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Hlllllllll Y2257688 _硕士学位论文乙肝病毒标志物定量及其与E抗原血清学转换关系 摘要研究背景：1965年，美国科学家Blumber g首次在澳大利亚土著人血清中发现“澳大利 亚抗原”。其随后被确定为乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B sur face antigen,HBsAg),是乙肝病毒(Hepatitis B Vir us,HBV)感染后最早出现于患者血清中的HBV标 志物。若HBsAg在患者血清中持续时间超过6个月，即可诊断为慢性乙型肝炎 病毒感染(Chr o nic hepatitis B,CHB)。据世界卫生组织WHO报道，全世界有3.5 亿左右慢性HBV感染者，每年大约有100万人因HBV感染引起的并发症而死 亡。如肝硬化(Cir r o sis)、肝衰竭(Livergliur e)和原发性肝细胞癌(Hepato cellular Car cino ma,HCC)0因此，慢性乙型肝炎患者的管理与治疗是个艰巨而意义重大 的任务。乙肝病毒E抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)与HBsAg同时或稍晚出现于 感染者血清中，是乙肝病毒在体内复制活跃的标志之一。在慢乙肝患者管理与 治疗过程中，若出现HBsAg或HBeAg消失，并产生表面抗体(Hepatitis B sur face antibo dy,HBsAb)或 E 抗体(Hepatitis B e antibo dy,HBeAb),即发生血清学转换(Ser o co nver sio n)o通常意味着体内乙肝病毒复制活性降低，病情好转，是常用的 评估病情和治疗效果的指标，是重要的临床治疗终点。越来越多的临床研究发 现，治疗前血清HBsAg和HBeAg低水平与其高血清学转换率密切相关。I摘要随着检测技术的发展，定量检测HBsAg和HBeAg水平已成为可能。这为 我们深入探讨HBsAg和HBeAg水平及其变化模式评估HBV抗病毒疗效提供了 新手段。因此，我们需要能准确定量血清HBsAg和HBeAg水平的检测方法。目前，有两种试剂可以定量检测血清HBsAg水平，分别是美国雅培公司和德国罗氏公 司的HBsAg检测方法。其中最为广泛使用的是雅培表面抗原检测方法。而罗氏 表面抗原检测方法可以通过简单的稀释步骤和转换实现HBsAg定量检测。Kar sten Wur stho m 和 Milan J.So nneveld等研究团 队已经对两种检测方法进行 比 较，发现二者之间的结果具有很高的相关性。但是其研究病例基因型分布以A 型和D型为主，而我国分布主要是C型和B型，故本研究第一部分比较雅培和 罗氏HBsAg检测方法定量检测基因型B和C患者血清HBsAg水平的相关性和 差异性。目前国际上尚无HBeAg定量检测试剂，但是雅培和罗氏HBeAg检测方法 都可以通过PEIU标准品，制作标准曲线，然后实现定量检测血清HBeAg水平。雅培E抗原试剂每次更换批号时，需要重新制作标准曲线；而罗氏HBeAg试剂 可以直接使用由公司提供的定量转换公式，不受试剂批号影响。第二部分主要 比较雅培和罗氏HBeAg检测方法定量检测结果的一致性。乙肝病毒C基因区高度易变，常见变异位点G1896A变异和A1762T/G1764A 双变异。前者可使HBeAg翻译提前终止，而A1762T7G1764A双变异可明显降 低血清HBeAg水平。而血清HBeAg低水平者易于发生血清学转换。但是临床 实践中，我们亦观察到部分病例持续维持低水平E抗原，而不发生E抗原血清 学转换。我们推测，是否造成HBeAg定量降低的原因的差异，导致其结果的不 同。因此，第三部分研究主要着重结合BCP/PC变异，观察E抗原定量水平对血 清学转换发生率的影响，从而提高HBeAg定量水平对抗病毒治疗疗效的评估预 测能力。研究目的:n硕士学位论文1.结合基因型及抗病毒治疗状态，比较罗氏与雅培试剂定量检测乙肝E抗原阳 性患者血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性。2.结合BCP/PC变异，观察血清HBeAg定量水平对HBeAg血清学转换发生率 的影响，从而提高HBeAg定量水平对抗病毒治疗疗效的评估预测能力。研究方法：1.比较雅培和罗氏试剂检测血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性1.1 研究样本来源共收集1308例乙肝患者病例血清，均来自广州市南方医院肝病中心。所有 血清均同时接受雅培和罗氏两种表面抗原和E抗原方法检测，其中16份血清未 纳入定量分析比较，因两种或一种方法检测其E抗原为阴性。所有血清检测前 均被分装为成两份，保存于-30冰箱。1.2 雅培和罗氏检验方法1.2.1 HBsAg检测方法雅培HBsAg方法是化学发光微粒法，罗氏方法是电子化学发光微粒法。前 者是直接定量检测方法，而罗氏HBsAg方法需要通过简单的稀释步骤和转换实 现定量检测血清HBsAg水平。122 HBeAg检测方法雅培和罗氏HBeAg方法都是定性检测方法，但是通过PEIU标准品制作标 准曲线来定量检测血清HBeAg水平。1.3 基因型测定对与乙肝病毒聚合酶逆转录区BC亚区部分重叠的表面抗原编码区进行直 接测序，然后进行系统树构建分型。1.4 统计分析所有结果在分析前均取10为底的对数值，两种方法的相关性比较使用 SPSS18.0统计软件进行Pear so n相关分析；连续变量的分组比较采用非参数方法 Mann-Whitney；两种方法差异性分析采用 Gr aphpad pr ism5.0 软件 Bl and-Altman摘要plo t进行描述。所有分析均采用双侧检验，若PV0.05,则认为有统计学意义。