《RNA转录》PPT课件.ppt

第三章第三章 RNA转录转录(RNA transcription)1精选课件ppt6.1.基本概念基本概念6.2.原核生物原核生物RNA转录的起始转录的起始6.3.真核生物真核生物RNA转录的起始转录的起始6.4.转录的延伸转录的延伸6.5.转录的终止转录的终止6.6.原核生物转录产物的后加工原核生物转录产物的后加工 6.7.真核生物转录产物的后加工真核生物转录产物的后加工6.8.真核生物转录产物中内元的去除真核生物转录产物中内元的去除 6.9.不连续转录和反式拼接不连续转录和反式拼接2精选课件ppt第一节第一节 基本概念基本概念 3精选课件ppt 转录转录(transcription):是指以是指以DNA为模板，在依赖于为模板，在依赖于DNA的的 RNA聚和酶催化下，以聚和酶催化下，以4中中rNTP（ATP、CTP、GTP和和UTP）为原料，合成）为原料，合成RNA 的过程。的过程。在有些病毒中，在有些病毒中，RNA也可以指导合成也可以指导合成RNA。若若 干干 基基 本本 概概 念念t 是基因表达的第一步，也是最关键的一步。是基因表达的第一步，也是最关键的一步。t 以以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板中的一条单链作为转录模板 (杂交实验所证实杂交实验所证实)4精选课件ppt 有义链有义链 (sense strand)又称编码链又称编码链 coding strand:指不作模板的指不作模板的DNA单链单链 反义链反义链 (antisense strand)又称模板链又称模板链 template srand:指作为模板进行指作为模板进行RNA转录的链转录的链 (60年代以前的表示方法与此相反年代以前的表示方法与此相反)没有没有 AU GC 的规律的规律5精选课件pptt 在依赖在依赖DNA的的RNA聚合酶作用下进行转录聚合酶作用下进行转录t AU、CG 合成合成RNA分子分子t 转录合成转录合成RNA链的方向为链的方向为53，模板单链模板单链DNA的极性的极性 方向为方向为35，而非模板单链的极性方向与而非模板单链的极性方向与RNA链相链相 同，均为同，均为53。（书写）。（书写）t 基因转录方式为不对称转录基因转录方式为不对称转录(一条单链一条单链DNA 为模板为模板,RNA 聚合酶的结合聚合酶的结合)6精选课件pptt RNA 的转录包括的转录包括 promotion.elongation.terminaton 三过程三过程 t 从启动子从启动子(promoter)到终止子到终止子(terminator)称为转录单称为转录单 位位(transcription unit)(转录起始点转录起始点)t 原核生物的转录单位多为原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真真 核生物中的核生物中的 转录单位多为转录单位多为monocistron,No operon t 转录起点即转录原点记为转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值，下游，其上游记为负值，下游 记为正值记为正值 upstream start point downstream101107精选课件ppt8精选课件ppt第二节第二节 原核生物原核生物RNA转录的起始转录的起始(RNA Transcription promotion in prokaryots)9精选课件ppt两个相关概念两个相关概念:操纵元操纵元(operon):是原核生物基因是原核生物基因 表达调控的一个表达调控的一个 完整单元，其中完整单元，其中 包括结构基因、包括结构基因、调节基因、操作调节基因、操作 子和启动子子和启动子ipozyaNo lac mRNAAbsence of lactoseActiveipozya-Galactosidase Permease TransacetylasePresence of lactose Inactive10精选课件ppt11精选课件ppt 启动子启动子(promoter)：是指是指DNA分子上被分子上被RNA聚合酶识别聚合酶识别 并结合形成起始转录复合物的区域并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节，它还包括一些调节 蛋白因子的结合位点蛋白因子的结合位点 (频率、效率频率、效率)一、原核生物的一、原核生物的RNA polymerase (E.coli)1、全酶、全酶(Holo Enzyme)和核心酶和核心酶(Core Enzyme)Core Enzyme Holo Enzyme12精选课件ppt (1)全酶（全酶（Holo