海茴香植物乳杆菌发酵物对黑色素生成抑制作用及安全性评估.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2024年4月第2期Apr.2024,No.2原料与配方105www.ffc-www.ffc-作 者1.广州环亚化妆品科技股份有限公司，广东广州 510663；2.南方医科大学药学院，广东广州 510515林梦雅1 何敬愉1 刘 薇1潘丹阳1 蒋佳欣1 刘孟华2海茴香植物乳杆菌发酵物对黑色素生成抑制作用及安全性评估摘 要通过发酵技术获得海茴香植物乳杆菌发酵物（CMF），利用酪氨酸酶、B16 黑素瘤细胞、人皮肤角质形成细胞（HaCaT）作为测试模型，考察 CMF 对黑色素生成相关靶点的作用，并考察其使用安全性。结果证实 CMF 具有较强的自由基清除能力，其 IC50值为 0.87%，该发酵物可有效抑制细胞内酪氨酸酶活性，并能显著抑制小眼畸形转录因子（MITF）mRNA 以及酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）mRNA 的表达。质量分数 2.0%的 CMF 可使 B16 黑色素瘤细胞中黑色素生成率降低至 33.82%。CMF 还对人肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1）的生成产生抑制作用。通过红细胞溶血试验以及人体斑贴测试证实，CMF 对皮肤无局部刺激性。关键词海茴香发酵液 黑色素抑制 安全性Inhibitory Effect and Safety Evaluation of Crithmum Maritimum FermentationLIN Mengya1 HE Jingyu1 LIU Wei1 PAN Danyang1 JIANG Jiaxin1 LIU Menghua2(1.Guangzhou Uniasia Cosmetic Technology Co.,Ltd.,Guangzhou 510663,Guangdong,China;2.School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China)Abstract:Crithmum maritimum fermentation product(CMF)was obtained by fermentation technology.The effects of CMF on melanogenesis and melanogenesis-related targets were investigated using tyrosinase,B16 melanoma cells and human immortal keratinocyte line cells(HaCaT)as experimental models.The safety experiments were also carried out to detect the satety of its application.The results claimed that CMF possessed significantly high DPPH radical scavenging activities with IC50 value of 0.87%.It could not only effectively inhibit the activity of tyrosinase in cells,but also significantly inhibit the relative expression of microphthalmia-associated transcription factor(MITF)mRNA and tyrosinase-related protein 1(TRP-1)mRNA.Only 33.82%residual tyrosinase activity was retained in B16 cells in contrasting with the model group with the addition of 2%(in mass fraction)CMF.In addition,CMF had an effect on decreasing the production of tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin(IL-1)which played an vital importance in the activation of the tyrosinase.The red blood cell hemolysis test and human patch test confirmed that the CMF had no biological toxicity and could be used in cosmetics safely.Keywords:fermented liquid of Crithmum maritimum melanin inhibition security作 者 简 介林梦雅（1992），女，博士，工程师，主要从事化妆品的相关研究。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0079收稿日期：2023-03-28；修回日期：2023-06-13 黑色素的生成主要经历信号传导、黑色素合成、生成后转移等过程。常见的美白剂曲酸、氢醌虽然能有效抑制黑色素生成，但会破坏皮肤屏障、引起皮肤敏感，带来新的皮肤问题1。四氢姜黄素、苯乙基间苯二酚等美白成分存在稳定性差、实际利用率低的问题2。因此，需要探索更多安全、原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品106www.ffc-www.ffc-天然、高效的新型美白成分。天然植物发酵液中含有多种有机小分子，高效美白的同时避免对皮肤造成不良影响。研究发现，大豆发酵物能有效抑制酪氨酸酶、B16 黑色素瘤细胞的活性3。红景天发酵物和金银花发酵物比其乙醇提取物具有更强的自由基清除能力，功效随着发酵物中总多酚含量的增加而增强4。海茴香（Crithmum maritimum）是一种生长于地中海地区的盐生生物，含有多酚、黄酮、维生素、有机酸等多种对皮肤有益的功效成分5。海茴香中的绿原酸、维生素 C 及多酚类成分能够有效清除自由基，具有很强的抗氧化活性6。自由基是导致黑色素生成的重要诱因，海茴香提取物中培养的去分化细胞可刺激成纤维细胞的迁移和增殖，有效促进皮肤的愈合7。海茴香干细胞能有效降低受试者经皮失水率，且无任何炎症或不良反应8。该发现为解决美白成分的刺激性问题带来新思路。虽然海茴香能够多维改善肤色，但天然植物提取物普遍存在活性物含量低、生物利用率差的问题。发酵技术能够富集或增强植物提取物中的功效成分。目前对于海茴香植物发酵物的研究大多集中在食品行业，在日化品中鲜有报道。因此，该成分在日化品中的应用价值与经济价值，仍需进一步被挖掘。考察海茴香植物乳杆菌发酵物（CMF）对DPPH 自由基清除、黑色素生成及酪氨酸酶活性、相关基因表达、炎症因子生成的影响，从多维度评估 CMF 在美白领域的应用前景。此外，利用红细胞溶血试验、人体斑贴试验等生物模型，对该发酵物的安全性进行测试。1 试验部分1.1 主要材料、试剂与仪器海茴香和海茴香水提物，广州诺葳生物科技有限公司；植物乳杆菌 GDMCC 1.140，广东省微生物菌种保藏中心；MRS 培养基，广东环凯微生物科技有限公司；小鼠黑色素瘤细胞（B16 黑色素瘤细胞），中国科学院上海细胞库；人永生化角质细胞（HaCaT 细胞），中国科学院昆明细胞库；反转录试剂盒 PrimeScript RT Master Mix，日本 Takara 公司；RNA 提取试剂盒，德国 Qiagen公司；人白细胞介素-1（IL-1）、人肿瘤坏死因子-（TNF-）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒，欣博盛生物科技有限公司；SYBR Premix EX Taq（2），Promega 公司；小眼畸形转录因子（MIFT）ELISA 试剂盒，上海西格生物科技有限公司；DPPH（纯度 98.0%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM，高糖，含丙酮酸盐）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、胎牛血清（FBS，特级，热灭活，来源澳大利亚）、胰蛋白酶-EDTA（质量分数 0.25%，含酚红），美国 Gibco Life Technologies 公司；噻唑蓝（MTT，纯度 98.0%）、蘑菇酪氨酸酶（25 000 Units），美国 Sigma-Aldrich 公司；绵羊红细胞，广州鸿泉生物科技有限公司。