基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS雀嘴茶醇提液的成分及活性研究.pdf

2024.44(1:176-184学报（自然科学）引文格式：王文博，袁甜甜，吕玉秀，李.基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS雀嘴茶醇提液的成分及活性研究 J.西南林业大学Jan.2024JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITY2024年1月Vol.44No.1南西报学学业第44卷林第1期DOI:10.11929/j.swfu.202209043基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS 雀嘴茶醇提液的成分及活性研究王文博！袁甜甜！吕玉秀刘桢谢东1张璟雯！赵平！陈保森？#杨晓琴1（1.西南林业大学西南地区林业生物质资源高效利用国家林业和草原局重点实验室，云南昆明6 50 2 33；2.云南维泰生物科技有限公司，云南昆明6 517 0 0）摘要：基于超高效液相色谱串联四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速分析雀嘴茶醇提液的成分，对其体外抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性进行研究。结果表明：从雀嘴茶醇提液中鉴定出132 1个代谢物，其中有10 8 5个代谢物包括11个超类匹配到人类代谢数据库中，含量较高的活性代谢物，包括新甘草苷、扁蓄苷、醋硝香豆素、榭皮素-3-O-葡萄糖苷桂皮质B1等苯丙素类和芳香聚酮类、咖啡因等有机杂环化合物类、阿糖腺等核苷酸及其衍生物以及1-咖啡酰-D-葡萄糖、3-O-阿魏酰奎尼酸、绿原酸、2-O-咖啡酰熊果苷等咖啡酰类。雀嘴茶醇提液的DPPH清除率可达93.56%，ABTS+清除率可达99.0 4%，OH清除率可达94.8 2%，总还原能力随着醇提液中总多酚浓度的增加而升高且效果极为接近阳性对照抗坏血酸；对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制率分别可达81.50%和58.58%。关键词：雀嘴茶；醇提液；静电场轨道阱高分辨质谱；抗氧化；酪氨酸酶；活性代谢物中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：2 0 95-1914(2 0 2 4)0 1-0 17 6-0 9Composition and Activity Analysis of Alcohol Extract of Quezui TeaBased on UHPLC-Q-Orbitrap HRMSWang Wenbo,Yuan Tiantian,Lv Yuxiu,Liu Zhen,Xie Dong,Zhang Jingwen,Zhao Ping,Chen Baosen2,Yang Xiaoqin(1.Key Laboratory of National Forestry and Grassland and Administration on Highly Efficient Utilization of Forestry Biomass Resources,Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650233,China;2.Yunnan Weitai Biotechnology Co.,Ltd.,Kunming Yunnan 651700,China)Abstract:To explore its active ingredients,this paper analyzed its alcohol extract based on UHPLC-QOr-bitrap HRMS,and further studied its antioxidant activity and tyrosinase inhibitiory activity.The results showedthat 1321 metabolites were identified from the alcohol extract,of which 1085 metabolites,including 11 super-收稿日期：2 0 2 2-0 9-17；修回日期：2 0 2 3-0 2-14基金项目：国家自然科学基金项目（32 0 6 0 32 7，32 0 6 0 10 7）资助；云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目（2 0 2 2 0 5A C16 0 0 49）资助；云南省教育厅科学研究基金项目（2 0 2 1Y213，2 0 2 2 Y56 4）资助；云南省大学生创新创业训练计划项目（2 0 2 110 6 7 7 0 2 2）资助；西南林业大学科技创新基金项目（KB21001，K B2 10 14，K Y2 10 0 4）资助。