2.HBeAg定量与BCP/PC变异及其血清学转换关系研究2.1 病例来源患者来自南方医院肝病中心参加“国家H一五重大专项“EFFORT临床研究的 受试者共83例。2.2 基因变异分析用 DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Blo o d Mini Kit)提取血清 HBV DNA,巢 氏PCR扩增C基因区并将第二轮产物送英骏公司进行直接测序。序列峰图用 Chr o mas软件分析，变异判断用Mutatio n sur veyo r软件3.0分析。23统计分析所有数据均使用SPSS18.0统计软件进行分析。分组间比较采用非参数 Mann-Whitney方法分析，多组间比较采用Kr uskal-Wallis H检验，率的比较用 Fisher精确检验分析，所有结果均采用双侧检验，P0.05被认为差异有统计学意 义。HBVDNA和HBeAg在分析前取10为底的对数值。研究结果：L比较雅培和罗氏试剂检测血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性1.1 基因型分布与治疗状态根据直接测序及种系发生分析，血清总体基因型分布为：B基因型组：514 例(39.78%)；C基因型组776例(60.06%),D基因型2例(0.16%)。核昔初治组 基因型分布为：B基因型442例(39.46%)；C基因型676例(60.36%),D基因 型2例(0.18%)。根据治疗状态，分别有1120(86.69%)份未治疗患者血清纳入初 治组，172(13.31%)血清纳入治疗组。1.2 治疗前血清HBsAg和HBeAg水平与基因分布关系治疗前表面抗原分布因基因型不同而有显著差异，基因型B组表面抗原定 量高于基因型 C 组(中位数 BC：4.53 VS 4.08 logio IU/mL,P=0.000,Z=-10.845)；治疗前样本不同基因型E抗原定量的差异无统计学意义(中位数B：c：2.96 vs 2.88 lo gio PEI U/mL,P=0.203,Z=1.274)。硕士学位论文1.3 系统性比较雅培和罗氏HBsAg方法系统性比较，其相关系数是0.939(95%CI：0.932 0.945),P=0.000o 而其差异性为：lo g()IU/mL罗氏-lo gio IU/mL 雅培=0.075 0.241 lo gio IU/mLo而两种检测方法定量检测HBeAg水平系统性比较，其相关 系数是 0.987(95%CI:0.985 0.988),P=0.000o 而其差异性为：lo gio PEIU/ml 罗 氏-lo g10PE IU/ml 雅培)=-0.149 0.165 lo gio PE lU/mL 1.4基因型分组比较根据基因型分成基因型B组和C组，两种HBsAg检测方法相关系数分别为 0.942(95%CE0.932 0.951)和 0.948(95%CI:0.940 0.955),P=0.000o 而其差异 性(比率(罗氏/雅培)分别为0.993和1.037。两种HBeAg检测方法其相关系数 分别为 0.988(95%CI:0.985 0.990)和 0.986(95%CI:0.984 0.988),P=0.000o 而其差异性(比率(罗氏/雅培)分别为0.815和0.957。1.5治疗状态分组比较根据治疗状态，各基因型组分别被分为两组，B基因型组治疗前HBsAg相 关性为 0.919(95%CI:0.903 0.932),治疗后相关性为 0.979(95%CI:0.967 0.987),P=0.000o 而C基因型组治疗前HBsAg相关性为0.945(95%CI:0.936 0.952)；治疗后相关性 0.956(95%CI:0.935 0.970),P=0.000o B 基因型组治疗 前 HBeAg相关性为0.985(95%CI:0.9810.987；治疗后HBeAg相关性为 0.980(95%CI:0.9680.988,P=0.000o而C基因型组治疗前HBeAg相关性为 0.984(95%CI:0.981 0.986)；治疗后 HBeAg 相关性 0.982(95%CI:0.973 0.988),P=0.000o2.HBeAg定量与BCP/PC变异及其血清学转换关系研究2.1 治疗52周累积HBeAg血清学转换率与基线期HBeAg定量关系根据HBeAg水平是否大于2.44 lo g10PEIU/ml,分为HBeAg低定量组和 HBeAg高定量组，其随访12周、24周、36周、52周时HBeAg血清学转换率 为 23.53%VS 0%(P=0.003),35.29%VS 1.92%(P=0.001),41.18%VS 5.77%(P=0.001),52.94%VS 17.31%(P=0.009).摘要2.2 BCP/PC变异与基线期E抗原定量关系研究变异组与野生株组E抗原定量水平有区别，有统计学意义(中位数变异组:野生组：2.69 VS 3.12 lo gio PEI U/ml,P=0.032)；以 HBV DNA 校正后，同样有统计 学意义(P=0.003)。1762A/1764T纯合变异者E抗原定量中位数为2.11 lo gio PEI U/ml,杂合变异者E抗原定量中位数为3.10 lo gio PEI U/mL野生株E抗原定量 中位数为3.08 lo g)o PEI U/ml,三组之间E抗原定量有统计学意义差别(P=0.002)。而杂合变异组与野生组之间差别无统计学意义(P=0.693)。以HBV DNA水平作 为校正因素，比较三组间区别，同样有统计学意义(P=0.006),而杂合变异组与 野生组之间无统计学意义(P=0.973)。2.3B CP/PC变异与治疔各期E抗原血清学转换率关系研究变异组与野生组随访12周、24周、36周、52周时HBeAg血清学转换率为 9.5%VS 0.0%(P=0.150),9.5%VS ll.l%(P=1.00),9.5%VS 22.2%(P=0.173),23.8%VS 29.6%(P=0.589)o 研究结论：1.