Epoch2 型 酶 标 仪，美 国 BioTEK 公 司；MicroPure UV/UF 型超纯水机、Micro17R 型冷冻离心机、RI-150CN 型低温培养箱，美国 Thermo Fisher 公司；CFX connect 型荧光定量 PCR 仪，美国 BioRad 公司；CKX41 型倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；H1850 型离心机，湖南湘仪公司；JJ300B 型精密电子天平，瑞士 Satrorius 公司；INC108MED 型 CO2培养箱，德国 Memmert 公司；LRH-250F 型生化培养箱，湖南力辰仪器科技有限公司；KH20R 型冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司。1.2 试验方法1.2.1 海茴香乳酸杆菌发酵物制备将 10 g 海茴香植物粉末与 90 g 去离子水混合，在 121 下灭菌 15 min。放置到室温后加入3 mL 乳酸杆菌菌液（含菌量为 107 CFU/mL）、2 g MRS 肉汤培养基、1 g 蜜二糖、1 g 低聚甘露糖和93 g 去离子水混合，30 下发酵 72 h，将发酵物在 5 000 r/min 下离心 30 min，取离心后的上清液在 121 下灭菌 20 min，得到 CMF。1.2.2 体外酪氨酸酶抑制如表 1 所示，在试管中分别加入对应含量的 PBS（pH 为 6.8）、待测样品、酪氨酸酶溶液（100 U/mL），混合均匀，置于 37 水浴 10 min，加入 1 mL L-酪氨酸溶液（0.5 g/L），混合均匀，置于 37 水浴反应 5 min，在 475 nm 处测定吸光度 A，各反应组吸光度分别为 A1、A2、A3、A4，设置曲酸为对照。按式（1）计算测试成分对酪氨酸酶的抑制率。酪氨酸酶抑制率=1(A3A4)/(A1A2)100%（1）第 2 期原料与配方林梦雅，等：海茴香植物乳杆菌发酵物对黑色素生成抑制作用及安全性评估107www.ffc-表 1 酪氨酸酶抑制试验各试剂用量组别V提取液/mLVPBS 溶液/mLVL-酪氨酸酶/mLV酪氨酸酶溶液/mL102.01.00201.51.00.530.51.51.0040.51.01.00.51.2.3 DPPH 自由基清除向试管中加入质量浓度为 45.8 mg/L 的 DPPH测试液 2.0 mL 和样品 0.05 mL，用体积分数 50%乙醇补充至 3 mL，摇匀，避光反应 30 min 后，在517 nm 波长处测定吸光度，记为 A1；向试管中加入无水乙醇 2 mL 和相应体积的待测样品，用体积分数 50%乙醇补充至 3 mL，测得的吸光度记为A2；向试管中加入 DPPH 测试液 2 mL 和体积分数50%乙醇 1 mL，测得的吸光度记为 A3。按式（2）计算待测液对 DPPH 自由基清除率（Y）。Y=1(A1A2)/A3100（2）1.2.4 B16 细胞活性测定收集对数生长期的 B16 细胞，以 DMEM 完全培养液配成密度为 2105细胞/孔的细胞悬液，接种于 96 孔培养板，每孔 100 L，于 37、体积分数 5%CO2培养箱内培养。镜下观察细胞贴壁后，去掉旧培养液，再分别加入含有质量分数0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%样品的培养液，每孔 100 L。设置空白对照组，每孔 100 L。每组设 3 个复孔作为平行孔。于 37、体积分数 5%CO2培养箱内培养 24 h 后，弃去 96 孔板内旧的培养液，加入 200 L 磷酸缓冲盐溶液（pH 6.8）清洗 2 次，每孔加入 100 L 含有 0.5 mg/mL MTT 的培养液，放入二氧化碳培养箱中孵育 4 h。吸走孔内液体，每孔加入 200 L 二甲基亚砜（DMSO）。将 96 孔培养板放在振荡器上振荡 10 min 使结晶溶解后，用酶标仪测其在 490 nm 处吸收值，以空白对照为基准，计算细胞活率。1.2.5 B16 细胞内酪氨酸酶活性、黑色素和 MITF的测定将 B16 细胞接种至 6 孔板中，在 37 和体积分数 5%CO2的培养箱孵育过夜。