《SNP检测方法讲课》PPT课件.ppt

SNPs的检测方法 唐敏2005.8.121精选课件ppt主要内容nSNPs的定义nSNPs的研究意义nSNPs的研究进展和方向nSNPs的检测方法2精选课件pptSNPs的定义定义：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列序列多态性多态性。(99.9%)3精选课件pptSNPs的研究意义1.SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。_路标的作用传统研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遗传学（表型、基因、蛋白），4精选课件ppt2.基因多态性研究 研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别）5精选课件pptSNPs研究进展和方向1.SNPs数据库的构建发现2.SNPs功能的研究（在1的基础上）6精选课件pptSNPs检测方法1.理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs(1)灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧）(2)快速、简便、高通量 (操作和分析的自动化程度高）(3)费用相对低廉7精选课件ppt2.现状：到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。8精选课件ppt3.每种SNPs的检测方法都可将之看成由 区分SNPs特异位点的原理方法 和 数据的检测分析手段 两部分组成。9精选课件pptSNPs检测方法的分类一、区分一、区分SNPs 位点的位点的方法方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法二、检测分析技术二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3.DNA 芯片 4.质谱检测技术 10精选课件ppt1.基于杂交的方法基于杂交的方法n原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（差异越大，检测的特异性就越好）11精选课件ppt1）利用Tmn固定温度 等位基因特异核苷酸探针(Allele-specific oligonucleotide，ASO)。修饰过的探针：引入一个错配的碱基、PNA、LNAs 等n 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交(dynamic allele-specific hybridization,DASH)12精选课件ppt核酸肽探针（Peptide nucleic acids，PNA)n其骨架是肽键n特点：1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）2、链挤入（形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）13精选课件ppt1、与靶分子高特异性地结合nTm值高n受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）nTm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。14精选课件ppt LNA(locked nucleic acids)n其结构是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。n特点：1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交的稳定）2.匹配和不匹配的Tm增加15精选课件pptDASH(dynamic allele-specific hybridization）16精选课件ppt2）杂交+荧光共振分子信标（双分子间杂交）蝎状探针（分子内杂交）17精选课件ppt分子信标（Molecular beacons）18精选课件ppt蝎状探针（Scorpion primer）19精选课件ppt2.基于酶的方法基于酶的方法1）DNA聚合酶2）连接酶3）限制性内切酶4）外切酶FEN5）RNase H20精选课件ppt1）DNA聚合酶n等位基因特异性PCRn多重等位基因特异性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸测序法21精选课件ppt等位基因特异性PCR22精选课件pptTaqman 法23精选课件ppt微测序法/引物延伸法24精选课件ppt基本步骤（液相）1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）25精选课件pptAPEX (arrayed primer extension)固相26精选课件ppt焦磷酸测序法(Pyrosequencing)nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)。n原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。27精选课件ppt基本步骤1.1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。2.2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。4.4.ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。5.然后加入下一种dNTP。28精选课件ppt29精选课件ppt2)连接酶n联合链式反应(combined chain reaction,CCR)n连接-滚环扩增反应(ligation-rolling circle amplication,LRCA)30精选课件ppt