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博士学位论文蛋白质组学方法筛选Behcet病患者血清蛋白质标志物蛋白质组学方法筛选Beh cet病患者血清 蛋白质标志物 摘要目的：Beh cet病(BD)是一种以反复发作的葡萄膜炎、口腔溃疡、皮肤损 害、生殖器溃疡等为特征的多系统自身免疫性疾病，具有发作频繁、受累组织广 泛、治疗困难、预后差等特点。BD病在世界各地均有发生，但多发生于远东、中东和地中海沿岸的一些国家。在亚洲国家的患病率为每10万人13.520人。该病多发于青壮年，其引起的葡萄膜炎是我国最常见的葡萄膜炎类型之一。它的 病因和发病机制至今仍不清楚，目前有病毒感染学说、细菌感染学说、自身免疫 学说等多种学说，环境因素和遗传因素也在该病的发生中起重要作用本研究利 用。以BD病患者的血清或血液为材料，筛选其中与健康人表达有差异的蛋白质，将有助于对该疾病发病机制的认识，同时也为该病的临床诊断提供新的依据。近 些年兴起的蛋白质组学方法为标准蛋白的筛选提供了有力工具。方法：收集8例活动期BD病患者和8例健康人的血清，每组按等体积方式 混合为一个血清样本。为尽可能多的检测血清中低丰度的蛋白质，本研究利用亲 和捕获的方法去除血清混合样本中高丰度的白蛋白和免疫球蛋白，并除去血清中 存在的影响后续试验的盐份，然后用双向电泳方法进行蛋白质的分离，凝胶内的 蛋白通过“蓝银”染色法显色，利用图像分析软件，经定量比较筛选出在患者和 健康人血清双向电泳图谱中表达存在显著差异的蛋白斑点。差异蛋白斑点经基质 辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)进行鉴定。本研究另外 收集了 18例活动期BD病患者、6例静止期BD病患者、22例活动期VKH综合征患者和20例健康志愿者的血清用 Westemblo t和ELIS A方法验证蛋白质组学 的结果，同时评价差异表达蛋白在BD病患者血清中表达的相对特异性及其与 BD病活动性的关系。结果：(1)BD病患者与健康人血清双向电泳差异蛋白斑点的获取。经过预处理后，血清双向电泳图谱中约检测到800个蛋白质斑点。这些蛋白 斑点经定量比较共筛选出6个蛋白斑点在BD病患者和健康人血清中表达存在显 著差异，其中5个蛋白斑点在BD病患者血清内表达上调，1个蛋白斑点在患者 血清中表达下调。(2)差异蛋白斑点的质谱鉴定。6个差异蛋白斑点经MALDI-TOF-TOF质谱分析共鉴定出4种蛋白，分别是 结合珠蛋白(Hp)、血清淀粉样蛋白A(S AA)、维生素D结合蛋白(DBP)和 载脂蛋白E(APOE),其中DBP在BD病患者血清中表达下调。(3)Hp 和 S AA 的 Westemblo t 验证。对在活动期BD病患者血清中表达上调的Hp和S AA用 Westemblo t方法进 行验证，同时评价两种蛋白在BD病患者血清中表达的相对特异性。结果显示，Hp在活动期BD病、活动期VKH综合征患者和健康人血清中都有表达，在活动 期BD病患者血清中的表达显著高于活动期VKH综合征患者和健康人，但个体 差异较大，表达量平均约高出2倍；Hp在VKH综合征患者和健康人血清中的 表达没有显著差异。S AA在活动期BD病患者血清中表达显著高于活动期VKH 综合征患者和健康人，有72.2%的活动期BD病患者血清中可检测到显著的免疫 反应条带，而只有10.0%的活动期VKH综合征患者和9.1%的健康人血清中可 检测到较弱的免疫反应条带。(4)Hp 的 ELIS A 验证。由于Hp在BD病患者和健康人血清中表达的个体差异大，本研究用ELIS A 方法对Hp的表达情况作进一步验证，同时评价Hp表达与BD病活动性的关系，结果证明Hp在活动期BD病患者(3.66 2.21 mg/mL,p=0.000)血清中表达显著高 于静止期BD病患者(0.95 土 0.76 mg/mL,p=0.000)、活动期VKH综合征患者(0.80 士 0.73 mg/mL,p=0.000)和健康人(1.09 士 0.84 mg/mL,片0.000)。ELIS A 的结果与11蛋白质组学和Westemblo t的结果相一致。结论：本研究进一步证实蛋白质组学技术是筛选疾病血清标志物的有力工 具。通过双向电泳联合质谱的方法，我们发现Hp、S AA和APOE在BD病患者 血清中表达上调，DBP在患者血清中表达下调。这些差异表达蛋白可能参与了 BD病的发生和发展。关键词：Beh cet病；血清；Hp；S AA；VKH综合征inS creening serum bio markers fo r Beh cet5s disease by pro teo mics tech niques ABSTRACTPURPOSE:Beh cets disease(BD)is a multisystem inflammato ry disease ch aracterized by recurrent uveitis,o ral aph th ae,genital ulcers and eryth ema no do sum.Th e prevalence in Asian co untries ranges fro m 13.5 to 20 