第1作者：王文博（1998），男，硕士研究生。研究方向：天然产物化学。Email:。通信作者：杨晓琴（198 7 一），女，博士，副教授，硕士生导师。研究方向：天然产物化学。Email:。177第1期王文博等：基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS雀嘴茶醇提液的成分及活性研究classes were matched to the human metabolic database(HMDB).The high content of the active metabolites suchas phenylpropanoids and polyketides include neoliquiritin,quercetin 3-arabinoside,acenocoumarol,quercetin3-O-glucoside,epicatechin-(27,48)-epicatechin-(48)-epicatechin,organoheterocyclic compoundsinclude caffeine,nucleosides,nucleotides,and analogues include vidarabine,as well as caffeyl compounds in-clude quercetin 3-0-glucoside,3-0-feruloylquinic acid,chlorogenic acid,and 2-0-caffeoylarbutin.In addition,the scavenging rates of DPPH:,ABTS+:,and-OH of the Quezui tea alcohol extract can reach 93.56%,99.04%,and 94.82%,respectively.And the total reduction capacity increased with the increase of the total polyphenolsconcentration of alcohol extract,and the effect was very close to the positive control ascorbic acid.The inhibitionrates of monophenolase and diphenolase were 81.50%and 58.58%,respectively.Key words:Quezui tea;alcohol extract;UHPLC-Q-Orbitrap HRMS;antioxidant;tyrosinase;active meta-bolite雀嘴茶由一种樟叶越桔（Vacciniumdunalian-um)叶芽炮制而成茶饮，是云南彝族民间特有的保健饮品，富含咖啡酰类、黄酮类等活性物质!，也是天然的膳食酚类的丰富来源，被报道具有多种药理作用如抗氧化、降血糖和抗炎等 2 ；此外，雀嘴茶也被用作治疗糖尿病、高血脂和关节风湿病的中药 3-4。抑制酪氨酸酶活性是目前筛选美白产品的一种方法，通过这种方法可以减少黑色素的生成，进而达到美白的目的，从天然植物中发掘酪氨酸酶抑制剂是当前行业研究的热点 5-6 。有研究表明，富含多酚类物质的提取物对酪氨酸酶具有较好的抑制能力 7 ，Xu等 8 从雀嘴茶中分离出的咖啡酰类物质在斑马鱼模型中有较好的黑色素抑制作用。此外，多酚类化合物还具有高效抗氧化性能和多种自由基清除能力 9，雀嘴茶中多酚化合物含量丰富，远高于市面上常见的茶类 10 ，是潜在的天然抗氧化剂和酪氨酸酶抑制剂来源。雀嘴茶作为民间保健茶饮，对其成分进行深人分析并加以开发利用意义重大。目前对雀嘴茶的研究主要集中在雀嘴茶中活性分子提取纯化工艺方面 1，但对其成分分析、抗氧化活性以及酪氨酸酶抑制活性的研究均鲜见报道。