Enzyme）用于转录的起始用于转录的起始 依靠空间结构与依靠空间结构与DNA模板结合模板结合(与核心酶结合后与核心酶结合后 引起的构象变化引起的构象变化)专一性地与专一性地与DNA序列序列(启动子启动子)结合结合 结合常数：结合常数：1014mol 半衰期：数小时半衰期：数小时（107mol 1秒以下）秒以下）转录效率低，速度缓慢（转录效率低，速度缓慢（的结合的结合）13精选课件ppt （2）核心酶核心酶 （Core Enzyme）作用于转录的延伸过程（终止）作用于转录的延伸过程（终止）依靠静电引力与依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性模板结合（蛋白质中碱性 基团与基团与DNA的磷酸根之的磷酸根之 间）间）非专一性的结合（与非专一性的结合（与DNA的序列无关）的序列无关）结合常数：结合常数：1011mol 半衰期：半衰期：60秒秒14精选课件ppt 此外，新发现的一种此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。亚基的功能尚不清楚。2、各亚基的特点和功能、各亚基的特点和功能 （1）因子因子 因子可重复使用因子可重复使用 修饰修饰RNApol构型构型 使使Holo Enzyme 识别启动子的识别启动子的Sextama Box(35区区),并通过并通过与模板链结合与模板链结合2 2 2 2（3）全酶的组装过程）全酶的组装过程15精选课件ppt 不同的不同的因子识别不同的启动子因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种中有四种因子（因子（70、32、54、28）枯草杆菌中有枯草杆菌中有11种种因子因子 （因子的更替对转录起始的调控）因子的更替对转录起始的调控）（2）因子因子 核心酶的组建因子核心酶的组建因子 促使促使RNApol 与与DNA模板链结合模板链结合 2 2 前端前端因子使模板因子使模板DNA双链解链为单链双链解链为单链 尾端尾端因子使解链的单链因子使解链的单链DNA重新聚合为双链重新聚合为双链16精选课件ppt （3）因子因子 促进促进RNApolNTP RNA elongation 完成完成NMP之间的磷酸酯键的连接之间的磷酸酯键的连接 Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）功能（排斥与模板链不互补的碱基）与与Rho（）因子竞争）因子竞争RNA 3end17精选课件ppt E site（elongation site RifR）:对对NTP非专一性地结非专一性地结 合（催化作用和合（催化作用和Editing功能）功能）（4）因子因子 参与参与RNA非模板链（非模板链（sense strand）的结合）的结合 （充当（充当SSB）构成构成Holoenzyme 后，后，因子含有两个位点因子含有两个位点 I site（initiation site.Rifs）:该位点专一性地结合该位点专一性地结合 ATP或者或者GTP （需要高浓度的（需要高浓度的ATP或或GTP）18精选课件ppt由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点 有义有义DNA链结合位点（链结合位点（亚基提供）亚基提供）DNA/RNA杂交链结合位点（杂交链结合位点（亚基提供亚基提供）双链双链DNA解链位点（前端解链位点（前端 亚基提供亚基提供）单链单链DNA重旋位点（后端重旋位点（后端亚基提供亚基提供）因子作用位点因子作用位点19精选课件pptE.coli RNA polymerase用于起始和延伸用于起始和延伸只用于起始只用于起始36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD20精选课件ppt 二、启动子（二、启动子（promoter）的结构与功能）的结构与功能 （Prok.E.coli）1、启动子由两个部分组成、启动子由两个部分组成 （1）上游部分上游部分 CAP-cAMP结合位点结合位点 （基因表达调控的正控制位点）（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白）的受体蛋白 （2）下游部分下游部分 RNApol的进入（结合）位点的进入（结合）位点 35 10 包括识别位点和结合位点（包括识别位点和结合位点（R B位点）位点）21精选课件ppt 2、RNA聚合酶的进入位点聚合酶的进入位点 （1）Sextama 框（框（Sextama Box）-35序列，序列，RNA聚合酶的松弛（聚合酶的松弛（初始初始）结合位点，）结合位点，RNA聚合酶依靠其聚合酶依靠其亚基识别该位点亚基识别该位点 