9种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析.pdf

/种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析胥富强 王海洋 师春娟 辛培尧 段利武 王齐(甘肃省小陇山林业调查规划院 甘肃 天水 云南林业职业技术学院 云南 昆明 西南林业大学 林学院 云南 昆明)摘要:狼尾草属为禾本科 生或多年生草本植物 该属植物在饲用、保护生态、观赏等方面均有良好的应用价值 为探讨狼尾草属植物叶绿体基因组的遗传结构及进化特征 基于基因组浅层测序技术获得狼尾草属 种植物叶绿体基因组序列 对其组装与注释后进行生物信息学分析 结果显示:()种狼尾草属植物叶绿体基因组均为典型的四分体结构 其大小在 之间 叶绿体基因组 含量范围为 其中 区 含量最高 为 各叶绿体基因组结构无明显差异 在/交界区表现出微小差异()共注释 个基因 包括 个编码蛋白基因、个 基因和 个 基因 对序列进行简单重复序列检测 共检测到 个 位点 其中单核苷酸重复数量最多 而在非简单序列重复检测中 串联重复所占比例最高()变异位点主要存在于叶绿体 和 区 筛选出 个差异较大的区域 可作为狼尾草属植物的潜在遗传标记()基于 条狼尾草属植物样本叶绿体基因组序列构建了狼尾草属系统发育树 结果形成两大分支 阐明了狼尾草属植物种间亲缘关系 本研究可为狼尾草属植物的分类鉴定、系统进化、种群遗传和分子育种等提供理论指导关键词:狼尾草属 叶绿体基因组 序列分析 系统发育中图分类号:文献标识码:文章编号:()():()/第 卷 期 年 月 西 部 林 业 科 学 收稿日期:基金项目:云南省教育厅科学研究基金项目“观赏狼尾草属植物种质优选及其系统发育研究(编号:)”第一作者简介:胥富强()男 高级工程师 主要从事林草资源调查工作:通信作者简介:王齐()男 博士 教授 主要从事牧草/草坪草抗逆生理研究:狼尾草属()为禾本科()生或多年生的草本植物 约有 个种 是热带地区的饲料作物和主要粮食作物 该属植物的中心分布区域为非洲 在热带和亚热带地区居多 少数种可达温寒地带 我国境内被记载的狼尾草属植物主要分布在河北、江西、海南、重庆、四川、云南、甘肃、青海等地 年 同文轩发现了宝鸡狼尾草()为狼尾草的新种 年 吴 玉 虎发 现 了 青 海 白 草()为青海狼尾草的一个新变种 至今我国有狼尾草属植物共计 个种 个变种 其中包括引进的 个种狼尾草作为我国的重要牧草资源 狼尾草属植物在分子生物学方面的研究较多 叶健军等用引物组合法对 份狼尾草属植物样本进行基因分型 将所得条带的聚类分析结果分为五大、五小规模集群 研究发现就算排除了不良种质管理做法、高层次的遗传一致性、非最佳引物等因素 扩增片段长度多态性技术的数据也不能清晰划分狼尾草属植物样本的界限 刘伟民等和姚运法等通过基于 及 标记的 聚类分析可以把彼此间亲缘关系较近的 矮象草桂牧 号 象草 王草 等区分开来证明了在种间鉴别及遗传关系分析方面 及 分子标记具有很好的应用价值 目前对狼尾草属植物分类 基因组研究方面非常有限 国内狼尾草属植物的种质资源多而杂 其中含有各个地域野生种、引种栽培的变种以及培育的新种 再加上各地的互相引种 导致了名称和分类归属的混乱而且有多种狼尾草属植物都有相同或相近的别称如中型狼尾草()与长序狼尾草()均有别称“白草”还 有 拉 丁 名 为“()”有与该属名相同的中文命名“狼尾草”虽然现今已有分子标记技术、形态学、细胞学等方面的研究 但是在分类归属上问题仍然比较多叶绿体是植物光合作用和固碳的主要场所 高等植物叶绿体基因组是一个双链环状 分子大小在 之间 包含约 个基因 