cases per 100,000.Its etio lo gy and path o genesis are still unkno wn.Genetic facto rs are th o ugh t to play an impo rtant ro le in th e path o genesis,wh ile enviro nmental facto rs as well as viral and bacterial infectio ns may also be invo lved.Previo us studies h ave suggested th at an auto immune respo nse is invo lved in its path o genesis.Th e diagno sis o f th is disease is mainly based o n th e clinical manifestatio ns,and to date no discriminato ry labo rato ry tests are available.S earch ing fo r pro teins specifically expressed in serum o r o n/in blo o d cells fro m BD patients,will greatly co ntribute to o ur understanding o f its path o genesis and diagno sis.METHODS:To screen aberrant serum pro teins in BD,serum samples were o btained fro m eigh t male BD patients with active uveitis and eigh t male h ealth y vo lunteers with info rmed co nsent.Th e serum samples fro m active BD patients and no rmal co ntro ls were po o led.High ly abundant serum pro teins(albumin and IgG)were depleted fro m th ese two samples using an affinity capture based kit.Th e o btained samples were subjected to two-dimensio nal gel electro ph o resis(2-DE).Pro tein spo ts were visualized with th e“blue silver“staining.Differently expressed pro teins were subsequently identified by Matrix-assisted laser deso rptio n/io nizatio n tandem IVtime-o f-fligh t mass spectro metry(MALDI-TOF/TOF-MS).Western blo t and enzyme-linked immuno so rbent assay(ELIS A)were perfo rmed using th e serum samples fro m 18 patients with active BD,6 patients with inactive BD,22 patients with Vo gt-Ko yanagi-Harada(VKH)syndro me and 20 h ealth y vo lunteers to validate th e results o f 2-DE and MS.RESULTS:(1)S creening differently expressed pro teins fro m BD patient9s serumPro teo mic pro files o f th e po o led samples were co mpared and appro ximately 800 pro tein spo ts were o bserved in each o f th e gels.Expressio n levels o f five o f th e pro tein spo ts in active BD were significantly h igh er th an th o se in no rmal co ntro lst and o ne pro tein spo t in active BD patients was significantly lo wer th an th at in no rmal co ntro ls.