识别位点（识别位点（R位点）位点）大多数启动子中共有序列为大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性重要性:很大程度上决定了启动子的强度很大程度上决定了启动子的强度 （RNApol 的的因子）因子）位置在不同启动子中略有变动位置在不同启动子中略有变动22精选课件ppt（2）Pribonow 框（框（Pribonow Box）-10序列，序列，RNA聚合酶的牢固结合位点聚合酶的牢固结合位点 结合位点（结合位点（B 位点）位点）一致序列：一致序列：T80A95T45A60A50T96（TATPUAT）位置范围位置范围 4 到到13因此又称因此又称TATA Box保守保守T23精选课件ppt24精选课件ppt（3）起始位点（起始位点（initiation site）：）：1位点位点 RNA聚合酶的转录起始位点聚合酶的转录起始位点 起始起始NTP多为多为ATP或或GTP 25精选课件ppt起始起始过程过程 ：a.全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 （R位点被位点被因子发现并结合因子发现并结合）26精选课件ppt b、开放型启动子复合物的形成开放型启动子复合物的形成 RNApol的一个适合位点到达的一个适合位点到达10序列区域，诱导富序列区域，诱导富 含含AT的的Pribnow 框的框的“熔解熔解”，形成形成1217bp的泡状的泡状 物，同时酶分子向物，同时酶分子向10序列转移并与之牢固结合序列转移并与之牢固结合 开放型启动子复合物使开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向聚合酶定向 两种复合物均为二元复合物（全酶和两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA）27精选课件ppt c.在开放型的启动子复合物中，在开放型的启动子复合物中，RNApol的的I位点和位点和E位点的位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（亚基）亚基）三元复合物形成三元复合物形成 +1位多为位多为CAT模式模式,位于离开保守位于离开保守T 69 个核苷酸处个核苷酸处 -6-9 bp-GC T ATTGACATATAAT-16-18 bp-+1-35 sequence-10 sequence（4）因子解离因子解离 核心酶与核心酶与DNA的亲和力下降的亲和力下降 起始过程结束起始过程结束核心酶移动进入延伸过程核心酶移动进入延伸过程29精选课件ppt转录的起始过程转录的起始过程核心酶核心酶1217bp30精选课件ppt（亚基）亚基）31精选课件ppt 3、CAP-cAMP 结合位点结合位点（也称（也称CAP位点）位点）转录调控中，转录调控中，I 阻遏蛋白阻遏蛋白 负调控负调控 lac 操纵子模型操纵子模型32精选课件pptI33精选课件ppt 许多基因的表达还存在正调控机制许多基因的表达还存在正调控机制 例如例如:E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时培养基中乳糖和葡萄糖共存时 只有葡萄糖被只有葡萄糖被 利用利用 原因：原因：CAP位点的正调控位点的正调控 葡萄糖缺少时葡萄糖缺少时，腺苷酸环化酶将，腺苷酸环化酶将ATP cAMP，cAMP与与CAP位点结合位点结合,此时启动子的进入位点才能此时启动子的进入位点才能 与与RNApol结合结合 葡萄糖存在时，葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有不能形成，没有CAPcAMP 与与CAP位点结合，启动子的位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结进入位点不能结 合合RNApol 34精选课件ppt 因此因此,一个操纵元中有两道控制开关一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开只有同时打开,结构基因才结构基因才 能进行转录。能进行转录。