超高效液相色谱串联四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-OrbitrapHRMS）技术具有高分辨率和高分离度的特点112 ，可以对样品实现快速准确的分析，允许基于精确质量测量的精确定量 13。因此，本次研究中通过超声辅助提取制备了雀嘴茶醇提液并通过UHPLC-Q-OrbitrapHRMS技术对其成分进行快速分析，通过DPPH：、ABTS+、O H 清除能力以及总还原能力来综合评价雀嘴茶醇提液的抗氧化能力，同时检测了雀嘴茶醇提液的酪氨酸酶抑制活性。本研究旨在为雀嘴茶的药食两用开发提供科学依据并为雀嘴茶资源的高值化综合利用提供一定的理论基础以及数据支撑。1实验材料与方法1.1材料与试剂雀嘴茶成品（叶芽）购于云南省武定县，选取完整饱满的雀嘴茶进行粉碎、过筛得到6080目粉末，在6 0 下烘干4h，于4下保存备用。没食子酸标准品（98%）、福林酚、碳酸钠（Na2CO3）、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、抗坏血酸（Vc）、2,2-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、铁氰化钾、蘑菇酪氨酸酶（EC1.14.18.1,25KU）、磷酸盐缓冲溶液（pH=6.86,PBS）、L-酪氨酸及其他常规试剂均购自上海泰坦科技股份有限公司，未经处理直接使用1.2实验方法1.2.1雀嘴茶醇提液的制备参考文献 11 并稍做修改，精确称取2.0 0 0 0 g雀嘴茶粉末，按照1：30（g/mL）的料液比，用甲醇于室温条件下浸泡2 h，然后在6 0 下超声回流提取2 h，经过滤后的滤渣在相同条件下重复提取1次，合并2 次提取所得醇提液并浓缩至一定体积，用蒸馏水定容至50 mL备用。1.2.2雀嘴茶醇提液成分分析采用12 0 0 s超高效液相色谱（安捷伦科技公司，美国）串联JMS-800D高分辨辩质谱（日本电178西南林业大学学报第44卷子株式会社，日本）联用仪（UHPLC-Q-Orbit-rapHRMS）对雀嘴茶醇提液进行非靶代谢物定性检测。超高效液相色谱的色谱柱为Waters HSST3（10 0 2.1m m，1.8 m），柱温40，进样量2 L，流速0.3mL/min，采用梯度洗脱，其中流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈-异丙醇，洗脱梯度为0.0 2.0 minA/B（9 0:10 V/V），6.0 15.0 m in A/B（40:6 0V/V），15.117.0 m in 水/乙腈（90:10 V/V）。高分辨质谱采用电喷雾离子源（ESI），其中鞘气40psi，辅助气10 psi，离子喷雾电压30 0 0 V/-2800V，温度350，离子传输管温度32 0，扫描模式为Full-scanMS2模式，扫描模式为正离子（ESI）/负离子（ESI），一级扫描范围为O1050Da，分辨率7 0 0 0 0，二级扫描范围为2 0 0 2000Da，分辨率17 50 0。采用 Progenesis QI（W a t e r s Co r p o r a t i o n，M i l-ford,USA）软件对原始数据进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵1.2.3雀嘴茶醇提液总多酚和总黄酮含量测定采用Folin-Ciocalter方法测定雀嘴茶醇提液中总多酚含量，并对其进行了适当改进。向比色管中加人福林酚试剂0.5mL，混匀，室温下反应8min，加人1.5mL20%的NazCO，溶液，然后加蒸馏水定容至10 mL。混匀后避光反应1.5h，以不加标准液的蒸馏水为空白对照，取2 0 0 L反应液于酶标仪7 6 0 nm处检测吸光值，每个样品平行测定3次。使用酶标仪在7 6 0 nm处测定吸光值，使用基于吸光度标准曲线的线性方程（y=55.0196x-0.0191，R=0.9992），计算雀嘴茶醇提液中的总多酚含量。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定总黄酮含量。向10 mL比色管中加加人7 0%乙醇溶液至5mL，加人5%NaNOz溶液0.4mL，摇匀，放置6 min；加人10%Al(NO3)溶液0.4mL，摇匀，放置6 min；加人4.0 mL5%的NaOH溶液，再加70%乙醇至刻度，摇匀，放置15min。