叶绿体基因组具有典型的四分体结构 在大多数植物中包括一个大的单拷贝区()、一个小的单拷贝区()和一对反向重复序列()与核基因组相比 叶绿体基因组的独特之处在于其母系遗传、体积小、结构简单和序列保守 因此叶绿体基因组序列被广泛用于系统发育和适应性进化研究本研究以 种狼尾草属植物共 个样本为研究对象 利用浅层测序技术获得叶绿体全基因组序列 对其进行组装和注释 通过比较基因组学进行研究分析 阐明狼尾草属植物叶绿体基因组的结构和组成特点 丰富狼尾草属叶绿体基因组数据库为后续研究该属物种提供更多序列信息 同时也为狼尾草属植物种质资源的评价、开发、利用以及重要经济性状的遗传改良提供理论依据 材料与方法 材料分析材料来自云南林业职业技术学院引种栽培的 种狼尾草属植物共 个样本(表)所有样本皆经云南林业职业技术学院组织的专家鉴定表 实验材料信息及标本号.序号名称拉丁名标本号长序狼尾草 象草 非洲狼尾草 铺地狼尾草 羽绒狼尾草 绒毛狼尾草 东方狼尾草 牧地狼尾草 铺地狼尾草 紫御谷 第 期胥富强等:种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析 方法 的提取与测序将狼尾草属植物 个样本新鲜叶片送至中国科学院昆明植物研究所进行 提取及测序 新鲜植物叶片采用改良的 法提取总 在 二代基因组分析平台上对总 进行双向末端测序 每个样品添加标签混合建库 文段的片段大小为 双向 或 测序每个样本确保获取不低于 的测序数据 叶绿体基因组的组装和注释使用 软件组装叶绿体基因组对于很难用软件组装的有杂质或者低质量的序列采用人工组装 具体方法为:以狼尾草属中的象草(:)基因组序列为参考序列 结合使用 和 软件 把 组装成完整的叶绿体基因组 获取 有两种方式:()通过 程序运行后输出的“”文件中即含()运行 程序 过滤测序获取到的 序列 即得到高质量的片段()用 软件来组装 得到长度更长的片段()最后对狼尾草属叶绿体基因组进行注释 注释程序选择在线程序(:/)绘制狼尾草属叶绿体基因组物理图选择在线程序 (:/)狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析及突变检测 对狼尾草属 个叶绿体基因组、大单拷贝区(区)、小单拷贝区(区)和反向重复去(区)的大小及 含量进行统计 然后对 个狼尾草属植物的叶绿体基因组的基因数量和种类进行统计 其中包括编码蛋白质、和 是一个用 语言写的从 序列中鉴定简单重复序列()的程序 利用 软件检测 个狼尾草属植物叶绿体基因组简单序列重复数量 搜索的标准是:重复单元 单核苷酸重复序列最小重复数为 二核苷酸重复序列的最小重复数为 三、四、五核苷酸重复序列的最小重复数均为 六核苷酸重复序列的最小重复数均为 两个重复序列间隔最小值为 然后用 在线程序(:/)检测叶绿体基因组非简单序列重复中的 (反向重复)、(正向重复)、(互补重复)和 (回文重复)按照如下参数设置:():():():然后用 在线程序(:/)检测串联重复()按照如下参数设 置:序列差异分析对狼尾草属 个叶绿体基区组的 个区段进行比较 通过对比 区边界区域的基因分布分析不同狼尾草属叶绿体基因组结构差异 采用 软件对狼尾草属 个叶绿体基因组进行滑动窗口分析评估叶绿体基因组之间的核苷酸变异性()步长设置为 窗口长度设置为 系统发育关系重建利用本研究 条狼尾草属植物叶绿体基因组序列 加上从 数据库下载获得的 条狼尾草属植物完整叶绿体基因组序列 将狗尾草属的 个物种和钝叶草属()的 个物种做为外类群 共计 条叶绿体基因组序列进行系统发育关系重建 首先将叶绿体基因组序列用在线 软件进行比对 然后进行手工调整和矫正 