（对（对 lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（1）CAP位点的组成位点的组成（70 40）位点位点：70 70 5050 包括一个包括一个IR 序列序列 强结合位点强结合位点 位点位点：50 50 40 弱结合位点弱结合位点 位点位点对位点对位点具有协同效应（具有协同效应（cooperativity）35精选课件ppt36精选课件ppt（2）位点位点结合结合CAPcAMP复合物后，促使复合物后，促使RNApol进入进入 Sextama Box,最终与最终与10序列结合起始转录序列结合起始转录 原因：原因：CAPcAMP复合物与位点复合物与位点结合结合 Sextama Box 富含富含GC区域（区域（GC岛区）稳定性降低岛区）稳定性降低 Pribnow Box 的溶解温度降低的溶解温度降低 促进开放型启促进开放型启 动子复合物的形成动子复合物的形成 促进转录促进转录37精选课件ppt38精选课件ppt上节课内容回顾上节课内容回顾:1、原核生物、原核生物RNApol：2、原核启动子的结构：、原核启动子的结构：RNApol进入位点进入位点 起始过程起始过程 上游位点的组成和功能上游位点的组成和功能39精选课件ppt 4、RNApol 在在DNA上结合位点的鉴定上结合位点的鉴定 DNase 法法-40bp 而足迹法（而足迹法（footprinting）结果相对准确结果相对准确 足迹法原理：足迹法原理：限制酶切割结合有限制酶切割结合有RNApol的的DNA 大分子大分子DNA 末端标记该末端标记该DNA（Klenow片段标记片段标记3,碱性磷酸酯碱性磷酸酯 酶标记酶标记5）用内切酶降解用内切酶降解DNA（控制反应条件）（控制反应条件）凝胶电泳分离，放射自显影观察凝胶电泳分离，放射自显影观察40精选课件ppt限制酶切限制酶切分离分离大片段大片段DNA41精选课件ppt末端标记大分子末端标记大分子DNA重新结合重新结合RNApol 作对照作对照直接用直接用DNase 进行降解进行降解电泳电泳用微量用微量DNase降解降解电泳电泳42精选课件ppt43精选课件ppt 用足迹法鉴定出来的用足迹法鉴定出来的 RNApol 与与DNA的结合区域为的结合区域为 +20 50（40），大约），大约 60 70 bp 实验中还发现实验中还发现.5、启动子各位点与转录效率的关系启动子各位点与转录效率的关系 （1）35 序列与序列与10 序列与转录效率的关系序列与转录效率的关系 标准启动子标准启动子 35 TTGACA 10 TATAAT44精选课件ppt 则不同的启动子则不同的启动子 a.与标准启动子序列同源性越高与标准启动子序列同源性越高 启动强度越大启动强度越大 b.与标准启动子同源性越低与标准启动子同源性越低 启动强度越小启动强度越小 c.与标准启动子差异很大时与标准启动子差异很大时 由另一种由另一种因子启动因子启动原因原因:35序列通过被序列通过被 因子识别的容易因子识别的容易 决定启动子强度决定启动子强度 10序列影响开放型启动子复合物形成的速度序列影响开放型启动子复合物形成的速度 决定启动子强度决定启动子强度 45精选课件ppt （2）35序列与序列与10序列的间隔区与转录效率的关系序列的间隔区与转录效率的关系 碱基序列并不重要碱基序列并不重要 间距非常重要间距非常重要，17bp的间距转录效率最高的间距转录效率最高 间距上的突变种类：间距上的突变种类：间距趋向于间距趋向于17bp 上升突变上升突变 间距远离间距远离17bp 下降突变下降突变 启动子上升突变、启动子下降突变启动子上升突变、启动子下降突变46精选课件pptE.Coli各识别的启动子的序列识别的启动子的序列47精选课件ppt第三节第三节 真核生物真核生物RNA转录的启动转录的启动RNA Transcription promotion in Eukaryots48精选课件ppt 一、真核生物的一、真核生物的RNApol 1、三种三种RNApol：根据对根据对 -鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感最不敏感 （动、植、昆）（动、植、昆）RNApol 最敏感最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同不同种类的敏感性不同 2、位置和转录产物位置和转录产物 RNApol 核仁核仁 活性所占比例最大活性所占比例最大 转录转录rRNA（5.8S、18S、28S）49精选课件ppt RNApol 核质核质 主要负责主要负责 hnRNA、snRNA 的转录的转录 hnRNA（mRNA 前体，核不均一前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA）snRNA（核内小分子（核内小分子 RNA small nulear RNA)RNApol 核质核质 负责负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和序列和 部分部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低）（活性较低）50精选课件ppt3、亚基组成：、亚基组成：分子量分子量500KDa,含两个大亚基和含两个大亚基和 