以不加标准液的7 0%乙醇溶液为空白对照，取2 0 0 L反应液于酶标仪510 nm处检测吸光值，使用基于吸光度标准曲线的线性方程（y=5.9296x+0.0007，R=0.9993），计算雀嘴茶醇提液中的总黄酮含量1.2.4雀嘴茶醇提液体外抗氧化活性测定1）D PPH 清除能力测试参照文献 14 并稍做修改。使用50%乙醇制备0.0 4mg/mL的DPPH溶液和不同浓度的雀嘴茶醇提液，将10 0 LDPPH溶液与2 mL雀嘴茶醇提液混匀即为A1；将等量的无水乙醇与雀嘴茶醇提液混匀，即A2；将等量的DPPH溶液与无水乙醇混勾，即A3。于37 下避光反应30 min后采用SpectraMax?190光吸收型酶标仪（美谷分子仪器有限公司，美国）测定517 nm处的吸光值。每组实验设置3个平行，所得数据取平均值。以Vc为阳性对照，并按式2计算雀嘴茶醇提液的DPPH清除率。DPPH清除率=X100%(1)2）A BT S+清除能力测试参照文献 15 并稍做修改。将 7 mmol/L ABTS溶液和 2.45 mmol/LK,S0溶液混合后于室温下避光反应12 16 h作为ABTS+工作液，使用前将工作液在30 时734nm处的吸光值调整为0.7 0 0.0 2。加人10 0 L雀嘴茶醇提液和3.5mLABTS+工作液作为A4；将等量的无水乙醇与雀嘴茶醇提液混匀，即As；将等量的ABTS+工作液与无水乙醇混匀，即A6。于30 下反应6 min后测定7 34nm处的吸光值。每组实验设置3个平行，所得数据取平均值。以Vc为阳性对照，按式3计算雀嘴茶醇提液的ABTS+清除率。ABTS+清除率=100%(2)63）O H 清除能力测试首先配制8.8 mmol/LH,O2溶液、9mmol/LFeSO4溶液和9mmol/L水杨酸溶液。先后向离心管中加人50 0 LFeSO4溶液、50 0 L不同浓度的雀嘴茶醇提液和50 0 LH,02溶液，静置10 min后加人50 0 L水杨酸，即A7；以蒸馏水代替A中的水杨酸，即A8；以蒸馏水代替A，中的雀嘴茶醇提液，即Ag。摇匀后静置30 min，50 0 0 r/m i n 下离心5min，测定510nm处的吸光值。每组实验设置3个平行，所得数据取平均值。以Vc为阳性对照，按式4计算雀嘴茶醇提液的OH清除率。OH清除率=Ag100%(3)4）总还原能力测试首先移取50 0 L磷酸盐缓冲液（pH=6.6）和50 0 L1%KFe(CN)溶液，然后加人2 0 0 L雀嘴茶醇提液，于50 下反应2 0 min后加人50 0 L10%三氯乙酸溶液，179第1期王文博等：基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS雀嘴茶醇提液的成分及活性研究3000r/min离心10 min后取40 0 L上清液，加人500L蒸馏水和10 0 L0.1%FeCl，溶液，静置10 min后测定其7 0 0 nm处的吸光值。每组实验设置3个平行，所得数据取平均值。以Vc为阳性对照，吸光值的大小与雀嘴茶醇提液的总还原能力成正比，吸光值越大则总还原能力越强1.2.5雀嘴茶醇提液酪氨酸酶活性抑制能力测定首先配制pH=6.86的磷酸盐（PBS）缓冲溶液和1mmol/LL-酪氨酸溶液，并用STARTER2100pH计（奥豪斯仪器（上海）有限公司，美国）测定其pH值后于4保存待用。以L-酪氨酸为底物测定酪氨酸酶活性抑制实验：依次向96 孔板中加人40 L酪氨酸酶溶液、140LPBS溶液、2 0 L底物，混匀后作为实验组一；依次向96 孔板中加人18 0 LPBS溶液、20L底物，混匀后作为实验组二；依次向96 孔板中加人40 L蘑菇酪氨酸酶溶液、40 L雀嘴茶醇提液、10 0 LPBS溶液、2 0 L底物作为实验组三；依次向96 孔板中加人40 L雀嘴茶醇提液、140 LPBS溶液、2 0 L底物，混匀后作为实验组四。每组样品设置3个平行，在30 下孵育30 min，混匀后用酶标仪连续30 min检测溶液在47 5nm处吸光值，按式（4）计算抑制率二1-(A12-A13)X100%(4)(A1o-A1)式中：A1o为实验组一的吸光度；A11为实验组二的吸光度；A12为实验组三的吸光度；A13为实验组四的吸光度1.3分析方法试验数据应用Origin8.1软件进行分析绘图，应用MicrosoftExcel2019进行差异显著性检验。2结果与分析2.1雀嘴茶醇提液的成分分析采用UHPLC-Q-OrbitrapHRMS技术分析雀嘴茶醇提液成分，结果如表1所示。共检测出16 7 0 7 个代谢物，其中ESI模式下检测出8 18 4个，ESI模式下检测出8 52 3个。