得到可靠的矩阵用于系统发育分析分别使用最大似然法()和贝叶斯推理法()来构建系统发育树 构建 树先使用 选择的最合适的 替换模型进行系统发育重建 采用 软件构建 树 马尔科夫链蒙特卡洛迭代运算 代 每 代抽样一次 当 ()小于 时 用于构建系统发育树 使用 进行 分析 使用 和 近零分支选项进行 个引导重复 支持率()大于 时认为支持率较好 用 软件进行结果对比 查看和美化 结果与分析 狼尾草属植物叶绿体基因组基本信息 个狼尾草属植物叶绿体基因组均为典型的西 部 林 业 科 学 年四分体结构(图)其大小在 之间 最大差距为 叶绿体基因组最小的是非洲狼尾草 大小为 最大的是羽绒狼尾草 大小为 区的大小为 最大差距为 最小的是东非狼尾草 长度为 最大的是羽绒狼尾草长度为 区的大小为 最大差距为 最小的是长序狼尾草 长度为 最大的是羽绒狼尾草 长度为 区的大小为 最大差距为 最小的是非洲狼尾草 长度为 最大的是绒毛狼尾草 长度为 含量范围为 其中 区 含量范围为 区 含量范围为 区 含量范围为 (表)图 狼尾草属植物叶绿体基因组物理图谱注:图谱中大环上不同种类的基因用不同颜色的矩阵代表 基因转录的方向用箭头的方向表示 在大环内的基因是按照顺时针方向转录的 在大环外的基因是按照逆时针方向转录的 含量在小环内用深灰色区域代表 表 个狼尾草属植物样本叶绿体基因组特征.序号物种长度/长度/长度/长度/长序狼尾草 象草 非洲狼尾草 铺地狼尾草 羽绒狼尾草 绒毛狼尾草 东方狼尾草 牧地狼尾草 铺地狼尾草 紫御谷 第 期胥富强等:种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析 共注释了 个基因 包括 个 基因 个编码蛋白基因和 个 基因 个基因在 区重复 为互相拷贝 包括 个蛋白编码基因、个 基因和 个 基因 根据功能对基因进行分类 和光合作用有关的基因有 个(、/、)和转录、翻译相关的基因有 个(、)基因 个(、)其他的一些基因和未知功能的基因()一共 个(、)(表)表 个狼尾草属植物样本叶绿体基因组基因分布.基因分类基因分组基因名称光合系统基因光系统 亚基()光系统 亚基()细胞色素复合物(/)合成酶亚基()二磷酸核酮糖羧化酶大亚基()脱氢酶亚基()遗传系统基因核糖体()转运()核糖体蛋白小亚基()核糖体蛋白大亚基()聚合酶亚基()其他基因成熟酶()被膜蛋白()细胞色素 合成酶()蛋白酶()真核起始因子()其他基因()未知功能基因假定叶绿体阅读框()个狼尾草属植物样本叶绿体基因组的突变类型 叶绿体基因组的 区可视化分析发现 个狼尾草属植物叶绿体基因组的结构、基因顺序无明显差异 在/交界区表现出微小差异 叶绿体基因组 区大小为 与 区边界基因为 与 区边界基因为 与 区边界基因为西 部 林 业 科 学 年 与 区边界基因为 东非狼尾草 的 基因距/边界 其余物种的 基因距离/边界 所有物种的 基因跨越 区的长度为 长序狼尾草 的 基因跨越 区的长度为 其余物种的 基因跨越 区的长度为 个样本 与 区边界的 基因长度都为 东非狼尾草的 基因距 与 区边界 其余样本的 基因距 与 区边界(图)图 个狼尾草属植物叶绿体基因组 及 边界比较 叶绿体基因组的重复序列检测检测了 个狼尾草属植物叶绿体基因组的简单重复序列数量 共检测到 个 位点 检测到的位点包括单核苷酸重复 双核苷酸重复及复合型核苷酸重复共 种 其中单核苷酸重复数量最多 为 个 其次是双核苷酸重复 个 三核苷酸重复 个 四、六核苷酸重复均为 个 未检测出五核苷酸重复(图)分别检测 个狼尾草属植物叶绿体基因组的(正向重复)、(反向重复)、(回文重复)、(互补重复)和 (串联重复)的数量(图)结果显示正向重复的数量为 