HPLC同时测定明目益睛丸中5种有效成分含量.pdf

炮制制剂33Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)中药与临床HPLC同时测定明目益晴丸中5种有效成分含量杨春红，李睿，赵琪，石倩，刘雅琴，赖先荣*，李姝”摘要】目的：建立高效液相色谱法同时测定明目益睛丸中金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂菩Rg1含量测定方法。方法：色谱柱UltimateODS-3（4.6 2 50 mm，5m），流动相为乙睛-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为2 0 3nm，柱温为30，进样量为10 L。结果：金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖菩、人参皂苷Rg1质量浓度分别在5.12 10 2.4g/mL、5.0 0 10 0.0 g/mL、14.8 4 2 9 6.8 g/mL、5.56 111.2 u g/mL、7.2 42 17.2 g/mL范围内与峰面积线性关系良好（r0.9995，n=6）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%；平均加样回收率为9 6.9 6%10 6.50%，RSD小于3%（n=6)。结论：该方法重复性良好、操作简便且稳定，可用于明目益睛丸有效成分的含量测定。关键词】明目益睛丸；高效液相色谱法；含量测定中图分类号 R282.1文献标识码 A文章编号】16 7 4-9 2 6 X(2023)05-007-03Simultaneous determination of five active components in Mingmu Yijing Pills by HPLC/YANG Chun-hong,LI RZHAO Qi,SHI Qian,LIU Ya-qin,LAI Xian-rong,LI Shu/(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu611137,Sichuan;2.Meishan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Meishan 620000,Sichuan)Abstract Objective:To establish a HPLC method for simultaneous determination of hyperoside,schizandrin,hesperidin,acteoside and ginsenoside Rg1 in Mingmu Yijing pills.Method:The determination was performed on UltimateODS-3(4.6x250mm,5 m)column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid aqueous solution(gradient elution)at theflow rate of 1.0 mL-min.The detection wavelength was set at 203 nm.The column temperature was 30C and sample size was 10L.Result:The mass concentrations of hypericin,schisandrin methyl,hesperidin,actinoside and ginsenoside Rgl were 5.12-102.4gmL,5.00100.0 g-mL,14.84296.8 g.mL,5.56111.2 g-mLl,7.24217.2 g:mL respectively.There was a go0dlinear relationship with the peak area(r0.9995,n=6).RSD of precision,stability and reproducibility tests were all less than 3%.The average recoveries were 96.96%106.50%with RSD less than 3%(n=6).Conclusion:The method has good repeatability,simple operation and stability,and can be used for the determination of effective components in Mingmu Yijing pills.Key words Mingmu Yijing Pills;high performance liquid chromatography;content determination明目益睛丸是由眉山市中医医院自制的院内制剂，由盐丝子、五味子、青皮、盐车前子、三七等10 味中药材组成，具有滋阴补肝肾、益气生津的药用功效。该方临床用于治疗肝肾亏虚，目失养所致的近视、糖尿病性视网膜病变、视网膜脱离、视神经菱缩等各类眼病 1-2 。作为经验方剂，目前对其质量控制系统研究较少。根据现有药理研究，苑作者单位 1.成都中医药大学，四川成都6 11137；2.眉山市中医医院，四川眉山6 2 0 0 0 0作者简介】杨春红（19 9 7-），女，硕士研究生，主要从事中药及民族药创新药物研究Tel:19113588519Email:通讯作者 赖先荣（19 7 1-），男，教授，硕士生导师，主要从事中药及民族药创新药物研究Tel:13880078303Email:李姝（19 7 3-），女，中药制剂和临床药学Tel:18990333568E-mail:收稿日期 2 0 2 3-0 1-14丝子补益肝肾，明目，主要成分金丝桃苷可抗肝损伤、保护肾脏，还能改善糖尿病高血糖引起的视网膜病理损伤 3，五味子补虚益目，五味子醇甲具有保肝护肝、抗炎作用 4，青皮理气，橙皮苷参与抗炎、保肝作用 ，车前子利水清热明目，毛蕊花糖苷具有明显的抗炎及肝保护作用，还可改善肾功能，三七行血气，其中人参皂苷Rg1作为主要药效成分可保护视网膜、显著护肝及抗炎 7 。为对明目益睛丸进行质量控制，本实验以上述5种物质作为明目益睛丸的有效成分，建立高效液相色谱法含量测定方法，为后续质量标准研究提供科学依据及参考。