雅培与罗氏HBsAg方法和HBeAg方法定量检测结果均具有较高的相关性和低 差异性，且不受治疗状态和基因型影响。两种检测方法均可用于临床与科研定 量检测HBsAg和HBeAg水平。2.G1896A和/或A1762T/G1764A变异可明显降低血清HBeAg水平。3.血清HBeAg低定量水平时，发生HBeAg血清学转换的概率更高。4.治疗前G1896A和/或A1762T/G1764A变异与否与HBeAg血清学转换率无明 显相关性。关键词表面抗原 乙肝病毒E抗原定量雅培罗氏血清学转换VI硕士学位论文Quantific atio n o f Hepatitis B Vir us mar ker s and their r el atio nship to Hepatitis B eAntigen Ser o c o nver sio n ABSTRACTBac kgr o und:Hepatitis B vir us(HBV)was fir stly r eco gnized by the disco ver y o f Austr alia antigen,in ser um by Blumber g in 1965.Since then,it has been used as the hallmar k fo r the diagno sis o f HBV infectio n and named as hepatitis B sur face antigen(HBsAg).It is the fir st mar ker appear ed in ser um o f patients infected with HBV.Its per sistence in ser um fo r mo r e than 6 mo nths is the key diagno stic cr iter io n fo r chr o nic Hepatitis B(CHB).Acco r ding to Wo r ld Health Or ganizatio n(WHO),ther e ar e mo r e than 350 millio n peo ple infected with HBV chr o nically.HBV infectio n acco unts fo r annually 1 millio n deaths wo r ldwide fr o m cir r ho sis,liver failur e,and hepato cellular car cino ma(HCC).So it is an impo r tant and difficult task to manage individuals with CHB.Hepatitis B e antigen(HBeAg)is ano ther HBV mar ker appear ed in ser um to gether o r later than HBsAg.Its existence in ser um means that vir us is pr o lifer ating actively.If HBsAg o r HBeAg disappear,and their co r r espo nding antibo dy can be detected,ser o lo gical co nver sio n(Ser o co nver sio n)happens.It usually indicates a decline in vir al r eplicatio n and the subsequent r emissio n o f liver disease,which is a favo r able clinical o utco me.So they ar e always used as mar ker s to evaluate antivir al ther apy.Sever al differ ent tr eatment co ho r ts have sho wn that a lo wer pr etr eatment HBsAg and HBeAg level is asso ciated with a higher r ate o f their ser o co nver sio n.ABSTRACTWith the develo pment o f techno lo gy,it is po ssible to quantify HBsAg and HBeAg level.It is a new way to explo r e the HBsAg and HBeAg level and their change patter n to evaluate antivir al ther apy.As a r esult,ther e is a gr o wing need fo r auto mated sample pr o cessing systems to pr o vide accur ate quantificatio n o f HBsAg and HBeAg in clinical pr actice.Cur r ently,ther e ar e two co mmer cialized assays that can measur e the HBsAg quantificatio n,the Ar chitect HBsAg assay(Abbo tt Diagno stics)and the Elecsys HBsAg II assay(Ro che Diagno stics).The Ar chitect HBsAg assay is the mo