经ProgenesisQI处理后，共鉴定出132 1个代谢物，其中ESI模式下鉴定出7 0 5个，ESI模式下鉴定出6 16 个。人类代谢数据库（HMDB,https:/hmdb.ca）是目前最大、最全面的生物体特异性代谢数据库，因此我们将鉴定出的代谢物在HMDB中进行进一步检索，剔除出未识别的代谢物，共获得1085个代谢物。表1基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS技术的嘴茶醇提液成分分析Table 1Composition analysis of alcohol extract of Quezui teabased on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定出的化匹配到HMDB库的离子模式代谢物合物化合物ESI8523705571ESI8184616514总离子1670713211085注：“表示质谱分析模式，包括阳离子模式（ESI*）和阴离子模式（ESI）；表示通过软件匹配提取到的所有物质；表示结合一级质谱图和二级质谱图鉴定到的化合物；“表示最终匹配到HMDB库的化合物。根据HMDB分类可将这些代谢物分为11个超类，如图1所示，包括433个脂类和类脂分子、2 19个苯丙素类和芳香聚酮、12 9个有机氧化合物、12 0 个有机杂环类、7 7 个有机酸及其衍生物、6 2 个苯类、14个核苷酸及其衍生物、11个生物碱及其衍生物、9个有机氮化合物、8 个木脂素、新木脂素及相关化合物和3个烃及其衍生物。进一步根据HMDB的子类，发现雀嘴茶醇提液中富含类（17 1个）、黄酮类（136 个）、香豆素类（36 个）、肉桂酸类（19个）、二苯乙烯类（9个）、二芳基庚烷类（5个）、酚类（2 个）、酸类（2 个）、生物碱类（11个）等生物活性代谢物，也检测出四环素类（2 个）、大环内酯类（2 个）抗生素代谢物，以及呋喃类、吡咯类、喹啉类、哌啶类、吡喃类、吡啶类、咪唑类、吲哚类、萘并吡喃类、苯并呋喃类、苯并咪唑类等共12 0 个杂环类抗菌剂。为深人分析雀嘴茶醇提液中主要活性成分，对鉴定出的前50 个含量较高的代谢物进行分析，包括18 个脂类和类脂分子、17 个苯丙素类和芳香聚酮类、6 个有机氧化合物、3个有机杂环化合物、3个苯类、1个有机酸及其衍生物和1个核苷酸及其衍生物。其中，脂类和类脂分子、有机酸及其衍生物均是雀嘴茶来源植物自身生长和繁殖所必需的初级代谢产物，脂类和类脂分子主要包括11个磷脂类、3个脂肪酰类、2 个孕烯醇酮脂类和2 个糖脂类，有机酸及其衍生物主要包括1个羟基酸D-(+)-苹果酸。其余类别中，苯丙素类和芳香聚酮类代谢物是雀嘴茶来源植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的苯丙素类次生代180西南林业大学学报第44卷谢物，主要包括9个黄酮类、3个香豆素及其衍生物、2 个肉桂酸及其衍生物、2 个二芳基庚烷类和1个异黄酮类，大都具有广泛的生物活性，如含量很高的新甘草苷 16 具有抗炎活性；扁蓄苷 17 具有利尿作用；醋硝香豆素 18 是一种抗凝血剂；皮素-3-O-葡萄糖苷 19 具有抗氧化、抗增殖和抗炎特性；桂皮质B1能有效的抑制继发性肿胀、风寒湿痹症肿胀以及炎性组织中PGE2的生成 2 0 。有机杂环化合物中主要的代谢物咖啡因 2 1 是一种中枢神经系统刺激物质，核苷酸及其衍生物的主要代谢物阿糖腺苷 2 2 是一种抗病毒药，对单纯疱疹和水痘带状疱疹病毒有活性。400苯丙素类和芳香聚酮类350有机杂环类有机氧类300有机酸及其衍生物250脂类901x/苯类200核苷酸及衍生物15010050034568991011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950化合物图1雀嘴茶醇提液中前50 个高含量代谢物Fig.1The top 50 metabolites in the alcohol extracts of Quezui tea此外，根据Zhao等 2 3 报道，雀嘴茶中富含咖啡酰类化合物，其醇提液中也鉴定出一些含量较高的咖啡酰类化合物，包括1-咖啡酰-D-葡萄糖、3-0-阿魏酰奎尼酸、绿原酸、2-0-咖啡酰熊果苷，这类化合物具有较好的生物活性 2 4。另有研究表明3-0-阿魏酰奎尼酸具有抗氧化活性 2 5，且会在高光合作用有效辐射和紫外辐照下显著增强，为强辐射地区植物中寻找林源活性分子提供了很好的依据。