1材料1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），HTP-312型电子天平（上海花潮电器有限公34PharmacyChinese Materia Medica2023;14(5)anatnlc中药与临床司），BSA124S型电子分析天平、CPA225D型电子分析天平均购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，KQ-50B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），RATK060L0乐枫超纯水系统（上海乐枫生物科技有限公司）1.2试剂与对照品明目益晴丸（自制，批号MZ221118-1、MZ221118-2、M Z2 2 1118-3），乙腈及甲醇为色谱纯，均购于Sigma（中国）有限公司；磷酸（色谱纯）、甲醇（分析纯）均购于成都市科隆化学品有限公司。对照品由成都德思特生物技术有限公司提供，纯度均大于9 8.0%：金丝桃苷（批号：DST210912-023）、橙皮苷（批号：DST220704-038）、五味子醇甲（批号：DSTDW001001）、毛蕊花糖苷（批号：DSTDL006101）、人参皂苷Rg1（批号：DST-DR000902)2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：UltimateODS-3（4.6 x 2 50 m m，5m），柱温30，流速：1mL/min，进样量：10L，检测波长：2 0 3nm，洗脱序列见表1。表1流动相梯度洗脱时间表B(0.1%磷酸时间(min)A(乙腈，%)水，%)010901817832319.580.53620.379.74525755536647059417360402.2溶液制备对照品溶液制备：精密称取金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rg1适量，甲醇稀释，制成质量浓度分别为0.530 mg/mL、0.517mg/mL、0.8 7 1 mg/mL、0.556 mg/mL、0.7 44 mg/mL，作为对照品储备液。分别精密移取上述各储备液适量，甲醇稀释制成质量浓度为0.0 530 mg/mL、0.0510mg/mL、0.0 8 7 1m g/m L、0.0 556 m g/m L、0.0744mg/mL混合对照品溶液。供试品溶液制备：取自制明目益睛丸粉末2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入8 5%甲醇40mL，称重，超声50 min，放冷，用8 5%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.2 2 m微孔滤膜，即得供试品溶液。阴性对照品溶液制备：按处方比例，分别取缺盐菀丝子、五味子、青皮、盐车前子、三七采用同供试品制备工艺，制备阴性样品后，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。2.3方法学考察2.3.1专属性试验分别精密吸取空白溶液与2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10L，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。由图1可知，各成分峰形完整，与其他相邻峰分离度均大于1.5，且空白溶液及阴性对照品相应位置处无干扰峰出现，表明该方法专属性良好。30052502502002003150150210010050401020304050607o:/mim010203040506070iminAB300300250250320020031505150100100525045041020304050607oUmin10203040506070:/minCD30030025025020012001503150100510025150450400To20304050607o.min10203040506070UminEF300300250250200200150315032100510025040001020304050507/min10203040506070.t/minG图1专属性试验HPLC图A.空白溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；D.缺盐菀丝子阴性对照溶液；E.缺盐车前子阴性对照溶液；F.缺青皮阴性对照溶液；G.缺三七阴性对照溶液；H.缺五味子阴性对照溶液1.金丝桃苷；2.毛蕊花糖苷；3.橙皮苷；4.人参皂苷Rgl；5.五味子醇甲2.3.2线性试验精密量取2.2 项下对照品溶液，加甲醇适量稀释成系列梯度，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，并记录峰面积。以浓度（gmL）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），结果见表2，各成分r均大于0.9 9 9 5，表明线性关系良好。表2 线性试验结果成分线性方程线性范围(ug.mL:)金丝桃苷y=51.894x-12.2190.99975.12102.4中药与临床35Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(5)五味子醇甲y=50.941x-31.10.99995.00100.0橙皮苷y=55.135x+141.710.999614.84296.8毛蕊花糖苷y=40.145x-14.6530.99955.56111.2人参皂Rg1y=3.5398x-1.42860.99967.24217.22.3.3精密度试验照2.2 项下制备供试品溶液，于同一天内连续进样6 次，记录峰面积。结果，金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rg1峰面积的RSD均小于3%，分别为0.7 1%、0.74%、2.2 4%、0.2 0%、0.37%，表明仪器精密度良好。2.3.4稳定性试验耳取同一供试品溶液，放置0、2、4、6、8、12、18、2 4h 后，照2.1项下进样测定并记录峰面积。结果，5个化学成分峰面积的RSD均小于3%，依次为0.46%、0.7 4%、0.2 0%、0.52%、1.89%，说明该方法在2 4h内稳定性较好。2.3.5重复性试验精密称取同一批次明目益睛丸样品共6 份，按“2.2”项下制备供试品溶液，照“2.1”项下条件进样测定，并记录峰面积。根据线性曲线方程计算各成分含量。结果见表，5种成分的RSD均小于3%，表明该方法重复性较好。2.3.6加样回收率试验取各成分含量已知的明目益睛丸6 份，每份约1.0 g，精密称定，按已知含量的100%加入混合对照品，照2.2 项下方法制备供试品溶液，同2.1项下进样条件进行测定，计算加样回收率，结果见表3。