712 个小亚基个小亚基 RNApol：大亚基中有大亚基中有 C 末端结构域末端结构域 (carboxy terminal domain CTD)CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复中含一保守氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端重复七肽端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）不同生物中重复数目不一样（酶活性）51精选课件ppt CTD中的中的 Ser和和 Thr可被高度磷酸化可被高度磷酸化 磷酸化的磷酸化的 RNApol 被称为被称为A 非磷酸化的非磷酸化的 RNApol 称为称为B CTD参与转录参与转录 B A 使使 RNApol易于离开易于离开 启动子进入延伸过程（启动子进入延伸过程（10倍）倍）二、二、真核生物的启动子真核生物的启动子 三种三种 RNApol 三种转录方式三种转录方式 三种启动子三种启动子 三类基因，三类基因，类类 类类 类类52精选课件ppt 1、RNApol的启动子的启动子 结构最复杂结构最复杂 位于转录起始点的上游位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成有多个短序列元件组成 通用型启动子（无组织特异性）通用型启动子（无组织特异性）（1）帽子位点（帽子位点（cap site）：转录起始位点）：转录起始位点 与与Prok.的的“CAT模式模式”相似相似（2）TATA框（框（Hogness 框或框或 Goldberg-Hogness 框）框）位于位于30处处 一致序列为一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）53精选课件ppt 定位转录起始点的功能定位转录起始点的功能 （类似原核的（类似原核的Pribnow框）框）TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（3）CAAT框（框（CAAT box）位于位于75bp处处 一致序列为一致序列为GGC/TCAATCT 前两个前两个 G 的作用十分重要的作用十分重要(转录效率转录效率)增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性 （距转录起始点的距离，正反方向）（距转录起始点的距离，正反方向）以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在54精选课件ppt （4）增强子（增强子（enhancer）（又称远上游序列（又称远上游序列 far upstream sequence）在在100以上以上 SV40的两个正向重复研究得最清楚（的两个正向重复研究得最清楚（DR）-107178 、179 250 各各 72bp 该增强子的特点如下：该增强子的特点如下：对依赖于对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖框的转录的增强效应高于不依赖 的情况的情况55精选课件ppt 距离效应距离效应:离离72bp越近的容易起始转录越近的容易起始转录 转录方向离开转录方向离开72bp的起始序列优先转录的起始序列优先转录 细胞类型的选择：不同类型中作用有差异细胞类型的选择：不同类型中作用有差异 表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（5）GC框框（GC box）位于位于90附近，较常见的成分附近，较常见的成分 核心序列为核心序列为GGGCGG 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列可有多个拷贝，也可以正反两方向排列56精选课件ppt（6）其他元件）其他元件 八聚核苷酸元件八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件元件）一致序列为一致序列为 ATTTGCAT KB元件元件 一致序列为一致序列为 GGGACTTTCC ATF元件元件 一致序列为一致序列为 GTGACGT 还有一些位于起始点下游的相关元件还有一些位于起始点下游的相关元件（7）不同元件的组合情况不同元件的组合情况 不同元件的不同元件的数目、位置、和排列方向数目、位置、和排列方向均有差异均有差异 例如：例如：SV40的早期启动子中有的早期启动子中有6个个GC框框57精选课件ppt小结小结：不同启动子中不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同每种元件与转录起始点的距离不同 