2009级医学检验本科生第六章--体外放射分析2011-10-18.ppt

放射性放射性核素标记物核素标记物被测物被测物特异结合试剂特异结合试剂：抗体抗体特异结合球蛋白特异结合球蛋白受体蛋白受体蛋白酶、微生物酶、微生物 竞争性竞争性结合结合被测物被测物标记的特异标记的特异结合试剂结合试剂（抗体）（抗体）非竞争性非竞争性结合结合 RIA(R Radioadioi immunommunoa assay)ssay)要求：要求：掌握原理掌握原理 把握特点把握特点 熟悉设计思想熟悉设计思想 了解计算方法了解计算方法第四章 体外放射分析第一节 放射免疫分析131131I-I-胰岛素胰岛素抗胰岛素抗体抗胰岛素抗体内源性胰岛素内源性胰岛素高高低低负相关负相关兔和人血中的胰岛素量兔和人血中的胰岛素量诺贝尔生物医学奖BersonYalou一、放射免疫分析原理一、放射免疫分析原理放射性核素标记的抗原放射性核素标记的抗原 限量的抗体限量的抗体被测抗原（或其标准品）被测抗原（或其标准品）放射性放射性复合物复合物的放射性的放射性 逆相关逆相关被测抗原被测抗原的含量的含量1 1竞争结合的反应机制竞争结合的反应机制 Ag Ab +Ag-Ab 非标记复合物非标记复合物+*Ag 一定量一定量 不定量不定量 限量限量*Ag-Ab 标记复合物标记复合物 4 8 4 0082 2 2413B?2 2*AgAg一一AbAb的放射性的放射性 与与AgAg间的逆相关有数学基础间的逆相关有数学基础PoPo标记物加待测物的初始浓度标记物加待测物的初始浓度QoQo：特异性结合试剂的初始浓度特异性结合试剂的初始浓度 B B：标记复合物占总放射性的百分数标记复合物占总放射性的百分数 F F：游离标记物占总放射性的百分数游离标记物占总放射性的百分数R=B/F R=B/F B+F=1 B+F=1 Ag-Ag-AbAb=PQ,Ag=P=PQ,Ag=PB+F=1 B B 1-F PQR=F 1-B F P R 1B=,F=1+R 1+R PoRPQ=PoB=Po(1-F)1+RPQ=R(Po-PQ)=RPo-RPQPQ+RPQ=RPoPQ(1+R)=RPoPoRPQ=-=PoB1+R B Ag-Ab Ag-Ab PQR=F Ag Po-Ag-Ab Po-PQP+Q PQ PQ PQK=(4-1)P Q P(Qo-PQ)B B与与PoPo的函数关系的函数关系 F与与Po的函数关系的函数关系 R与与Po的函数关系的函数关系Bx?80075025.4 46.73剂量反应曲线是定量依据剂量反应曲线是定量依据二、剂量反应曲线二、剂量反应曲线1.1.标准曲线斜率对定量测定的影响标准曲线斜率对定量测定的影响甲乙2.2.影响剂量反应曲线斜率的常见因素影响剂量反应曲线斜率的常见因素(1)(1)反应试剂反应试剂1)1)抗体的亲和力抗体的亲和力2)抗原的用量抗原的用量P+Q PQ109L/mol PQK=-P Q3)标准抗原的免疫活性标准抗原的免疫活性)标记抗原的放射性比活度与放射化学纯度标记抗原的放射性比活度与放射化学纯度3.7GBq/mg(0.1Ci/mg)370GBq/mmol(10Ci/mmol)95%,NSB5)抗体的用量抗体的用量5)抗体的用量抗体的用量B=33%50%P非标记非标记趋于零趋于零Po 约等于约等于P标记标记P标记标记4/KP 标记标记趋于零趋于零B=0.33(33%)P标记标记=4/KB=0.5(50%)(2)反应方式反应方式(3)反应条件反应条件放射免疫分析的特点1.1.灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 检出极限为检出极限为检出极限为检出极限为1010-9-91010-12-12 g/ml,g/ml,甚至可达甚至可达甚至可达甚至可达1010-15-15/ml/ml 2.2.