因此，雀嘴茶醇提物中大量活性代谢物为其抗氧化性和酪氨酸酶抑制活性提供了科学依据，也为进一步从中挖掘高值有效活性分子提供了数据基础2.2雀嘴茶醇提液抗氧化活性分析雀嘴茶醇提液中富含有多酚和黄酮等具有酚羟基结构的化合物，为进一步对其抗氧化活性进行分析，本研究以醇提液中总多酚为基准，对其进行稀释并进行活性测定。研究表明，雀嘴茶醇提液中的总多酚含量为5.2 6 mg/mL，总黄酮含量为 2.8 2 mg/mL2.2.1雀嘴茶醇提液DPPH清除率分析雀嘴茶醇提液的DPPH清除能力如图2。在0.0050.13mg/mL的多酚质量浓度范围内，DPPH的清除率与雀嘴茶醇提液的浓度之间存在明显的量效关系。当雀嘴茶醇提液浓度为0.2 6 mg/mL时DPPH清除率为8 2.46%，达到了Vc水平的98%。多酚类物质的含量与DPPH的清除能力呈极显著的正相关关系 2 6 ，而雀嘴茶醇提液中富含黄酮类、香豆素等抗氧化活性较强 2 7-2 8 的多酚类物质，这些物质所含有的丰富的酚羟基具备强大的提供质子的能力 2 9，能够直接提供氢原子来清除DPPH，可能是这些物质在雀嘴茶醇提液对DPPH的清除过程中起了较大作用。为了更准确地衡量和评价雀嘴茶醇提液的体外抗氧化活性，本研究用IC5o值来表征抗氧化能力的强弱，IC5o值越低则表明提取物的抗氧化能力越强。通过计算得出，雀嘴茶醇提液与Vc的ICso值分别为0.0 57 mg/mL和0.0 2 1mg/mL，雀嘴181第1期王文博等：基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS雀嘴茶醇提液的成分及活性研究茶醇提液相较于人工合成的抗氧化剂Vc差异较小，两者的DPPH清除能力并无显著差异，雀嘴茶醇提液具备较好的DPPH清除能力。10090807060504030一雀嘴茶20Vc1000.10.20.30.40.50.6质量浓度/(mgmL-l)图2不同浓度雀嘴茶醇提液清除DPPH能力Fig.2Influence of the alcohol extracts concentration ofQuezui tea on DPPH scavenging activities2.2.2雀嘴茶醇提液ABTS+清除率分析雀嘴茶醇提液的ABTS+清除能力如图3所示。雀嘴茶醇提液的多酚质量浓度低于0.13mg/mL时，其ABTS+清除率快速升高，最终达到99%左右，表现出明显的正相关关系。通过计算，雀嘴茶醇提液与Vc对ABTS+的ICso值分别为0.0 2 3mg/mL和0.0 7 5mg/mL，差异不显著，这说明雀嘴茶具备与Vc接近的较好的ABTS+清除能力。10080%/本湖604020雀嘴茶+Vc000.10.20.30.40.50.6质量浓度/(mgmL-l)图3不同浓度雀嘴茶提取物清除ABTS+能力Fig.3Influence of the alcohol extracts concentration ofQuezui tea on ABTs+:scavenging activities根据李东辉等 30 的研究，多酚类物质的含量是影响ABTS+的关键因素，总多酚与ABTS+的清除能力显著正相关。酚羟基的数量以及位置是影响ABTS+清除能力的关键因素，雀嘴茶醇提液中多酚类化合物如熊果苷、绿原酸、2-O-咖啡酰熊果苷等含量丰富，能够提供的活性氢多，相对应的其ABTS+清除能力也就强，这与文献所报道一致 30 。此外，类物质对ABTS+的清除也有一定贡献 31O2.2.3雀嘴茶醇提液OH清除率分析由图4可知，雀嘴茶醇提液对OH保持着很高的清除率，在其质量浓度大于0.8 7 mg/mL时，清除率接近10 0%。雀嘴茶醇提液的总多酚在一定质量浓度范围内对OH的清除率存在明显的量效关系，且随着质量浓度的升高，OH清除率也随之升高。雀嘴茶醇提液对OH的ICso值为0.38 mg/mL，而Vc的ICso值为0.6 6 mg/mL，差异不显著。10080%率604020一雀嘴茶Vc000.51.01.52.02.53.03.5质量浓度/(mg:mL-)图47不同浓度雀嘴茶提取物清除OH能力Fig.4 Influence of the alcohol extracts concentration ofQuezui tea on-OH scavenging activities雀嘴茶中的多酚类和黄酮类物质均对OH清除能力有贡献 32 ，其中黄酮类化合物可以直接通过单电子转移方式来清除OH。根据2.1中的分析，雀嘴茶醇提液中富含多种黄酮类化合物，这可能是雀嘴茶醇提液OH清除能力较高的原因。结果表明雀嘴茶醇提液具有较好的OH清除能力，OH是造成人体氧化损伤的重要因子 33，作为一种药食同源的材料，这对于其后续利用具有很高价值。