然后分别使用质量分数为 0.5%、1.0%、2.0%的样品和 200 nmol/L 促黑素细胞激素（-MSH）孵育 48 h。用 PBS清洗细胞 3 次，用质量分数为 1%的细胞裂解液（TritonX-100/PBS）进行裂解，离心后。用 BCA法对上清液进行蛋白质定量。将磷酸钾缓冲液（100 mmol/L，pH 6.8）、细胞裂解液（50 g）和10 mmol/L DOPA 溶液放置在 37 孵育 1 h 后，在475 nm 处测量吸光度。按式（3）计算酪氨酸酶相对活性。酪氨酸酶相对活性=A1/A0100%（3）式（3）中，A0和 A1分别为对照组和样品的吸光度。B16 细胞（2105细胞/孔）在六孔板中生长。使用质量分数为 0.5%、1.0%和 2.0%的样品和 200 nmol/L-MSH 孵育 48 h，通过超声波将细胞溶解在 1 mL 1 mol/L NaOH（含体积分数 10%DMSO）中，在水浴中（90）孵育 2 h，离心 15 min。在 490 nm 波长处测量上清液的吸光度。用 BCA 法测定细胞内蛋白质含量。按式（4）计算相对黑色素含量。黑色素相对含量=A1/A0100%（4）式（4）中，A0和 A1分别为对照组和样品的吸光度。将 B16 细胞接种至 6 孔板中，在 37 和体积分数 5%CO2的培养箱孵育过夜。然后使用不同含量的样品和 200 nmol/L-MSH 孵育 48 h。用 PBS清洗细胞 3 次，用质量分数为 1%TritonX-100/PBS裂解，离心。测定上清液中 MITF 的含量。1.2.6 HaCaT 细胞活性及 IL-1 和 TNF-含量的测定将 HaCaT 细胞接种至 6 孔板中，在 37 和体积分数 5%CO2的培养箱孵育过夜。待 6 孔板中细胞铺板率达到 50%60%时，往对照组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有质量分数为0.5%、1.0%和2.0%CMF的细胞培养基，预处理1 h，之后用 UVB 辐照（30 mJ/cm2）40 min。于 37 和体积分数 5%CO2的培养箱中继续培养 24 h，测定 IL-1 和 TNF-的含量。1.2.7 qPCR 测定细胞中 mRNA 相对表达通 过 260/280 nm 吸 光 度 的 比 率 测 量 RNA（3 L）含量和纯度，将剩余的 RNA 溶液储存在-80 用于逆转录。总 RNA 通过如下反转录系统转化为第一链互补 DNA（cDNA）：4 L 5Prime Script RT Master MIX、0.5 g 总 RNA 和 20 L 反应中的无 RNase 水。将 cDNA 用于实时 PCR（RT-PCR）和反应体系含有 10 L SYBR Premix EX Taq原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品108www.ffc-www.ffc-（2）、1 L 正向引物（10 mol/L）、1 L 反向引物（10 mol/L，MITF 和 TRP-1，见表 2）和 8 L cDNA，其在 CFX Manager Software 3.0 软件中根据以下条件扩增反应条件：50.0，3 min；95.0，3 min；然后 95.0，10 s 和 60.0，30 s；40 个循环。通过仪器软件分析循环阈值（Ct），并根据比较 Ct 方法（2-Ct）计算 mRNA 表达的倍数变化。表 2 引物信息基因引物MITF5-GTATGAACACGCACTCTCGA-3(F)5-GTAACGTATTTGCCATTTGC-3(R)TRP-15-CTTTCTCCCTTCCTTACTGG-3(F)5-TCGTACTCTTCCAAGGATTCA-3(R)-actin5-ACTATTGGCAACGAGCGGTT-3(F)5-ATGGATGCCACAGGATT-CCA-3(R)1.2.8 红细胞溶血试验取质量分数为 2%的红细胞悬液 500 L 与质量分数为 20%、10%、2%、1%、0.5%、0.3%、0.2%、0.1%（用 PBS 进行稀释）的 CMF 样品溶液进行等体积混合。用生理盐水作为阴性对照组，以质量分数 1%的十二烷基磺酸钠（SDS）作为阳性对照组，设置 3 组平行试验，在 37 生化培养箱中将待测试样品静置培养 3 h 后，取上层清液 10 L与 90 L 生理盐水于 96 控板中进行吸光度的测试。