(2)MS identificatio n o f differently expressed pro teinsMass spectro metric pro tein identificatio n revealed th at th e six pro tein spo ts co rrespo nded to fo ur pro teins:h apto glo bin(Hp)，serum amylo id A(S AA),vitamin D binding pro tein(DBP)and apo lipo pro tein E(APOE).(3)Westemblo t validatio n o f Hp and S AAWestern blo t sh o wed th at Hp was o nly o ver-expressed in active BD but no t in inactive BD,VKH syndro me o r h ealth y co ntro ls.An o bvio us band o f S AA was detected in 72.2%o f th e serum samples fro m BD patients,wh ereas a vague band o f th is pro tein was fo und in 10.0%o f th e tested no rmal samples and 9.1%o f VKH samples.(4)ELIS A validatio n o fHpAs expressio n levels o f Hp in westemblo t sh o wed a relatively large individual variatio n and o nly a 2-fbld increase in active BD patients,ELIS A was used fo r furth er validatio n.Th e ELIS A result reco nfirmed th e result o f th e Western blo t.Th e serum level o f Hp in th e active BD patients(3.66 土 2.21 mg/mL)was significantly h igh er th an th at in inactive BD patients(0.95 士 0.76 mg/mL,夕=0.000),VKH patients(0.80 土 0.73 mg/mL,夕=0.000)and no rmal co ntro ls(1.09 土 0.84 mg/mL,夕=0.000).Th ere was no difference co ncerning serum Hp level amo ng no rmal co ntro ls,inactive BD patients vand VKH patients.CONCLUSIONS:Our study furth er validated th at th e pro teo mics tech niques are po werful to o ls fo r screening pro tein bio markers fro m patients serum.Our results revealed a significantly increased expressio n o f Hp,S AA and APOE,and a significantly lo wered level o f DBP in serum o f active BD patients.Th ese fo ur pro teins may be invo lved in th e develo pment o f BD.Key words:Beh cefs disease；S erum；Hp；S AA；VKH syndro meVI英文缩写词汇表(Table of English Abbreviation)缩略词英文全称pliso electric po intMWmass weigh tTrisTris(h ydro xymeth ye)amino meth aneTEMEDNN-tetrameth yleth ylene-diaminePBSPh o sph ate buffered salineS DSDo dium do decyl sulfatekD(Da)kilo Dalto n(Dalto n)IFFiso electric fo cusing3-(3-ch o Iamido pro pyl)dimeth ylammo nio-l-Pro panCHAPSesulfenateAPammo nium persulfatePAGEpo lyacrylamide gel electro ph o resisIPGimmo bilized pH gradientIAAio do acetamideES Ielectro spray io nizatio nEDTAeth ylenediamine tetraacetic acidDTTdith io th reito l2-DEtwo-dimensio nal electro ph o resisddH2Odo uble