st widely used assay fo r quantitative measur ement o f HBsAg.The Elecsys HBsAg assay can be utilized to quantify HBsAg thr o ugh a simple dilutio n algo r ithm.Kar sten Wur stho m and Milan J.So nneveld have made co mpar iso ns between Elecsys and Ar chitect Assays.They fo und that the Elecsys assay pr esent a high co r r elatio n with the Ar chitect assay in quantifying HBsAg.But the number o f ser um samples infected with geno types B and C was to o small in their study.So the fir st par t o f my study was to co mpar e the two assays in quantifying HBsAg in ser um infected with geno type B and C.The two assays wer e also used fo r quantifying HBeAg levels,altho ugh ther e is no co mmer cial assay mar keted as HBeAg quantificatio n assay.The Ar chitect HBeAg assay need to use r efer ence standar ds o btained fr o m the Paul Ehr lich Institute(PEI U/ml).While the Elecsys HBeAg assay get quantificatio n thr o ugh a fo r mula pr o vided by the manufactur er.The fo r mula was no t affected by r eagent lo t.We seco ndly aimed to co mpar e the per fo r mance o f the Elecsys and the Ar chitect assays in quantifying HBeAg in patients with CHB.HBV co r e gene is a highly var iable r egio n.Ther e ar e two co mmo n mutatio n sites:G1896A mutatio n and the A1762T/G1764A do uble mutatio n.The G1896A mutatio n can ter minate HBeAg tr anslatio n thr o ugh fo r ming sto p co do n,while A1762T/G1764A mutatio n can r educe ser um HBeAg level o bvio usly thr o ugh do wn-r egulating tr anscr iptio n.Many r esear ch fo vind that a lo wer HBeAg level is asso ciated with a higher r ate o f HBeAg ser o co nver sio n.But we also o bser ved so me CHB patients who maintained HBeAg po sitive with a lo wer HBeAg level.Ther e ar e 硕士学位论文many mechanisms explaining a lo wer HBeAg level.So the thir d par t o f study is to explo r e the r elatio nship amo ng BCP/PC mutatio n,lo w HBeAg level and HBeAg ser o co nver sio n.Objec tive:1.To co mpar e the per fo r mance o f the Elecsys and Ar chitect assays fo r HBsAg and HBeAg quantificatio n acco r ding to geno type and tr eatment status.2.To explo r e the r elatio nship amo ng BCP/PC mutatio n,lo w HBeAg level and HBeAg ser o co nver sio n.Metho ds:1.Quantific atio n o f HBsAg and HBeAg:Co r r el atio n between El ec sys and Ar c hitec t Assays1.1 So ur c e o f sampl es inc l uded in pr esent study:We o btained 1308 ser a o f patients with CHB fr o m Hepato lo gy Unit o f Nanfang ho spital,Guangzho u,China.A to tal o f 1292 ser a with bo th HBeAg and HBsAg po sitive detected by