溶血率=A待测样品A阴性对照A阳性对照A阴性对照100%（5）蛋白质变性指数（DI）=A待测样品 575 nmA阴性对照 540 nmA阳性对照 575 nmA阴性对照 540 nm（6）L/D=HC50/DI（7）根据溶血率的相关数据，根据式（5）（7）计算红细胞 50%溶血时的样品质量浓度 HC50（mg/L）以及样品的 DI 值，并根据 HC50和 DI 值计算 L/D 值。与欧洲替代方法验证中心（ECVAM）规定的分级标准进行对照，以确认待测成分是否对细胞有刺激性。1.2.9 人体斑贴试验选择 33 名年龄在 20 30 岁的健康受试者，无孕妇、哺乳期人员，无过敏史，且在试验前期未使用药物。在斑试器小室内，分别加入约 0.02 mL 质量分数 0.5%、1.0%、2.0%受试物，设置不涂抹任何物质的空白对照，将包含待测成分的斑试器用低敏胶带贴敷于受试者背部，持续 24 h。去除斑试器，记录压痕消失后 30 min、24 h、48 h 的皮肤变化，评估刺激性。该试验方案获得广州环亚化妆品科技股份有限公司伦理委员会同意。1.2.10 数据统计分析使用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据以（平均值 标准差）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 的多重比较检验来评估各组之间的统计差异，P0.05 表示有统计学差异。2 结果与讨论2.1 海茴香水提物与 CMF 功效比较海茴香水提物和 CMF 的体外酪氨酸酶抑制活性，结果表明 CMF 具有更强的酪氨酸酶抑制作用（见图 1），*表示与模型组比较，P0.001。因此对其功效性进一步展开研究。2.2 CMF 对 DPPH 自由基清除作用将质量分数为 0.33%2.0%CMF 进行 DPPH自由基清除试验。由图 2 可知，不同质量分数的CMF 对 DPPH 均有较好的自由基清除效果，且随CMF 添加量的提升，自由基清除率呈现线性增长。当添加质量分数为 2.0%CMF 时，自由基清除效率为 76.08%。CMF 对 DPPH 的自由基清除率 IC50为 0.87%。2.3 CMF 对 B16 细胞活性的影响利用 MTT 法评价 CMF 的细胞毒性。由图3 可知，当用质量分数 0.33%2.0%CMF 处理B16 细胞 48 h 后，细胞形态正常，且存活率均在98.37%101.10%。证实 CMF 在质量分数 2.0%以下对 B16 细胞无毒性作用。图 1 CMF 及海茴香水提物对酪氨酸酶的抑制作用1007550250酪氨酸酶抑制率/%0.51.02.0CMF海茴香水提物*添加量/%第 2 期原料与配方林梦雅，等：海茴香植物乳杆菌发酵物对黑色素生成抑制作用及安全性评估109www.ffc-2.5 CMF 对 B16 细胞生成黑色素的影响利用 B16 细胞模型评价 CMF 对黑色素合成的抑制作用。-MSH 可刺激 B16 细胞生成黑色素，0.5%2.0%CMF 均能在显著抑制 B16 细胞中黑色素的生成，且抑制率呈含量依赖（见图 5），*表示与模型组比较 P0.001。当 CMF 质量分数为2.0%时，黑色素合成率降低为模型组的 33.82%。图 2 CMF 对 DPPH 自由基清除作用图 3 CMF 对 B16 细胞活性影响2.4 CMF 对细胞内酪氨酸酶活性的影响酪氨酸酶是黑色素生成过程中的决速酶。通过抑制酪氨酸酶的活性可有效抑制黑色素的生 成9。添加质量分数为 0.5%、1%、2.0%CMF 和-MSH 共同处理 B16 细胞，结果表明，加入 CMF后，酪氨酸酶的活性显著性降低，呈现含量依赖（见图 4），#表示空白组与模型组比较，P0.001；*表示样品组与模型组比较，P0.001。当 CMF质量分数为 2%时，酪氨酸酶活性的抑制率达到93.94%。图 4 CMF 对酪氨酸酶相对活性的影响图 5 CMF 对黑色素合成率的影响2.6 CMF 对细胞内 MITF 含量的影响MITF 被认为是黑色素细胞发育和生存的重要基因，可参与调控黑色素合成过程中的酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）、酪氨酸酶相关蛋白-2（TRP-2）等 3 个关键蛋白酶的表达，从而控制黑素细胞的生存和分化以及细胞内黑色素的合成、转运和分布10。