个反向重复的数量为 个 回文重复的数量为 个 串联重复的数量为 个 未检测到互补重复图 个狼尾草属植物叶绿体基因组中检测到的 数量及类型 第 期胥富强等:种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析图 个狼尾草属植物叶绿体基因组非简单序列重复类型和数量 序列差异分析以长序狼尾草叶绿体基因组序列作为参考的序列同源性比较表明 供试的狼尾草属植物叶绿体基因组结构基本一致 种间序列整体较为保守 尤其是 基因区 在整体变异上 基因非编码的基因间区和部分内含子区变异率要高于 基因区 区和 区的变异率高于 基因所在的 区(图)突变热点筛选利用 软件计算 个狼尾草属植物叶绿体基因组在 范围内的核苷酸变异度()结果表明 个叶绿体基因组核苷酸变异度为 平均值为 有 个存在明显序列变异的高变区域()分别为()其中 个位于 区 个位于 区 区未发现变异较高的序列片段(图)核苷酸变异度为 平均值为 有 个存在明显序列变异的高变区域()分别为 图 个狼尾草属植物叶绿体基因组序列对比图 西 部 林 业 科 学 年图 狼尾草属植物 个叶绿体基因组核苷酸变异度()的比较()狼尾草属植物 个叶绿体基因组核苷酸变异度()的比较()()()()基于叶绿体基因组的狼尾草属植物系统发育分析 基于叶绿体基因组序列构建的狼尾草属植物 和 发育树具有较好的支持率 发育树结果一致(图)两个发育树均形成 和 两个大的分支 其中 分支()包括 个物种:羽绒狼尾草()、非洲 狼 尾 草()、白 穗 狼 尾 草()、东 非 狼 尾 草()其中东非狼尾草的 个样本聚在一个亚分支()与非洲狼尾草、形成姐妹关系()分支()又可分为三 个亚支 第一个亚支()包括长 序 狼 尾 草()、其中 的 个样本聚 在 一 起 和 长 序 狼 尾 草 与 形成姐妹关系()第二个亚分支()包括东方狼 尾 草、且与第一个亚支形成姐妹关系()第三个亚支()包括绒毛狼尾草、象草()、紫御谷()、牧 地 狼 尾 草()、其中象草的 个样本并未聚在一起 象草()这个样本嵌套在另一小支中 第 期胥富强等:种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析图 基于叶绿体基因组数据构建狼尾草属植物 和 系统发育树 讨论与结论 讨论高等植物的叶绿体基因组的序列长度一般在 之间 如冉然对 种蒿属()植物研究发现其叶绿体基因组序列长度在 之间 岳杰对 种人参属()植物研究发现其叶绿体基因组序列长度在 之间 顾丽对 种天胡荽属()植物研究发现其叶绿体基因组大小在 之间 本研究新测序的 个狼尾草属植物叶绿体基因组大小在 之间 最大差距为 最小的是非洲狼尾草 为 最大的是羽绒狼尾草 为 狼尾草属植物叶绿体基因组均为典型四分体结构 完全符合高等植物叶绿体基因组特征 一般来说每个物种都有一个相对独立且固定的 含量 如石蒜科()、蔷薇科()等部分植物均存在此特征本研究中 个狼尾草属植物的叶绿体基因组 含量范围为 且 区 含量()高于 区()和 区()推测 区 基因的存在可能是导致 区 含量较高的主要原因完整的叶绿体基因组是用于系统发育分析的有价值的遗传标记来源 因为其基因组结构相对保守 而 区是植物叶绿体基因组中最保守的区域 区的长度、结构及与 区的边界都表现出较高的保守性 区的扩张和收缩作为引起植物叶绿体基因组长短变化的重要因素 大多数物种的 区的扩张与收缩体现在/边界在几个固定基因内的少量偏移 这种偏移可能导致部分基因成为假基因 本研究中 个狼尾草属植物基因组的 边界区域比较保守 几乎没有差异西 部 林 业 科 学 年叶绿体基因组均有 个基因 