2.2.4雀嘴茶醇提液总还原能力测定分析由图5可得，雀嘴茶醇提液的总还原力与Vc的总还原力极为接近。雀嘴茶醇提液和Vc的总还原力之间没有显著差异，雀嘴茶具备较高的总还原力。由于普鲁士蓝法测定总还原能力并非是某些特定自由基的清除能力的体现，而是对样品总还原能力的一种表征，因此可以较好反映样品的抗氧化能力，这说明雀嘴茶醇提液具备很好的抗氧化能力以及还原力。雀嘴茶醇提液的总多酚质量浓度在0.0 0 5 0.2 6 mg/mL范围内，其吸光值迅速上升，最高值为0.99，这表明雀嘴茶醇提液的还原能力增强，普鲁士蓝生成量增加。在浓度大于0.2 6 mg/mL时，吸光值变化微乎其微，反应液中Fe3+可能已经被全部还原为Fe?+，继续提182西南林业大学学报第44卷高样品浓度已经无法进行反应，吸光度的上升可能来自于其本身的吸光值 34。因此在实验过程中应保持加入的Fe3+即 Fe(CN)-足量，且加人的样品浓度不宜过高。黄酮类化合物具有较高的抗氧化活性，在一定浓度范围内，还原力随浓度的升高而增加 35-36 ，雀嘴茶醇提液中黄酮类化合物含量丰富，这可能是雀嘴茶醇提液还原能力较好的原因。1.00.80.60.40.2雀嘴茶Vc一000.10.20.30.40.50.6质量浓度/(mg:mL-)图5雀嘴茶醇提物及Vc铁还原能力随浓度的变化Fig.5Reducing ability of the alcohol extracts of Quezuitea and Vc at different concentrations综上所述，雀嘴茶醇提液具有较好的自由基清除能力以及总还原能力，表明雀嘴茶有较好的抗氧化剂用途前景。根据已有的研究，一些化学成分如黄酮、绿原酸、咖啡酰类化合物等具有较好的抗氧化活性，具有较好的自由基清除能力 37 ，而雀嘴茶醇提液中富含这些物质，可能是雀嘴茶醇提液具有较好的抗氧化能力的原因2.2.5雀嘴茶醇提液的蘑菇酪氨酸酶抑制活性在酪氨酸酶抑制活性测定的反应体系中，反应底物浓度不变，加人不同总多酚浓度的雀嘴茶醇提液，测定各组反应在30 min内的吸光度变化，从而得到不同总多酚浓度的雀嘴茶醇提液对酪氨酸酶抑制活性的变化，见图6 与图7。据研究报道 38 多酚类物质可以有效抑制酪氨酸酶活性，且多酚浓度越高，抑制效果越好。由图6 可知，雀嘴茶醇提物对酪氨酸酶具有抑制作用，随着雀嘴茶醇提液总多酚浓度升高时，酪氨酸酶抑制活性随之升高，与Fan等 38 的研究相一致。当雀嘴茶醇提液的总多酚质量浓度为0.15mg/mL时，对单酚酶活性的抑制率为8 1.50%。图7 中，在0 0.45mg/mL范围内，雀嘴茶醇提液的二酚酶活性抑制率均高于曲酸，其中在雀嘴茶醇提液浓度为0.0 45mg/mL时二酚酶活性抑制率达到58.58%。这说明雀嘴茶醇提液的二酚酶抑制活性与阳性对照之间并无显著差异，抑制活性较好，是潜在的天然酪氨酸酶抑制剂来源。许多皮肤美白剂通过抑制酪氨酸酶活性和抗氧化性来发挥其美白功效，有研究表明，天然产物中的酚类化合物是较好的酪氨酸酶抑制剂 39 并且可能在酪氨酸酶活性抑制作用中起到了主要作用 40 ,可用于化妆品和药品用途，抑制黑色素的过量生成。从2.1中成分分析可知，雀嘴茶醇提液中富含多种酚酸类物质，这可能在很大程度上促成了雀嘴茶提取液较好的酪氨酸酶活性抑制作用1.00.8%0.60.40.2曲酸雀嘴茶000.020.040.060.080.100.120.140.16浓度/(mg:mL)图6不同浓度下雀嘴茶醇提液对单酚酶抑制活性Fig.6Monophenolase inhibitory activity of the alcoholextracts of Quezui tea at different concentrations0.60.50.40.30.20.1曲酸雀嘴茶000.010.020.030.040.05浓度/(mg:mL-1)图7不同浓度下雀嘴茶醇提液对二酚酶抑制活性Fig.7Diphenolase inhibitory activity of the alcoholextracts of Quezui tea at different concentrations3结论本研究通过超声辅助提取雀嘴茶醇提液并通过UHPLC-Q-OrbitrapHRMS技术对雀嘴茶醇提液进行成分分析，从中得到了132 1个化合物，183第1期王文博等：基于UHPLC-Q-OrbitrapHRMS雀嘴茶醇提液的成分及活性研究主要有新甘草苷、1-咖啡酰-D-葡萄糖、扁蓄苷和醋硝香豆素等活性物质。经过测定，雀嘴茶醇提液中的总多酚含量为5.2 6 mg/mL，总黄酮含量为2.8 2 mg/mL。