利用 B16 黑色素瘤细胞评价CMF 对 MITF 的作用，如图 6 所示，#表示空白组与模型组比较 P0.001；*表示样品组与模型组比较 P0.01；*表示样品组与模型组比较P0.001。与空白组相比，添加质量分数为 0.5%2.0%CMF 可有效抑制 MITF 的产生,显著下调MITF mRNA 的表达，从而实现对酪氨酸酶的调控作用。2.7 CMF 对 TRP-1mRNA 表达的影响TRP-1 会参与黑素体微观结构的维持，影响黑色素细胞的增殖、死亡以及色素生成的种类，TRP-1 的活跃表达会促进黑色素的生成11。因此，可通过抑制 TRP-1 的表达来降低黑素的生成12。与对照组相比，CMF 可以下调 B16 细胞中 TRP-1 mRNA 的表达，质量分数为 0.5%2%时，抑制效率线性提升（见图 7），其中#表示空白组与模型组比较，P0.001；*表示样品组与模型组比较，P0.001。806040200100806040200DPPH 自由基清除率/%细胞活性/%0.330.50.671.001.01.331.52.002.0CMF 质量分数/%CMF 质量分数/%100806040200黑色素合成率/%模型组0.51.02.0CMF 质量分数/%1801501209060300酪氨酸酶相对活性/%空白组 模型组#0.5*1.02.0CMF 质量分数/%原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品110www.ffc-www.ffc-图 6 CMF 对 B16 细胞中 MITF 含量（a）及 MITF mRNA 相对表达（b）的影响图 8 CMF 对 HaCaT 细胞活性的影响2.8 CMF 的炎症因子抑制作用受紫外线照射后，皮肤会产生导致黑色素生成的关键因子 TNF-、IL-113。在研究 CMF 对炎症因子的影响前，考察 CMF 对 HaCaT 的细胞毒性。结果表明，质量分数在 2.0%及以下时，CMF对 HaCaT 细胞无明显细胞毒性（见图 8）。利用 UVB 对 HaCaT 细胞进行照射，通过检测炎症因子含量，评估 CMF 对炎症因子的抑制作用。如图 9 所示，CMF 可以显著降低细胞中 IL-1和 TNF-的含量，减轻光致炎症带来的皮肤损伤以及色沉。其中#表示空白组与模型组比较，P0.001；*表示样品组与模型组比较，P0.05，*表示样品组与模型组比较，P100，可认为待测成分无细胞刺激性（见表5）。表 5 CMF 对红细胞溶血的影响HC50DIL/D分级47 164.18 mg/L99.06%476无刺激性2.10 人体斑贴试验结果对 CMF 进行人体皮肤斑贴测试，33 人全部完成测试且均对 CMF 呈现阴性反应，未出现红斑、水肿等过敏问题。说明 CMF 对皮肤无局部刺激性。3 结论通过酪氨酸酶活性抑制、B16 细胞黑色素生成抑制、自由基清除、炎症因子抑制等相关试验，对 CMF 在美白产品中的应用价值进行研究。(1)质量分数为 0.5%2.0%CMF 对酪氨酸酶的活性有较强的抑制效率，并可有效抑制 B16黑色素瘤细胞中黑色素的生成，抑制效率呈质量分数依赖。同时，该发酵物可通过抑制 MITF mRNA、TRP-1 mRNA 的转录实现对黑色素生成相关靶点的抑制作用，并有效降低 UVB 导致的炎症因子 IL-1 和 TNF-的含量，起到抗炎舒缓的作用。结合 DPPH 自由基清除效率的试验结果，研究认为 CMF 可从抑制关键因子的表达、抑制酪氨酸酶活性、抑制炎症反应、清除自由基等多维度实现对黑色素沉着的抑制。(2)根据细胞毒性试验、红细胞溶血试验结果以及人体斑贴测试结果，CMF具有较低的生物毒性。参考文献1 GOHARA M,YAGAMI A,SUZUKI K,et al.Allergic contact dermatitis caused by phenylethyl resorcinol 4-(1-phenylethyl)-1,3-benzenediol,a skin-lightening agent in cosmetics J.Contact Dermatitis,2013,69(5):319-320.2 SERMKAEW N,WIWATTANAWONGSA K,KETJINDA W,et 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