包括 个编码蛋白基因 个 基因和 个 基因 叶绿体基因组的大小、基因顺序和组成与已报道的狼尾草属植物基因组高度相似在基因组中 并不是所有的基因突变事件都是随机的 而是聚集性的 并且这些突变位点在基因组中创造了高度可变的区域 在已完成测序的狼尾草属植物中 广泛用作植物 条形码的、和 基因在叶绿体基因组中的遗传变异低于预期 但却发现 个其他高变区 并且有两个高变区(与)这与 等研究结果一致 基因组中存在的高变区可用做 条形码鉴别物种 也可作为重建狼尾草属系统发育关系的潜在标记 因此 这些高度分化的区域能为狼尾草属植物鉴定、系统发育、分子标记开发提供丰富的信息本研究基于叶绿体全基因组构建的贝叶斯树和最大似然树 具有较高的支持率 树和 树均支持分成 个大的分支 其中 个分支分为 个亚枝 在基于叶绿体全基因组构建的发育树中 东非狼 尾 草 与 ()和()聚在一起 其亲缘关系较近 这与 等的研究结果相同 另外 等研 究 中 发 现 ()、()、象草、绒毛狼尾草在系统发育树中聚在一起 这也与本研究中系统发育分析结果相吻合 值得一提的是 所有发育树中象草 的 个样本并未聚在一起 象草()样本嵌套在其他亚支中 推测该种可能为杂交种或地域原因导致的遗传差异 结论本研究测序的 个狼尾草属植物叶绿体基因组均为典型的四分体结构 序列长度在 之间 其结构无明显差异 含量在 之间 编码 个基因 重复序列检测分析表明:在简单序列重复检测中单核苷酸重复数量最多 而在非简单序列重复检测中串联重复所占比例最高 结构突变以及序列差异的分析显示:区边界无明显伸缩或扩张现象 区和 区的变异率较高 系统发育关系分析显示:份狼尾草属植物样本间界限清晰 发育树形成两个大的分支 其中第一个分支又可分为 个亚支 且第一亚枝与第二亚枝为姐妹群 对目前已发表叶绿体基因组的狼尾草属植物的系统发育分析揭示了物种之间的亲缘关系 为狼尾草属植物开发利用以及遗传改良提供理论基础参考文献:中国科学院中国植物委员会.中国植物志.北京:科学出版社.:.():.同文轩.中国狼尾草属一新种.植物研究():.吴玉虎.青海狼尾草属一新变种.西北植物学报():.张怀山.狼尾草属牧草种质资源的开发利用.中国草食动物科学():.侯新村滕珂郭强等.狼尾草属牧草研究进展.植物学报():.唐军周汉林王文强等.狼尾草属牧草育种及分子生物学研究进展.热带作物学报():.叶健军林洁荣焦文静等.福建省狼尾草属种质资源 鉴定分析.广东农业科学():.刘伟民乔良普.狼尾草属牧草遗传多样性的 分析.山东畜牧兽医():.姚运法洪建基曾日秋.狼尾草遗传多样性 分析.甘肃农业大学学报():.王栋原著任继周王槐三等.牧草学各论(新 版).南京:江苏科学技术出版社.:.:.:.():.:.():.():.陈昆松李方徐昌杰等.改良 法用于多年生植物组织基因组 的大量提取.遗传():.第 期胥富强等:种狼尾草属植物叶绿体基因组特征分析 .:.():.:.():.():.:.():.:.():.:.():.:.():.:.():.:.:.:.():.冉然.北方 种蒿属植物叶绿体基因组比较与系统进化分析.呼和浩特:内蒙古农业大学.岳杰.四种人参属植物叶绿体全基因组结构及其系统发育分析.汉中:陕西理工大学.顾丽.中国天胡荽属叶绿体比较基因组学及系统发育研究.贵阳:贵州大学.邢渊格.基于 序列的石蒜属种间关系研究.呼和浩特:内蒙古农业大学.():.谢海坤焦健樊秀彩等.基于高通量测序组装赤霞珠叶绿体基因组及其特征分析.中国农业科学():.():.().():.()(.).():.():.:.:.():.:.():.:.().():.():.():.:.().():.(责任编辑:李甜江)西 部 林 业 科 学 年