distilled waterBS ABo vine S erum AlbuminBisN,N-Meth ylene-bis-(acrylamide)minminute中文全称等电点分子量三羟甲基氨基甲烷四甲基乙二胺磷酸盐缓冲液十二烷基硫酸钠千道尔顿（道尔顿）等电聚焦3（3胆酰胺丙基）二乙胺丙磺酸过硫酸胺聚丙烯酰胺凝胶电泳固相pH梯度碘乙酰胺电喷雾离子化乙二胺四乙酸二硫苏糖醇双向电泳双蒸水牛血清白蛋白甲又双丙烯酰胺分钟46类结合u Lmicro liter微升gO g)gram(micro gram)克（微克）HpHapto glo bin结合珠蛋白S AAS erum amylo id A血清淀粉样蛋白AVKHVbgt-Ko yanagi-Harada syndro meVbgt-小柳原田综合征ILinterleukin白细胞介素ELIS Aenzyme-linked immuno so rbent assays酶联免疫吸附实验IFNinterfero n干扰素MSMass spectro metry质谱ThT h elper辅助T细胞Igimmuno glo bul in免疫球蛋白TNFtumo r necro sis facto r肿瘤坏死因子S LEsystemic lupus eryth emato sus系统性红斑狼疮ACNaceto nitrile乙礴TFAtri fluo ro acetic acid三氟乙酸光感受器间维生物AIRBPInterph o to recepto r retino id-binding pro tein蛋白MAFmacro ph age-pro activating facto r巨噬细胞活化因子BDBeh cet,s disease白塞病47蛋白质组学方法筛选Beh cet病患者血清 蛋白质标志物引 言BD病是一种以反复发作的葡萄膜炎、口腔溃疡、多形性皮肤损害、生殖器 溃疡等为特征的多系统、多器官受累的疾病，具有发作频繁、受累组织广泛、治 疗困难、预后差等特点。BD病在世界各地均有发生，但多发生于古丝绸之路沿 途的一些国家，故被称为“丝绸之路病九 该病的发生有明显的种族差异，在中 国、日本、土耳其以及中东人群中发病率较高，在白人中发病率较低，在黑人中 几乎不发病。在亚洲国家的患病率为每10万人13.520人1。该病可发生于任 何年龄，但多见于2045岁的青壮年。此病引起的葡萄膜炎是我国最常见的葡萄 膜炎类型之一。BD病的病因和发病机制尚不完全清楚，目前有病毒感染学说、细菌感染学 说、自身免疫学说等多种学说，环境因素和遗传因素也在该病的发生中起重要作 用口-5。已发现眼组织中存在多种致葡萄膜炎的抗原如视网膜S抗原6,硒结 合蛋白7,光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)6,8,9等，对这些抗原的 自身反应性CD4+T细胞的产生、活化及持续增殖是葡萄膜炎发生的主要原因；BD病患者淋巴细胞Fas、FasL表达不平衡，此种不平衡导致二者不能有效作用，因而不能发生细胞凋亡，这些细胞的长期存在是人类葡萄膜炎复发和慢性化的基 础10,11。通过对转录因子T-bet的研究发现葡萄膜炎是Th l细胞介导的疾病 12,但是有关引起自身反应性Th l细胞激活的始动因素、患者体内调节性T(Treg)细胞的功能紊乱、Th l/Th 2细胞的平衡紊乱以及免疫抑制剂对它们有何 影响等均不清楚。最近的研究提示新发现的Th l7细胞在BD病发生中发挥重要 作用13BD 病患者血清中 IFN-Y、IL-6、IL-12、IL-17、IL-1814以及瘦素15-18 等因子的表达显著高于健康人。遗传学研究表明，BD病与HLA-B5、HLA-B51 抗原19密切相关。以上研究都增进了我们对BD病的发病机制的认识，但依然不能从根本上阐明该病发生的确切机制。以BD病患者的血清或血液为材料，筛 选其中与健康人表达有差异的蛋白质，将有助于对该疾病发病机制的认识，同时 也为该病的临床诊断提供新的依据。近些年兴起的蛋白质组学方法为标准蛋白的 筛选提供了有力工具。蛋白质组学已成为后基因组时代生物学研究新的热点，其定义为：研究一个 细胞、组织或完整机体在某一特定时间、空间条件下全部蛋白质的表达及其相互 作用方式。其特点是采用高分辨率的蛋白分离手段和高通量的蛋白鉴定技术，全 景式地研究各种特定情况下的蛋白表达谱。蛋白质组学的研究主要有两种策略。一种为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多的 蛋白质。但蛋白质的表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有蛋白是一 个难以实现的目标。另一种为“功能法”，即研究不用时期细胞蛋白质组成的变 化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。蛋白质组学研究内容主要包括蛋白质鉴定、蛋白质翻译后修饰、蛋白质功能的确 定、蛋白质组学的临床应用研究以及蛋白质相关的生物信息学研究。不断发展、完善的蛋白质组学技术正逐渐成为现代生物医学研究新的强有力的工具。