特异性强特异性强特异性强特异性强 能识别立体异构体（能识别立体异构体（能识别立体异构体（能识别立体异构体（T T3 3,T,T4 4,反反反反T T3 3）3.3.应用范围广：应用范围广：应用范围广：应用范围广：国外（国外（国外（国外（300300）,国内（国内（国内（国内（100%，应剔除，应剔除 例：某样品双复管放射性为例：某样品双复管放射性为2138cpm 2138cpm 和和1898cpm1898cpm，视为复管误差过大，视为复管误差过大，是是 否否 应应 剔剔 除除？经经 V V 计计 算算 ：剔剔 除除 “坏坏 点点 ”2138-18982138-1898SD =-=169.7SD =-=169.7 SD 169.7 SD 169.7CV%=-CV%=-100%=-100%=-(2138+1898)(2138+1898)2 2 =8.4%12%=8.4%12%（1）精精 密密 度度 评评 价价 方方 法法）计算）计算 和和D D、SDSDD D、CVCVD DR R、SDSDR R、CVCVR RRD）反 应 误 差 关 系截距主要反映截距主要反映的的 波波 动动；直直 线线 斜斜 率率 则则 反反 映映 反反 应应 的的 变变 异异（SDR）增增 大大 说说 明明 反应反应 的的 增增 大。大。若若 的的 增增 大大 超过超过 通通 常常 情情况况 的的 一一 倍倍 以以 上上，说说明明 整整 批批 实实 验验 的的 随随 机机误误 差差 已已 经经 很很 大。大。提示提示NSB大小大小反映变异程度反映变异程度）反反 应应 误误 差差 关关 系系 规规 定定：一一 项项 反反 应应 复复 管管平平 行行 性性 优优 秀秀 时时，0.04，平平 行行 性性 良良 好好 时时，0.04,3(SDD、CVD%)以前以前（2）偏）偏 差差 与与 准准 确确 度度 评评 价价 方方 法法）回回 收收 实实 验验回回 收收 率率 应应 在在 即即 偏偏 差差 允允 许许 在在 土土 之之 内内 2）健）健 全全 性性 试试 验验 标标 准准 品品 与与 待测待测 物物 的的 免免 疫疫 学学 性性 质质 存在明显差异。存在明显差异。反反 应应 系系 统统 内存内存 在在 不不 可可 忽忽 视视 的的 干干 扰扰 反反 应应。剂剂 量量 反反 应应 曲曲 线线 各各 反反 应应 管管 与待与待 测测 样样 品品 管管 的的介介 质质 环环 境境 有有 较大较大 差差 别别。）两）两 样样 本本 图图 在在 待待 测测 样样 品品 的的 首首 部部、尾尾 部部 各各 放置放置 两两 组组 样样 品品 的的 二二 样样 本本 作作 图图 法法，称称 为为 二二 样样 本本 图图。系统误差和随系统误差和随 机误差都很小机误差都很小系统误差明显系统误差明显随机误差很小随机误差很小两种误差两种误差 都很明显都很明显）s 图图 相相 邻邻 点点 间间 联联 结结 的的 斜斜 线出线出 现现 连连 续续 上上 升升 或或 下下 降降,揭揭 示示 有有 正正 偏偏 差差 或或 负负 偏偏 差差。斜斜 线线 的的 斜斜 率率 反反 映偏映偏 差的差的 大大 小。小。3 时时，提示有偏差出现，提示有偏差出现，若若 超超 出出 五五 倍倍，则则 已已 有有 明明 显显 的的 偏偏 差差 发发 生生。