖。1.3.6 洋葱多糖抗氧化活性测定清除超氧阴离子自由基能力测定：NBT光还原法。清除羟基自由基能力测定：D2一脱氧核糖法。还原能力测定。2 结果和分析2.1 洋葱多糖提取正交试验结果和分析正交试验结果见表2。由表2能够看出，影响洋葱多糖得率所选原因主次次序为ABC；提取洋葱多糖最好工艺条件为A3B3C2，即提取时间为5 h，浸提温度为80 ，液料比为1：25，此条件下洋葱多糖提取率最大，为486 。2.2 脱蛋白方法探讨试验结果见表3由表3可知，三氯乙酸法对蛋白质去除能力最强，达8692 ，同时多糖损失率也最大，达9165 ，且此法较为猛烈，轻易引发一些多糖降解，所以该法不适合洋葱多糖脱蛋白。Sevag法对于蛋白质去除率也较高，但一样多糖损失率偏大，达7802。该法对糖结合蛋白去除效果不好，轻易和多糖一起絮凝沉淀，造成样品多糖损失。文中首次尝试采取胰蛋白酶和Sevag法相结合，利用胰蛋白酶切断蛋白链，水解大部分结合蛋白和游离蛋白，再配以Sevag法脱蛋白，其脱蛋白效果同Sevag法相当，但多糖损失大大降低。2.3 多糖判定结果经胰蛋白酶+Sevag法得到洋葱多糖为黄白色粉末，可溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇等有机溶剂，其水溶液透明，较高浓度时呈粘稠状。多糖在220 nm处会展现特征吸收峰，所以，图1为经典多糖图谱，从该图可看出，在220 nm 以后，伴随波长增加，多糖吸光度值快速降低，但在280 nm处仍有微弱紫外吸收，说明经胰蛋白酶+Sevag法脱蛋白后洋葱多糖仍含有少许蛋白质。洋葱多糖碘一碘酸钾反应呈阴性(未出现兰色)，Fehling试剂反应为阳性(试管底部出现砖红色沉淀)，Molish反应为阳性(两液层之间出现紫红色)，表明它是一个水溶性、非淀粉还原性多糖。2.4 抗氧化测定结果现在，用于研究抗氧化剂抗氧化活性方法有多个，利用化学模拟体系研究物质是否含有抗氧化活性方法，体系稳定，操作简便，药品价廉，是一个很好筛选抗氧化活性物质方法。本试验就采取了这种方法首次研究了洋葱多糖体外抗氧化活性。2.4.1 洋葱多糖对超氧阴离子自由基清除效果超氧阴离子自由基是基态氧接收一个电子后形成第一个氧自由基，能够经过一系列反应生成其它氧自由基，洋葱多糖对超氧阴离子自由基有较强清除能力，伴随洋葱多糖浓度增加，对超氧阴离子自由基清除作用增强，在一定浓度范围内对超氧阴离子自由基清除作用展现很好量效关2.4.2 洋葱多糖对羟基自由基清除效果羟基自由基化学性质很活泼，可损伤蛋白质、核酸、脂质等多个生物大分子，尤其对脂质过氧化作用最强。洋葱多糖对羟基自由基有良好清除能力，其效果和多糖添加量呈正相关性。随多糖添加量增大，对羟基自由基清除率不停增加，展现出良好量效关系。2.4.3 洋葱多糖还原能力测定结果Yen等人研究表明，抗氧化剂还原力和其抗氧化活性之间存在联络。抗氧化剂是经过本身还原作用给出电子而清除自由基，还原力越大，抗氧化性越强。所以可经过测定还原力来说明抗氧化活性强弱。洋葱多糖还原力较强，且还原能力伴随多糖浓度增加而增大，提醒洋葱多糖抗氧化能力伴随多糖浓度增加而增强。3 结 论(1)正交试验及极差分析结果表明：在本试验条件下提取时间是影响洋葱多糖得率最关键原因，洋葱多糖提取最好工艺条件为：提取时间5 h、提取温度80 、料液比1：25。在此条件下洋葱多糖提取率为486。(2)洋葱多糖提取液脱蛋白方法中比较了三氯乙酸法、Sevag法，并首次尝试了胰蛋白酶+Sevag法，结果表明胰蛋白酶+Sevag法不仅脱蛋白效果好而且多糖损失率低，适合洋葱多糖脱蛋白。(3)洋葱多糖抗氧化活性测定结果表明洋葱多糖含有较强还原能力，对超氧阴离子自由基、羟基自由基全部有很好清除能力，且在一定范围内对二者清除作用展现良好量效关系。(4)洋葱多糖含有抗氧化活性使其有望作为天然抗氧化剂和功效性食品而得到开发应用，含有较高研究开发价值。对于洋葱多糖其它方面如分离纯化、组份判定、分子量测定和其它生物活性测定等还有待于以后深入研究。参 考 文 献1 冯长根，吴悟贤，刘霞，等洋葱化学成份及药理作用研究进展J上海中医药杂志，37(7)：64652 丘玉昌，吴曙光，徐伟米糠多糖提取及其免疫调整作用J中国生化药品杂志，1999，20(2)：91933 董群，郑丽伊，方积年改良苯酚一硫酸法测定多糖和寡糖含量J中国药学杂志，1996，31(9)：5505524 李建武生物化学试验原理和方法M北京：北京大学出版社，19941711735吕淑霞基础生物化学试验指导M北京：中国农业大学出版社，77826陈丹，包国荣，黄鑫，等闽产木立芦荟多糖分离纯化及初步分析J福建医科大学学报，36(2)：1931957赵保路氧自由基和天然抗氧化剂M北京：科学出版社。199978张惟杰复合多糖生化研究技术M上海：上海科学技术出版社19879吴东儒主编糖类生物化学M北京：高教出版社，198710马钊,李景明,李丽梅,王辉,倪元颖. 洋葱多糖提取工艺研究J食品工业科技, ,(05) . 11 黄爱民, 马林, 杨华, 廖丹葵, 黄祖强. 洋葱多糖提取工艺改善J. 安徽农业科学, , (10) 12 李义, 陈星, 李红霞, 韦绪, 刘峰. 马兰水溶性粗多糖提取工艺研究J. 农业工程学报, , (01) 13侯英梅, 吴少福, 沈勇根. 生姜多糖提取工艺研究J. 江西农业大学学报, , (03)