蛋白质组学在临床上已经得到越来越广泛的应用，主要用于诊断、指导治疗、提供药物开发的临床依据以及预后判断。蛋白质组学相关技术已被用于类风湿性 关节炎20-30、系统性红斑狼疮31,32、多发性硬化23,33.38、自身免疫性肝 炎39、干燥综合征40以及炎性肠病41等自身免疫病的研究。在葡萄膜炎的研 究中，学者们发现视黄醛结合蛋白42和0B1 晶体蛋白43是可导致葡萄膜炎的 自身抗原。Bah k等内毒素诱导的葡萄膜炎大鼠玻璃中发现一组晶体蛋白，认为 它们可能与葡萄膜炎的发生有关44。在BD病的研究中，目前发现有3种视网 膜内自身抗原可能参与了眼内炎症的发生，分别是视网膜S抗原、a-烯醇酶和 硒结合蛋白7,45,46。韩国学者用双向电泳方法发现9种蛋白在BD病患者和健 康人血清中表达存在差异，但没有做进一步研究47。本课题利用蛋白质组学中双向电泳一质谱技术(2-DE-MS)筛选BD病相关 血清标志蛋白，为探讨BD病的发生机制和临床诊断策略提供新思路。血清的双 向电泳一直存在很多困难，最主要的有两个：一是血清中蛋白丰度的巨大差异，可达10”数量级。如白蛋白和免疫球蛋白两种蛋白就占血清蛋白总量的60972%,而潜在可作为疾病相关标志物的蛋白说占比例不足高丰度蛋白的 存在不仅限制了双向电泳的上样量，而且遮盖了电泳图谱中高丰度蛋白附近的低 丰度蛋白。有效去除血清中的高丰度蛋白是对血清进行双向电泳一质谱分析的关 键。但白蛋白和免疫球蛋白同时又是多种蛋白在血液中运输的载体49-51,为尽 可能在去除高丰度蛋白的同时保留与其结合的低丰度蛋白，我们在去除白蛋白和 免疫球蛋白之前，我们对血清样本进行了超声处理52。最后对样品进行脱款处 理以减少图谱中的水平条纹。血清双向电泳一质谱分析的另一个困难是血清样品 的个体差异大，受干扰因素多。本研究采用预先混合同组血清的方法，既避免了 图像分析的难度和工作量，又保证了组间差异的可靠性，最后再采用免疫印迹对 筛选出的蛋白标记作进一步的验证以保证结果的可靠性。本研究以BD病患者血清为研究对象，通过双向电泳一质谱技术筛选并鉴定 出了 BD病患者血清中与健康人表达有差异的蛋白，然后用 Westernblo t和ELIS A 方法对差异表达蛋白进行验证，实验流程如图1所示。结果确定了在BD病患者 血清中表达显著高于健康人的蛋白，为探讨BD病的发病机制及其临床诊断和治 疗策略寻找新的突破口，同时也为葡萄膜炎以及其他的自身免疫病发病机制的研 究提供新的依据。图1本课题研究的实验流程3材料与方法1试剂及其配制1-1主要试剂1 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1,30%)、1.5MTris-HCl3H8.8)、过硫酸钱(APS)、TEMED 二硫苏糖醇(DTT)、CHAPS、尿素、IPG 缓冲液、IPG 干 胶条(pH3-10NL)、IPG覆盖油、蛋白质定量试剂盒(Pro tein Assay Ki。、PVDF 膜购自 Bio-Rad(Hercules,CA)公司，2 硫眼、甘油、白蛋白球蛋白去除试剂盒(Pro teo Prep Blue albumin and IgG depletio n kit)购自 S igma 公司，3 十二烷基硫酸钠(S DS)、碘乙酰钱(IAA)、低熔点琼脂糖、高熔点琼脂糖、脱脂奶粉、考马斯亮蓝R-250和G250购自广州威佳公司，4测序级胰蛋白酶购自Ro ch e公司，5 鼠抗人Hp单克隆抗体，HRP标记的羊抗人Hp多克隆抗体和鼠抗人S AA 单克隆抗体购自Abeam公司，6 HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自Cell S ignaling公司，7 ECL发光试剂盒购自Pierce公司，8 人Hp蛋白标准品购自AbD sero tec公司,9 PMS F、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物，10蛋白质分子量标准购自北京鼎国生物，11乙礴购自Merck公司，12浓硫酸、冰乙酸、无水乙醇、无水甲醇由广州天晋公司提供。1.2主要试剂的配制1 磷酸盐缓冲液(ph o sph ate-buffbr saline,PBS)NaCl 8.00 gKC1 0.20 g4Na2HPO4*12H2O 3.58 gKH2PO4 0.20 g加去离子水至1000 mL,调pH值至727.4,保存于4冰箱。2 0.5 M Tris-HCl(pH 6.8)3.0g Tris溶于离子水，调pH至6.8,然后定容到50mL,保存于4冰箱。3 10%S DS 溶液1.0g S DS溶于去离子水，定容至10mL,常温保存。4 10%APS1.0g APS溶于去离子水，定容至10mL,没600L分装保存于-20冰箱。5 lOxS DS电泳缓冲液Tris 30gGlycine 144gS DS 10g加去离子水溶解后定容至1000mL o6 5x上样缓冲液0.5 M TrisHC1 0.2mL甘油 0.2mL10%S DS 0.4mLB-疏基乙醇 0.1mL去离子水 0.1mL7 10 x电转缓冲液Tris 30gGlycine 144g溶于去离子水后定容至1000mL,用时取10mL加去离子水至800mL,然 后加200mL甲醇。