（）稳稳 定定 性性 评评 价价 方方 法：法：I 的的 稳稳 定定 性性 表表 现现 为为 某某 些些 实实 验验 C 样样 品品 测测 定定 值值 在多在多 批批 实实 验验 测测 定定 中中 的的 重重 现现 性性 常常 用用 的的 有有 Bo、D、C 样样 品品 测测 定定 值值质控图质控图质质 控控 图图 提提 供供 的的 方方 法法 稳稳 定定 性性 评评 价价 信信 息息 如如 下下：正正 常常 情情 况况 下下 允允 许许 有有 的的 点点 超超 过过 ，1 的的 点点 超超 出出 。若若 实实 际际 超超 出出 以以 上上 限限 额额，提提 示示 该该 参参 数数 的的 批批 间间 稳稳 定定 性性 差差。无明显异常：无明显异常：2SD2SD 但但 2SD 甚至甚至 3SD一定数量一定数量 3SD 系系 统统 误误 差差一个一个 3SD二个二个 2SD三个三个 1SD 超长超长 偏差偏差一个一个QC样品超长偏差样品超长偏差相互接近相互接近质控图质控图 实实 验验 室室 间间 的的 外外 部部 质质 量量 评评 价价 组组 织织 领领 导导 者者 的的 工工 作作：向向 各各 参参 评评 实实 验验 室室 下下 达达 制制 定定 好好 的的 实实 验验 方方 案案，发发 放放 样样 品品。统统 一一 处处 理理 各各 实实 验验 室室 提提 供供 的的 原原 始始 数数 据据 将将 处处 理理 结结 果果 反反 馈馈 给给 参参 评评 实实 验验 室室，并并 针针 对对 结结 果果 提提 出出 评评 价价 意意 见见 参参 评评 实实 验验 室室 的的 工工 作作:按按 统统 一一 方方 案案 与与 要要 求求 进进 行行 实实 验验。定定 期期 向向 组组 织织 者者 提提 供供 实实 验验 信信 息（息（如如：T、S、B、标标 准准 剂剂 量量 点点 及及 样样 品品 等等 反反 应应 管管 放放 射射 性性 测测 量量 的的 原原 始始 数数 据据）根根 据据 反反 馈馈 的的 信信 息息 认认 真真 查查 找找 产产 生生 误误 差差 的的 原原 因因，并并 加加 以以 克克 服服，努努 力力 提提 高高 检检 测测 质质 量量。外部质量评价外部质量评价external quality assessment 第六章 小结1.RIA的基本原理和特点是什么？RIA 的Scatchard方程是什么？2.亲和常数的计算。影响斜率的因素 有哪些？3.RIA建立的必备条件有那些？建立的必备条件有那些？RIA对抗血对抗血 清有何要求？滴度的概念是什么？清有何要求？滴度的概念是什么？第六章 小结4.对标记抗原的要求有哪些？对标记抗原的要求有哪些？5.RIA分离技术有哪些？熟悉其基本原理。分离技术有哪些？熟悉其基本原理。6.标记物的用量、抗血清的使用滴度、标准标记物的用量、抗血清的使用滴度、标准 品浓度范围的确定方法是什么品浓度范围的确定方法是什么？7.RIA加样顺序的选择要求如何？加样顺序的选择要求如何？第七章 小结 1.系统误差与随机误差的区别是什么？系统误差与随机误差的区别是什么？2.质量控制的指标有哪些？质量控制的指标有哪些？3.质控图的构成和作用是什么？质控图的构成和作用是什么？斜率斜率=B/P(P1,P2,P3)P1P2P3B斜率大，斜率大，灵敏度高灵敏度高DR斜率斜率=R/DA.通过提高斜率而确定滴度通过提高斜率而确定滴度RD1：加一定量：加一定量（D）Ag2：D+DDDR .放放 射射 免免 疫疫 分分 析析 方方 法法 设设 计计(1)(1)标标 记记 抗抗 原原 与与 抗抗 体体 用用 量量 选选 择择2 2）抗）抗 血血 清清 使使 用用 滴滴 度度 选选 择择 增增 量量 法法Ag*AgAbAg *Ag AbRR0RD0DRRRRRP抗血清稀释度抗血清稀释度抗血清抗血清稀释度稀释度B.减少误差确定滴度减少误差确定滴度R/RD 正比于正比于 R/