不同启动子中的相应元件互相交换不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交形成的杂交 启动子功能没有变化启动子功能没有变化 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定蛋白因子间的相互作用决定 了转录的起始了转录的起始58精选课件ppt 2、RNApol 启动子结构启动子结构 （1）分为三类，每种识别方式不同分为三类，每种识别方式不同 a、下游启动子（内部启动子）下游启动子（内部启动子）位于转录起始点的下游位于转录起始点的下游 5SRNA 和和 tRNA基因基因 可分为两类可分为两类 b、上游启动子上游启动子 snRNA59精选课件ppt（2）内部启动子的发现）内部启动子的发现 最早发现于非洲爪蟾的最早发现于非洲爪蟾的5S rRNA基因基因 试验设置：试验设置：非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，进行缺失试验进行缺失试验 以不同长度的以不同长度的5S rRNA基因为模板进行转录基因为模板进行转录 结果：结果：缺失缺失55以前和缺失以前和缺失80以后的序列都能正常转录以后的序列都能正常转录 缺失缺失55到到80序列不能转录序列不能转录60精选课件ppt 结论：结论：5S rRNA基因的启动子位于基因内部基因的启动子位于基因内部 该启动子可使该启动子可使RNApol在其上游的在其上游的55bp处起始转录处起始转录（3）内部启动子分为两类内部启动子分为两类 均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开 第一类：第一类：含含A框和框和C框框 （5S rRNA基因）基因）第二类：第二类：含含A框和框和B框框 （tRNA基因、基因、VARNA基因）基因）间隔序列长短差异很大间隔序列长短差异很大 其中内部启动子起被其中内部启动子起被 RNApol 识别的作用识别的作用61精选课件ppt62精选课件ppt63精选课件ppt上节课内容回顾上节课内容回顾:1、RNApol在在DNA上结合位点的鉴定上结合位点的鉴定2、启动子的各部位与转录效率的关系、启动子的各部位与转录效率的关系3、真核生物、真核生物RNApol：种类及各自转录的基因种类及各自转录的基因 亚基组成亚基组成4、RNApol的启动子的启动子5、RNApol的启动子的启动子64精选课件ppt 三、三、真核生物转录的起始真核生物转录的起始 三种三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力均没有对启动子特异序列的识别能力 转录起始过程需要很多的辅助因子转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子转录因子)参与参与,并且按一定顺序与并且按一定顺序与DNA形成复合物形成复合物,协助协助RNApol定定 位于转录起始点位于转录起始点65精选课件pptRNApol TBP因子因子66精选课件pptRNApol 67精选课件ppt68精选课件ppt RNApol 的转录起始的转录起始 两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子 TFA 一种含锌指结构的蛋白一种含锌指结构的蛋白 TFB 由由TBP和和BRT、B”TFC 至少至少5个亚基以上个亚基以上69精选课件ppt70精选课件ppt TBP 的作用的作用 所有所有 RNApol 的转录起始都需要的转录起始都需要TBP 在在 RNApol的转录起始过程中的转录起始过程中,TBP是是SL1的的 组份，起定位组份，起定位RNApol的作用的作用 RNApol的转录起始由的转录起始由TBP识别识别TATA框框 TBP 起定位作用起定位作用,所以又称定位因子所以又称定位因子 （positioning factor）71精选课件ppt72精选课件ppt第四节第四节 转录延伸转录延伸 Transcription Elongation73精选课件ppt 一、一、起始到延伸的转变起始到延伸的转变 始于第一个磷酸二酯键的形成始于第一个磷酸二酯键的形成 伴随着伴随着DNA分子和酶分子构象的变化分子和酶分子构象的变化 1、Prok.起始时，起始时，因子有利于因子有利于 和和 亚基具有与亚基具有与DNA专一专一 性结合所要求的构象性结合所要求的构象 起始后起始后,因子解离因子解离,和和 亚基构象发生变化亚基构象发生变化 2、Euk.