8 IOxTBS缓冲液Tris 24.2gNaCl 80.0g溶于去离子水，调pH7.27.4,用去离子水定容至1000mL,保存于4冰5箱，用时取50mL,去离子水稀释至500mL,然后加1 500u LTween-20。9胶体考染染液CCBG250 1.2gH3PO4 100mL(NH4)2S O4 100 g甲醇 200 mL加去离子水至1000 mL,常温放置。10 S DS-PAGE凝胶配方见表1表1 S DS-PAGE凝胶配方15%(6mL)12%(6mL)10%(6mL)5%(2.5mL)h2o1.081.682.081.530%Acr/Bis3.02.420.42Tris-HCl(pH8.8)1.561.561.56Tris-HCl(pH6.8)0.31S DS(10%)0.060.060.060.025AP(10%)0.060.060.060.025TEMED2.4 jh L2.4 u L2.4 u L2.5 u L11 PVDF膜抗体洗脱液100 mM 二筑基乙醇，2%S DS,62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)012封闭液5%脱脂奶粉溶于TBS中。13 lOmMPMS F 存储液8.7mg PMS F溶于5mL异丙醇，分装-20保存。14细胞裂解液8M 尿素，2M 硫胭，4%CHAPS,20mM Trisbase,30 mM DTT,l%pH310的IPG 缓冲液。分装成0.6mL/管置-20储存。15 1MDTT 储液：lOOmg溶于0.65mL dd HzO,分装-20冰箱保存。16胶条水化液68M 尿素，2M 硫胭，lOmM DTT,2%CHAPS,0.5%pH31OIPG 缓冲液，0.002%澳酚蓝储液。分装成1mL/管，置-20储存。17胶条平衡缓冲液母液L5MTris-HCl 6.7 mL,尿素 72g,甘油 63 mL,S DS 4g,力口 120 mL ddHO 置33水浴中使尿素完全溶解，后加400HL溪酚蓝，用ddHzO定容到 200 mL,分装成8 mL/管，置-20储存。2主要仪器1 等电聚焦仪，Bio-Rad公司，美国2 Pro tein II XL垂直板电泳系统，Bio-Rad公司，美国3 Ch emiDo c XRS凝胶成像系统，Bio-Rad公司，美国4 Mini Pro tein 3垂直板电转系统，Bid-Rad公司，美国5 酶标仪，Bio-tek公司，美国6冷却循环水浴系统，Bio-Rad公司，美国7 高速低温离心机，Heraeus Bio fuge 22R 3,美国8 常温离心机，Eppendo rf公司，美国9 电泳仪及电泳槽，北京六一仪器厂10 图像扫描仪，GE公司，美国11 超纯水系统，Millpo re公司，德国12 涡旋机，Eppendo rf公司，美国13 ImageMaster 2D Elite 5.0图像分析软件，GE公司，美国3实验方法3.1血清标本的收集收集18例活动期BD病患者、6例静止期BD病患者、22例VKH病患者 和20例健康人的血清（表2）。活动期的疾病患者没有接受免疫抑制剂的治疗。BD病53和VKH综合征54的诊断分别依据国际BD病研究组和国际命名法委 员会所制定的标准。活动期BD病和VKH综合征患者采血时均表现为活动性葡萄 7膜炎，并且近期(1周以内)未使用过强的松、地塞米松等激素及免疫抑制剂。血清都是在患者和健康志愿者知情的情况下收集，所有处理过程都符合中山大学 中山眼科中心实验研究监察委员会的要求。抽取病人或健康人的空腹静脉血5mL,室温放置lh,3000g离心lOmin,收 集血清，分装-80保存备用。表2本研究中患者和健康人信息2DEWestern blo tELIS ANCa)BDNCa)BDb)VKHc)NCBD(active)BD(inactive)VKHnum.882018222015620gender(male/female)8/08/011/916/216/611/913/26/014/6Age(iS D)29.833.332.434.336.231.533.338.336.9(8.1)(6.9)(9.3)(6.5)(11.7)(8.3)(6.5)(7.7)(i10.7)Hp(mg/mL)d)/1.090.843.66 2.210.95士0.760.80 士0.73a)健康人b)Beh cet病患者c)VKH综合征患者d)ELIS A测得的Hp在患者和健康人血清中的浓度3.2血清标本处理1 同组取8例血清样品每份取30 UL,涡旋混合均匀，每50UL分装保存于-80冰箱。2 超声处理：每组取30uL混合血清，用白蛋白球蛋白去除试剂盒中的平衡 液稀释至200口 L,间断超声处理4次，每次15秒，控制超声功率为15W,超声间隙冰浴。3 白蛋白球蛋白去除：根据试剂盒说明书操作。A,将亲和柱置于配备的2mL离心管内；B,吸取400 HL亲和基质置于亲和柱内；8C,10 OOOrpm 离心 lOsec；D,加400 u L平衡液于亲和柱内；E,10 OOOrpm 离心 10 sec；F,重复操作D和E步骤一次，预平衡亲和柱；G,加超声处理后的混合血清于亲和柱内；H,室温孵育1。