bo th the Ar chitect and the Elecsys assays wer e included in this study.The r emaining 16 samples wer e excluded due to negative HBeAg detected by o ne o r two metho ds.The ser um samples wer e sto r ed at-30 until use.1.2 The Ar c hitec t and the El ec sys assays1.2.1 HBsAg assayThe Ar chitect HBsAg assay is a chemiluminescent micr o par ticle immuno assay fo r quantifying HBsAg in human ser um,while the Elecsys HBsAg II assay is a electr o chemiluminescence immuno assay.The Elecsys HBsAg was used to quantify the HBsAg levels thr o ugh a dilutio n algo r ithm.1.2.2 HBeAg assayBo th the Ar chitect and Elecsys HBeAg assays ar e qualitative tests fo r detecting HBeAg in human ser um and plasma.Ho wever,HBeAg quantitative evaluatio n can be per fo r med using HBeAg Paul-Ehr lich inter natio nal(PEI)r efer ence standar d.1.3 Geno type deter minatio niiiABSTRACTThe HBV geno type was deter mined by dir ect sequencing o f a po r tio n o f the o ver lapping genes enco ding HBsAg and the B and C sub-do mains o f the r ever se tr anscr iptase o f HBV po lymer ase,fo llo wed by phylo genetic analysis.1.4 Statistic al anal ysisCo mpar iso ns between the Ar chitect and the Elecsys assays wer e achieved by plo tting the pair ed o bser ved values expr essed in lo gio units fo r each sample.Bo th HBsAg and HBeAg levels wer e lo gar ithmically tr ansfo r med fo r Pear so ns co r r elatio n analysis.Fur ther mo r e,co nsistency o f the differ ences between the lo gio quantitative values o btained fr o m the Ar chitect and the Elecsys assays was assessed acco r ding to the analysis pr o po sed by Bl and-Altman plo t.Co ntinuo us var iables wer e co mpar ed between gr o ups using the Mann-Whitney test.Statistical significance o f all tests was defined as P 0.05 by 2-tailed tests.Analyses wer e per fo r med using SPSS 18.0 statistical so ftwar e and Gr aphPad pr ism 5.0.2.The r el atio nship amo ng PC/C mutatio n,l o w HBeAg l evel and HBeAg ser o c o nver sio n.2.1 So ur c e o f sampl es:All patients included in this par t wer e fr o m the clinical tr ail o f EFFORT pr o ject suppo r ted by gr ants fr o m Natio nal eleven-five pr o ject o f China.A to tal o f 83 patients fr o m Nangfang ho spital wer e included.2.2 Mutatio n anal ysis:HBV DNA was extr acted fr o m lOOp.1 ser um samples by QIAamp DNA Blo o d Mini Kit.The C r egio n o f HBV was amplified by nest PCR and the pr o ducts o f the seco nd r o und wer e sent to Yinjun Co mpany fo r dir ect sequencing.Maps o f sequencing wer e analyzed by chr o mas so ftwar