多种辅助因子的共同作用来保证这一转变多种辅助因子的共同作用来保证这一转变74精选课件ppt 二、二、延伸过程（延伸过程（Prok）酶与产物酶与产物RNARNA不解离不解离 底物底物NTPNTP不断加到不断加到RNARNA链的链的 3-OH 3-OH 端端 形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动 延伸位点不断地接受新的延伸位点不断地接受新的NTPNTP，RNARNA链不断延伸链不断延伸 始终保持三元复合物的结构始终保持三元复合物的结构75精选课件ppt76精选课件ppt 1、转录泡转录泡 RNApol 结合和转录的结合和转录的DNA模板区域，有模板区域，有17bp左右左右 DNA形成解链区形成解链区 转录泡处杂交双链很短转录泡处杂交双链很短 胰脏胰脏 RNAase_其长度其长度10bp（不准确）（不准确）推测也就两个核苷酸左右推测也就两个核苷酸左右77精选课件ppt 2、拓扑学问题拓扑学问题 RNA合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变 RNApol 的前沿的前沿.解螺旋作用解螺旋作用 RNApol 后端后端.DNA的螺旋化的螺旋化 （保持（保持）超缠问题的解决靠超缠问题的解决靠DNA旋转酶旋转酶 RNA-DNA杂交链也要求作旋转运动杂交链也要求作旋转运动78精选课件ppt旋转酶旋转酶79精选课件ppt 3、转录过程中的延宕转录过程中的延宕 （1）RNA的合成速度大约的合成速度大约 30 50 个核苷酸秒个核苷酸秒,与蛋白与蛋白 质的合成速度相近（质的合成速度相近（15个个AAsec）（2）模板模板DNA中中GC 的存在的存在 延宕延宕 （GC后的后的 810 个核苷酸）个核苷酸）延宕作用在延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用链的终止和释放中起重要作用思考思考:延宕发生的原因延宕发生的原因?80精选课件ppt 第五节第五节 转录的终止转录的终止 Transcription termination 81精选课件ppt 终止过程：终止过程：酶停止添加底物酶停止添加底物释放释放RNA链链酶解离酶解离 终止反应终止反应杂合双链的氢键断裂，杂合双链的氢键断裂，重新形成双螺旋，酶的解离。重新形成双螺旋，酶的解离。终止子（终止子（terminator）：在转录的过程中，提供转录终止）：在转录的过程中，提供转录终止 信号的信号的RNA序列序列 真正起终止作用的是真正起终止作用的是RNA序列与启动子不同序列与启动子不同 Prok.和和Euk.都具有一种基因表达调控的手段都具有一种基因表达调控的手段82精选课件ppt 一、原核生物的终止子一、原核生物的终止子 1、终止子的种类终止子的种类 （1）内在终止子（不依赖内在终止子（不依赖 因子的终止子）因子的终止子）体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止 （2）依赖依赖因子的终止子因子的终止子 蛋白质辅助因子蛋白质辅助因子因子因子存在时，核心酶终止转录存在时，核心酶终止转录 两者有共同的结构特征（序列差异）两者有共同的结构特征（序列差异）83精选课件ppt2、不依赖、不依赖 因子的终止子因子的终止子 结构特征结构特征:一是形成一个发夹结构一是形成一个发夹结构 茎茎.720 bp的的IR序列形成（富含序列形成（富含G/C）环环.中间不重复序列形成中间不重复序列形成 发夹结构的突变可阻止转录的终止发夹结构的突变可阻止转录的终止 二是二是6 8 个连续的个连续的U串（发夹结构末端）串（发夹结构末端）84精选课件ppt不依赖不依赖终止子结构终止子结构IRIR茎部富含茎部富含GC85精选课件ppt3、依赖、依赖 因子的终止子因子的终止子 （1）结构结构 IR序列中的序列中的 GC 对含量较少对含量较少 发夹结构末端没有固定特征发夹结构末端没有固定特征 （2）靠与靠与的共同作用而实现终止的共同作用而实现终止 86精选课件ppt无连续无连续 U串串G/C含含量量较较少少87精选课件ppt 二、二、原核生物转录的终止原核生物转录的终止 1、不依赖、不依赖因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录 （1）新生新生RNA链发夹结构形成链发夹结构形成 与与RNApol发生作用发生作用 造成高度延宕（典型的有造成高度延宕（典型的有60秒左右）秒左右）（2）RNApol暂停为终止提供了机会暂停为终止提供了机会，6 8个连续的个连续的U 串可能为串可能为RNApol与模板的解离提供了信号与模板的解离提供了信号 RNADNA之间的之间的 rUdA 结合力较弱结合力较弱 阻止阻止RNA链的释放链的释放88精选课件ppt 于是：于是：RNADNA解离解离 三元复合体解体三元复合体解体 RNApol解离解离 