min；I,10 OOOrpm 离心 60sec；J,将离心洗脱液重新加回亲和柱内；K,室温孵育10 min；L,10 OOOrpm 离心 60sec；M,加lOOuL平衡液于亲和柱内；N,10 OOOrpm 离心 60sec；0,丢弃亲和柱；P,将洗脱液移至2mL离心管内进行除盐处理；4血清蛋白的除盐：A,将装有去除了白蛋白球蛋白的血清的2mL离心管置冰浴内;B,加450 uL沉淀剂；C,振荡混匀；D,在冰浴中孵育15min；E,力口 150 2L共沉淀剂；F,振荡混匀；G,8000 rpm 离心 10min；H,尽可能除尽上清；L再离心2min；J,尽可能除尽上清；K,加沉淀体积4倍的共沉淀剂；L,离心5min,弃洗液；M,取100 口 L预冷的超纯水覆盖沉淀；N,振荡，沉淀粉碎但不溶解；9O,力口 1mL 预冷的 wash buffer；P,力口 5 口 L wash additive 液；Q,振荡使沉淀溶解；R,-20孵育过夜；S,8000 rpm 离心 10 min；T,小心除去上清；U,使沉淀在空气中干燥5 min；V,加裂解液溶解沉淀，振荡30sec；W,室温孵育或者振荡促溶；X,8000rpm 离心 lOmin；Y,取上清，分装保存于-80冰箱。3.3 蛋白定量:Lowry法按表3配制BS A系列标准液及样品管。表3 Lo wry法蛋白定量方法管号样品加样体积 M)PBSReagent A(mL)Reagent B(mL)0BS A标准品01000.541BS A标准品15850.542BS A标准品30700.543BS A标准品45550.544BS A标准品60400.545BS A标准品75250.546待测样品4960.541 准备工作试剂和标准品，每1mL试剂A中加20gL试剂S作为工作试 齐IJAL BS A标准品浓度为1.48jig/NL；2 按表3所示剂量稀释BS A标准品和待测样本，总体积lOOL；3 每样本加500lL试剂A9；4 每样本加4mL试剂B；5 750nm测吸光值；106 根据吸光值和蛋白浓度的线性关系计算待测样本浓度。3.4 双向电泳3.4.1 第一向等电聚焦A,取-20冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT,不含Bio-Lyte）一管（600U L/管），置室温解冻；B,取-20。冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7非线性干胶条），室温中放 置10分钟解冻；C,在600 HL水化上样缓冲液中加入0.006g DTT,涡旋振荡使其溶解；D,力口 Bio-Lyte3-10两性电解质3uL,充分混匀；E,取出适量水化上样缓冲液与蛋白样品混合，使终体积为32OUL,涡旋使其充 分混匀；F,沿着水化盘中槽的边缘从左至右线性加入样品；G,在水化槽两端各空出2cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯，不要产 生气泡；H,当所有的蛋白质样品都已经加入到水化盘中后，用银子轻轻的去除预制IPG 胶条上的保护层；I，用镇子夹紧胶条，使胶面朝下；J,分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条置于水化盘中样品溶液上；K,室温静置lh;L,在胶条上覆盖2mL矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发，需缓慢的加 入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上；室温静置 18h；M,加盐桥。取一片电极滤纸，加7uL去离子水，放于正极端；再取一片电极滤纸，加5u L去离子水和5uL 1%DTT,放于负极端；N,准备一张湿润的滤纸；O,用镜子将胶条夹出，用滤纸吸干胶条上的矿物油；P,将胶条放到聚焦槽内电极滤纸上，对好正、负极，加1.5mL矿物油；11Q,用镜子触动电极部位确保接触良好，并排除电极附近的气泡，盖上聚焦仪的 盖子；R,设置等电聚焦程序；S,聚焦结束后，最好立即进行平衡、第二向S DS-PAGE电泳，否则将胶条置于 样品水化盘中，-20冰箱保存。3.4.2 第二向 SDS-PAGE 电泳A,配制12%的丙烯酰胺凝胶。配制80mL凝胶溶液，每块凝胶40mL,将溶液 分别注入玻璃板夹层中，上部留0.5cm的空间，用水饱和正丁醇封面，保持 胶面平整；B,室温下，使凝胶聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基 本聚合；C,待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的水饱和正丁醇，用去离子水冲洗胶面，并 用S DS电泳缓冲液浸泡；D,从-20冰箱中取出等点聚焦后的胶条，先于室温放置10分钟，使其解冻；E,配制胶条平衡缓冲液L 5mL平衡母液，加O.lgDTT；F,在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，吸去 矿物油；G,将另一份厚滤纸用水浸湿，挤去多余水分，然后直接