表3各成分加样回收率试验结果(n=6)称样回收平均已知量加人量测得量RSD成分量率值(mg)(mg)(mg)(%)(g)(%)(%)金丝桃1.00010.26940.27000.5573106.62103.191.651.00050.26950.27000.5459102.361.00040.26950.27000.5455102.221.00030.26950.27000.5461102.461.00020.26950.27000.5461102.441.00020.26950.27000.5476103.01五味子1.00010.31140.31000.619499.34100.332.19醇甲1.00050.31160.31000.618499.001.00040.31150.31000.619999.461.00030.31150.31000.621499.981.00020.31150.31000.619899.461.00020.31150.31000.6363104.78橙皮苷1.00011.22511.23002.5356106.54106.500.351.00051.22561.23002.5272105.821.00041.22551.23002.5387106.771.00031.22541.23002.5376106.691.00021.22521.23002.5335106.361.00021.22521.23002.5395106.85毛蕊花1.00010.34570.35000.7019101.76101.160.70糖苷1.00050.34590.35000.7011 101.501.0004 0.34580.35000.6980100.621.00030.34580.35000.7020101.771.00020.34580.35000.695799.991.00020.34580.35000.7003101.30人参皂1.00011.05571.10002.131597.8096.961.72Rg11.00051.05611.10002.097694.681.00041.05601.10002.129397.571.0003 1.05591.10002.138398.401.00021.05581.10002.101095.021.00021.05581.10002.137298.312.4含量测定取3批自制明目益睛丸，按2.2 项下制备供试品溶液后，照2.1项下进样条件进行含量测定，各批次平行测定3次，5种有效成分平均含量结果见表4。表45种有效成分含量测定结果（n=3）MZ221118-1MZ221118-2MZ221118-3成分(mg.g)(mg.g)(mg.g)金丝桃苷0.26900.27320.2697五味子醇甲0.31150.31290.3114橙皮苷1.22481.26921.2252毛蕊花糖苷0.34530.35000.3460人参皂苷Rg11.05471.06741.05643结论与讨论本实验采用HPLC同时测定明目益睛丸中金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rg1成分含量。该检测方法下各成分线性曲线相关系数0.9 9 9 5，精密度、重复性及稳定性的RSD值均小于3%，加样回收率在9 0%110%之间，表明该方法稳定可行。在测定各成分含量时，对流动相进行了考察，选择乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水进行梯度洗脱，结合峰形分离度及响应值等因素，最终确定以乙腈-0.1%磷酸水作为本实验流动相条件。同时分别对柱温2 5、30、(下转第55页）陈思敏）上接第49 页）（责任编辑：傅舒）上接第35页）（责任编辑：陈思敏）55Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)中药与临床2004,59(3):261-6.19王永福,等.M3受体蛋白的表达及其在干燥综合征患者发病机制中的作用 z.内蒙古自治区,内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院,2 0 16-0 8-0 1.20 Berggreen E,Nylokken K,Delaleu N,et al.Impaired vas-cular responses to parasympathetic nerve stimulation andmuscarinic receptor activation in the submandibular gland35C及流速0.8 mL/min、1m L/m i n、1.2 m L/m i n 进行考察，确定以柱温30、流速1mL/min作为此实验的进样条件。本实验所建立的方法重现性好、稳定可靠，为明目益睛丸的有效成分含量测定提供了简便方法，同时为相关质量标准的进一步研究提供科学依据及实验基础。参考文献1陈达夫.中医眼科六经法要 M.四川：四川人民出版社,19 7 8:6 2-7 1.2张雪倩,李高彪,周云云,等.通络驻景丸理论渊源及其在眼7 Guo P,An W,Guo Y,et al.Standardized rat coronary ringpreparation and real-time recording of dynamic tension chang-es along vessel diameterJJ.J Vis Exp,2022,(184):e641218王笑妍,李玫,沈志纲,等.红景天苷药理作用研究进展 J.中成药,2 0 2 2,(12):39 32-39 35.9史才兴,梁水菁,李建璋,等.红景天苷药理作用及其机制研究进展 J.菏泽医学专科学校学报,2 0 2 1,(0 4):6 7-7 0+8 4.in nonobese diabetic miceJ.Arthritis research&therapy,2009,11(1):R18.21 Bacman S,Berra A,Sterin-Borda L,et al.Muscarinic ace-tylcholine receptor antibodies as a new marker of dry eyeSjogren syndrome.Investigative ophthalmology&visualscience,2001;,42(2):321-7.科的临床应用 J.中国中医眼科杂志,2 0 18,2 8(0 1):52-54.3曹明明,车琳琳,朱路文.金丝桃苷药理作用及机制研究进展.辽宁中医药大学学报,2 0 2 2,2 4(0 6):150-155.4白晓蕾,宋琳,郑远武,等.五味子醇甲药理研究进展 J.实用中医内科杂志,2 0 2 1,35(0 2):18-2 0.5吕青林,冯锋.积实与青皮主要化学成分对比研究 .北方药学,2 0 13,10(0 5):8-9.6李潮,温柔,严丽萍,等.车前子的品种、炮制及质量评价研究概况 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