e.The G1896A mutatio n and the A1762T/G1764A do uble mutatio n was analyzed by Mutatio n sur veyo r 3.0.23 Statistic al anal ysis:Co ntinuo us var iables wer e co mpar ed between gr o ups using the Mann-Whitney test and Kr uskal-Wallis H test.Fisher s exact test was used to co mpar e quantitative data.Statistical significance o f all tests was defined as P 1000:Retest ser um sampl e 1:8(XK)dil utedFinal test r esul t=HBsAg val ue(c.o.i.)Final test r esul t x 8000=HBsAg val ue(c.o.L)Figur e 1-1 Elecsys HBsAg II dilutio n algo r ithm fo r quantitative pr o to co l 图1-1 Elecsys HBsAg II稀释法定量方案（r ef3441）6.加200ul无水乙醇至样品管中，震荡混匀15s,稍微离心。7.混合液转移至QIAamp螺旋住置于2ml收集管上，小心勿沾湿边缘。（加样器 垂直于螺旋柱，将混合液慢慢加至滤膜中间）。关盖，标记，8000r pm离心Imin。再将QIAamp螺旋柱转移至一个清洁的2ml收集管内，弃含滤液的收集管。8.打开QIAamp螺旋柱加入500ul缓冲液AWL 勿沾湿边缘。关盖，8000r mp离 Imino再将QIAamp柱转移至一个清洁的2ml收集管内，弃含滤液的收集管。9.打开QIAamp柱加入500ul缓冲液AW2,勿沾湿边缘。关盖，全速12000r pm 离心3min。10.标记1.5ml离心管,将QIAamp柱置于一个清洁的1.5mlEP管，弃含滤液的 收集管。打开QIAamp柱加入50ul缓冲液AE。室温孵育3min。12000r pm离心 Imino继续下一步实验操作或20保存。1.4.2 PCR 扩增1.4.2.1引物详情14硕士学位论文表11 PCR所用引物Table 1-1 pr imer s fo r po lymer ase chain r eactio n引物名称核甘酸序列序列位点1st5,-AAGCTCTGCTAGATCCCAGAGT-3,nt18-40BS15,-GCGGGGTTTTTCTTGTTGAC-3,nt56-75POL25-CGGGCAACGGGGTAAAGGTTC-3ntl 157-113713205,-TTTCGCTCCAGACCGGCTGC-3,nt 1320-13011.4.2.2第一轮PCR扩增体系及循环参数ddH2OBuffer2PldNTPs2|ilIS10.2R13200.2glExTaqHBV DNA0.2gl2ul总计20gl循环参数：94预变性3min30sec后进入循环：94变性30sec,55退火30sec,72延伸lmin20sec,35个循环后72再延伸7min。1.4.23 第二轮PCR扩增体系及循环参数总计ddH2O33.5glBuffer5gldNTPs5WBS10.5piIPOL20.5贝ExTaq0.5gl第一轮PCR产物5ul50pl第一章雅培与罗氏表面抗原定量方法比较第二轮循环参数：94预变性3min后进入循环：94变性30sec,55退火30sec,72延伸Imin,35个循环后72再延伸7min。1.4.2.4 电泳取第二轮PCR产物3uL另取5 ulDNA Mar ker,用1.5%的琼脂糖凝胶进行 漠化乙锭染色电泳，紫外灯下观察目的片段处的阳性产物。1.4.3 直接测序和基因型分型取扩增成功且目的条带明显的第二轮扩增产物送英骏生物公司测序。直接测 序序列通过chr o mas检测分析峰图，并用 MEGA5.0进行序列比对，后采用与 Gen-Bank报道的A-G基因型别的HBV序列进行同源性比对，用HBV S区做进 化树来进行基因分型。S区核昔酸序列差异4%认定为同一基因型。1.5 质量控制本研究所有PCR反应操作均在PCR室完成。PCR室严格符合国家卫生部临 床检验中心的要求，分为独立的四个操作间:试剂准备间、样本准备间、基因扩 增间、产物检测间。每天坚持室内质量控制。操作过程中严格防止样品间的交叉 污染，每次PCR反应过程均设阴性对照，第一轮的阴性对照与标本一样进行第 二轮巢式PCR扩增，两个阴性对照任何一个出现阳性即视为污染。1.6 统计学方法所有结果在分析前均取10为底的对数值，两种方法的相关性比较使用 SPSS18.0统计软件进行Pear so n相关分析；连续变量的分组比较采用非参数方法 Mann-Whitney；两种方法差异性分析采用 Gr aphpad pr ism5.0 软件 Bland-Altman plo t进行描述。所有分析均采用双侧检验，若PV0.05,则认为有统计学意义。2.结果2.1 样本资料共收集1308例血清样本，纳入1292例两种方法检测表面抗原和E抗原均16硕士学位论文阳性的标本。其中1120(86.69%)为治疗前样本，172(13.31%)例为替比夫定(Telbivudine,LDT)治疗24周样本。根据雅培定量检测方法定量检测表面抗原浓 度分布如图1-2；具体例数及比例见表l-2o(3)U.232 七cpnb 64SQH P W B 2 P W-M jo uorodod 1Distr ibutio n o f HBsAg quantific atio n(l o g 10 IU/m L)Figur e 1-2 The distr ibutio n o f HBsAg qu