天然产物的抗氧化性主要来源于其中的多酚类物质，因此探索了将雀嘴茶作为抗氧化剂的可能性，通过多种指标对雀嘴茶醇提液的抗氧化能力进行综合评价，结果显示出较好的抗氧化能力：雀嘴茶醇提液清除DPPH-的ICso值为0.0 57 mg/mL，清除ABTS+的ICso值为0.0 2 3mg/mL，清除OH的IC5o值为0.38 mg/mL，尤其是总还原力方面，雀嘴茶醇提液与Vc极为接近，并且发现雀嘴茶醇提液具有较好的酪氨酸酶活性抑制作用。由此可见，雀嘴茶醇提液可用于进一步分离抗氧化活性物质和酪氨酸酶活性抑制物质，具有发展为天然抗氧化剂和天然酪氨酸酶活性抑制物的潜质。本研究初步表明了雀嘴茶可作为天然抗氧化剂或美白产品进行开发利用并为雀嘴茶药食两用的研究进一步提供了数据支撑，但是其抗氧化作用的具体机理还需要进行进一步研究。参考文献1Yang B,Zhang R P,Ren G F,et al.Arbutin derivat-ives from the buds of Vaccinium dunalianum and theirMS/MS spectrometric fragmentations J.Phytochem-istry Letters,2022,50:1-5.2Wang Y P,Wang Y D,Liu Y P,et al.6-O-Caffeoylar-butin from Que Zui tea ameliorates acetaminophen-in-duced liver injury via enhancing antioxidant ability andregulating the PI3K signaling pathway J.Food andFunction,2022,13(9):5299-5316.3Li N,Zeng W L,Luo X L,et al.A new arbutin derivat-ive from the leaves of Vaccinium dunalianum wight J.Natural Product Research,2018,32(1):65-70.4Luo X L,Li N,Xu M,et al.HPLC simultaneous de-termination of arbutin,chlorogenic acid and 6-O-caf-feoylarbutin in different parts of Vaccinium dunalian-um Wight J.Natural Product Research,2015,29(20):1963-1965.5Fiocco D,Arciuli M,Arena M P,et al.Chemical com-position and the anti-melanogenic potential of differentessential oils J.Flavour and Fragrance Journal,2016,31(3):255-261.6刘衬，杨志刚.枸骨叶提取物对酪氨酸酶的抑制与抗氧化作用 .天然产物研究与开发，2 0 18,30(1):114-119.7Sun L P,Guo Y,Zhang Y X,et al.Antioxidant andanti-tyrosinase activities of phenolic extracts from rapebeepollenandiinhibitorymelanogenesisbycAMP/MITF/TYR pathway in B16 mouse melanomacells J.Frontiers in Pharmacology,2017,8:104.8Xu M,Lao Q C,Zhao P,et al.6-O-caffeoylarbutin in-hibits melanogenesis in zebrafish J.Natural ProductResearch,2014,28(12):932-934.9田星，徐子悟，叶慧洁，等.食用花卉中多酚化合物的种类及其抗氧化性研究进展 .食品工业，2 0 2 1,42(2):231-235.10蔡静，叶润，贾凯，等.茶多酚的提取及抑菌活性研究综述 .化学试剂,2 0 2 0,42(2):10 5-114.11李娜，但汉龙，刘云，等.雀嘴茶中咖啡酰熊果苷提取工艺的响应面法优化 .西北农林科技大学学报（自然科学版），2 0 16,44(6)：17 3-18 0.12Qi S L,Guan H D,Deng G,e