转录终止转录终止（3）真正的终止点不固定，在真正的终止点不固定，在 U串中的任何一处串中的任何一处（4）IR序列和序列和U串同等重要串同等重要 IR中的中的GC对含量的减少对含量的减少 U串的缩短或缺失串的缩短或缺失（5）DNA上与上与U串对应的为富含串对应的为富含AT的区域的区域 说明：说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用89精选课件ppt 2、依赖、依赖 因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录 （1）通读（通读（read through）：）：在依赖在依赖 因子的转录终止因子的转录终止 过程中，过程中，RNApol 转录了转录了 IR 序列之后，虽发生序列之后，虽发生 一定时间的延宕，但如果没有一定时间的延宕，但如果没有 因子存在，则因子存在，则 RNApol 会继续转录会继续转录 （2）因子因子 a、活性形式为六聚体活性形式为六聚体 促进转录终止的活性，促进转录终止的活性，NTPase 活性活性90精选课件ppt b、RNA长度大于长度大于50nt时，依赖时，依赖RNA的的NTPase活性最大活性最大 说明：说明：因子识别和结合的是因子识别和结合的是RNA（3）因子对终止子的作用因子对终止子的作用 a、因子与因子与RNA结合（终止子上游的某一处，结合（终止子上游的某一处，RNA的的5端端）b、因子沿因子沿RNARNA从从5353移动（移动（NTPNTP水解供水解供能能）（终止子处的较长时间的延宕给（终止子处的较长时间的延宕给因子追赶的机会因子追赶的机会）c c、因子与因子与 RNApol RNApol 相互作用而造成转录的终止相互作用而造成转录的终止91精选课件ppt结合上来追赶结合上来追赶RNApol追赶上来追赶上来（暂停）（暂停）与与RNApol相相互作用使杂交链互作用使杂交链解链解链终止子终止子92精选课件ppt（4）终止反应还需要终止反应还需要 RNA 与与 DNA 的相互作用的相互作用 即即：需要一定的需要一定的RNA序列序列 因为：因为：其其与模板的结合力必须弱到一定数值与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合，才能配合 因子因子与与 RNApol RNApol 的作用的作用 （发夹结构下游的（发夹结构下游的AUAU序列）序列）序列不同的终止子序列不同的终止子不同的终止程度不同的终止程度基因表达基因表达 调控的途径之一调控的途径之一93精选课件ppt（5 5）Prok.依赖依赖因子的终止子为基因表达调控因子的终止子为基因表达调控 提供了一种方式提供了一种方式 因为：因为：Prok.中转录与翻译偶联中转录与翻译偶联？为什么同一个转录元里近基因的一个无义为什么同一个转录元里近基因的一个无义 突变能阻止远基因的表达这一极性现象突变能阻止远基因的表达这一极性现象94精选课件pptRNApol核糖体核糖体因子因子无义突变无义突变位点位点95精选课件ppt三、终止与抗终止及抗终止因子三、终止与抗终止及抗终止因子 各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段 的基因表达的基因表达 *枯草杆菌枯草杆菌-更替更替因子因子 *T7噬菌体噬菌体-更换更换RNApol *噬菌体采用噬菌体采用依赖于依赖于因子的终止以及通过抗因子的终止以及通过抗 终止因子的抗终止作用终止因子的抗终止作用96精选课件pptPhage的的操操纵纵元元组组织织情情况况PMPLPRPR重重组组复制复制裂裂解解溶原周期溶原周期溶菌周期溶菌周期97精选课件pptPNPQ抗终止作用的过程抗终止作用的过程早期早期迟早期迟早期晚期晚期98精选课件ppt 抗终止的机制抗终止的机制依赖于噬菌体本身的依赖依赖于噬菌体本身的依赖因子的终止子因子的终止子依赖依赖因子的终止子上游有抗终止信号因子的终止子上游有抗终止信号(靠近靠近PL 的的nutL，靠近，靠近tR1的的nutR nutPN utilization)抗终止蛋白和抗终止蛋白和nut位点的结合，等待位点的结合，等待RNApol经过经过 时修饰时修饰RNApol的构象，拮抗寄主编码的终止蛋白的构象，拮抗寄主编码的终止蛋白的活性的活性,使之通过那些依赖使之通过那些依赖的终止子的终止子99精选课件ppt100精选课件ppt上节课内容回顾上节课内容回顾:1、转录的延伸、转录的延伸2、转录的终止、转录的终止 不依赖不依赖因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录 依赖依赖因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录3、抗终止