全血microRNA提取试剂盒.doc

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◆ TRIpure Reagent 抽提指南
◆ 目录号 RP02
◆ 使用手册
◆ 实验室使用，仅用于体外
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使用说明

◆ BLOODmisi
全血（液体样本)microRNA快速提取试剂盒
◆ 目录号 1124
◆ 使用手册
◆ 实验室使用，仅用于体外

BLOODmisi 全血（液体样本）microRNA快速提取试剂盒
目录号：1124
目录编号
包装单位
112401
50次

v 适用范围：
适用于快速提取各种全血/血浆/液体样本miRNA和其它各种小RNA
v 试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成
保存
50次
Lysis buffer
4°C避光
50 ml
70％乙醇
室温
9ml RNase—free H2O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
Wash Solution 1
室温
12 ml
第一次使用前加入28ml无水乙醇
Wash Solution 2/3
室温
10 ml
第一次使用前加入42ml无水乙醇
RNase—free H2O
室温
10 ml
吸附柱RA和收集管
室温
50套
microRNA吸附柱MA
和收集管
室温
50套
本试剂盒按照指示储存6个月不影响使用效果。

储存事项:
1. Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后,可以在常温保存一个月，如果要更长时间保存，请存放在4°C，但是使用前，应该先回复到室温。
2. Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体,吸上清使用就可以
3. 运输在常温下进行，不影响使用效果。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v 产品介绍：
近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA(包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA,对于血液样本更是由于其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解全血(液体样本）和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除， 最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

v 产品特点：
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好.克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
3. 独有的裂解液配方，可直接裂解全血,不需要先裂解去除红细胞。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1。9～2。0，基本无DNA残留，可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

v 注意事项:
1. 第一次使用前请先在70％乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！
2. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3. 需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器,研钵。
4. Lysis buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服.若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 预防RNase 污染应注意以下几方面：
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解.但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4) 配制溶液应使用无RNase 的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v）,37℃放置过夜，高压灭菌。)
6. RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0。5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟）检测完整性。由于细胞中70％-80％的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb,分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标.高质量的RNA,OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7。5）在1.8—2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2。1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1。5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度（ng/μl）= （OD260)×(稀释倍数n）×40。

v 操作步骤：(实验前请先阅读注意事项）
ð 提示：一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇！
1. 每0。25ml液体样品（血清，血浆，脑脊液等等)加入0。75ml Lysis buffer，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0。75ml Lysis buffer。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。Lysis buffer和液体样品的终体积比总是3:1.
2. 将样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解.
3. 每0.75ml Lysis buffer加0.2 ml氯仿,剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。
4. 于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis buffer体积的70%。
5. 小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇(必须是室温的），涡旋混匀.此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。
6. 将混合物（每次小于700μl,多可以分两次加入）加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中）12，000 rpm离心30—60秒,弃掉废液.
7. 加700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
8. 加入500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇！），12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500μl Wash Solution 2/3，重复一遍。
9. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10. 取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水浴中预热效果更好 室温放置1分钟，12，000 rpm 离心1分钟.
11. 如果预期RNA产量〉30μg,加30—50μl RNase free water重复步骤11, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要RNA浓度高）。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1 5–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。
附：microRNA富集方法（仅仅提取microRNA，不包含〉200 nt其它总RNA成份。）
1. 按照前面标准操作步骤1－5操作，直到得到上清。
2. 较精确估计上清体积，加入等体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!）（必须是室温的）,涡旋或者吹打充分混匀，不要离心.
3. 将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，收集滤过物.将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物,离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积.
此时，滤过物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤8－11操作漂洗,洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。
4. 较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇(必须是室温的)，涡旋或者吹打充分混匀，不要离心.
5. 取一套新的microRNA吸附柱MA， 将上一步骤混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入）加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。
6. 按照前面标准操作步骤8－11操作漂洗,洗脱得到富集的microRNA。
注意:不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。

完