SARS病毒研究应用概述.doc

SARS冠状病毒研究概述摘要：本文分为两个某些，第一某些是对SARS冠状病毒在分类学、形态学以分子遗传机制进行一种总体简介，第二某些是针对SARS治疗以及抗SARS病毒新药研究思路来进行阐述。核心词：SARS 冠状病毒 治疗 新药研究思路自11月中旬以来，严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory syndrome，SARS）一方面出当前中华人民共和国广东省，接着在中华人民共和国香港、台湾、加拿大、新加坡、美国和欧洲相继浮现，以至演变为一场席卷全球风暴。这场风暴给整个社会带来了巨大冲击力，同步给全球经济带来了严重损失。人们和SARS打起了一场看不到硝烟战争。在1980年，科学家用了两年时间发现AIDS病原是HIV，在，WHO成立了一种由全球10个国家和地区13个实验室构成合伙研究网络，在两个星期后正式宣布一种此前未知冠状病毒，为引起严重急性呼吸综合症病原体，并命名为SARS冠状病毒。继SARS病毒分离成功和病毒全基因组测序成功之后，科学家们对SARS研究重要环绕如下几种方面：用生物信息学办法对SARS 冠状病毒基因组进行诠释，SARS诊断和SARS病毒疫苗研制，寻找抗SARS药物。下面对研究状况进行概述。1 SARS病毒概述1.1 SARS病毒分类学地位SARS 冠状病毒(SARS-Cov)，属于巢状病毒目(Order：Nidovirales),冠病毒科(Family：Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus：Coronavirus)。依照其基因组构造分类，它属于单链正义RNA 病毒，病毒基因组约为30Kb，是所有RNA病毒中最大基因组。在SARS病毒此前，人类共发现了大概15种不同冠状病毒。这些已知冠状病毒，依照血清学证据和种属发生学规律，分为3 个Group。其中Group1来自牛等动物，Group2涉及猪、老鼠等哺乳动物冠状病毒，Group3仅有鸟感染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。5月，The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronvirus和Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory刊登在Science上，两篇文章共同点都是通过对SARS冠状病毒全基因组完整测序，来对SARS病毒基因组注释。文章作者都以为它基因组构造和其她3个种群冠状病毒有一定有关性，但是，通过比较遗传史和序列比对表白SARScov特性和已知三类冠状病毒特性并不完全相似，涉及两种人类病毒HCoV-OC43和HCoV-229E在内几种冠状病毒中任何一种，它不但表既有其她冠状病毒共有特性，尚有SARSCoV自身特有特性，因而以为新病毒构成了冠状病毒第4个株系（第4组），是一种新冠状病毒，从而形成一种独特group(Paul& Marco,)。同样，刊登在New England Medicine两篇文章也支持了这个观点，在已知基因片段中，它和已知冠状病毒核酸水平同源性不超过50，而氨基酸水平同源性在75左右；在进化树分析中，与已知冠状病毒距离很远(Drosten & Ksiazek,)，因而以为这是一种全新冠状病毒。下图为SARS冠状病毒与其她冠状病毒种系进化关系图：图1：种系发生关系图（from Microbiology & Immunology）1.2 SARS冠状病毒形态与构造病人样本和培养细胞上清负染透射电镜扫描显示了多晶体、密封冠状病毒颗粒，其直径在60-130nm之间。大某些但并非所有病毒颗粒显示出这种特性性表面喷射状，酷似中世纪欧洲帝王王冠(crown)构造，由此而产生了该病毒名字，正是其“名字” Coronavirus 来源（corona在拉丁语中=冠状）。下面是冠状病毒构造图。图2：冠状病毒构造图(from Kathryn V.,Holmes，)如上图所示，已知冠状病毒粒子包膜上重要有三种糖蛋白：S蛋白、E蛋白和M蛋白。纤突为蛋白（Spike protein）,呈“棒棒糖”状膜蛋白，由两个domain构成，接近N端某些形成一种球状domain，接近C端某些形成一种穿膜棒状构造。对已知冠状病毒研究已经证明，Spike protein和冠状病毒侵入细胞过程密切有关。M蛋白(Membrane protein)是一种跨膜糖蛋白,其大某些位于包膜内,仅有糖基化小某些暴露在双层脂质外面,在病毒包膜形成与出芽（budding）过程中起重要作用。E蛋白（Envelope protein）是一种相对较小蛋白，散布在包膜上。某些冠状病毒有HE蛋白（Haemagglutininesterase），但是SARS冠状病毒是没有HE蛋白。N蛋白（Nucleocapsid phosphoprotein）是冠状病毒中一种重要构造蛋白，它与病毒正股RNA紧密结合,构成病毒核心,核心呈螺旋式构造。它具有其他冠状病毒N蛋白中不存在核转移信号序列，研究推测SARS病毒在侵入宿主细胞后来是通过这个核转移信号序列进入到细胞核中，并与宿主DNA发挥其生物学作用（Marco et al，）。下面分别是用Vero E6分离出来SARS冠状病毒电鏡照片和它模式图。 图3：SARS病毒电鏡照片（from Thomas et al，） 图4：模式图（from Oxford et al，）1.3 SARS冠状病毒分子遗传机制冠状病毒宿主只限于脊椎动物，涉及哺乳动物和鸟类，它与人类和家禽一系列疾病有关，涉及呼吸道、胃肠道、中枢神经系统和肝方面疾病。然而，动物冠状病毒也许在动物引起严重疾病，例如鸟传染性支气管炎病毒（IBV），鼠肝炎病毒（MHV），猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus）等等（Luis，），人冠状病毒此前只与轻度疾病有关。在第1组（HcoV-229E）和第2组（HcoV-OC43）中都能找到人冠状病毒（HCoVs），它是轻度呼吸疾病一种重要因素（Makela，1998）。它们能偶尔地引起小孩和成人严重下呼吸道感染及新生儿坏死性小肠结肠炎，SARS冠状病毒似乎是可以引起人类严重疾病第一种冠状病毒。冠状病毒是在宿主细胞细胞质中进行复制。正股单链RNA基因组5端有帽子构造，3端有PolyA尾巴，具备mRNA功能和传染性。感染宿主细胞后，其基因组RNA既可作为mRNA翻译出病毒特异性蛋白质，又可作为模板转录互补负链RNA。一方面，病毒基因组5端开放读码框会翻译成一条多肽链，然后被病毒编码蛋白酶切割为几条非构造蛋白，涉及RNA-dependent RNA polymerase （Rep）和ATPase helicase（Hel），通过这些蛋白来完毕病毒基因组复制、亚基因组mRNA合成。接着，合成负链作为模板转录出具备mRNA功能基因组RNA，同步也可作为其她几种大小不同亚基因组模板。这些亚基因组mRNA可以指引合成不同构造蛋白和非构造多肽。冠状病毒合成亚基因组mRNA一种突出特点是非持续性，从而省略了转录后修饰剪切过程，这种基因定位机制到当前还没有完全弄清晰，然而，近来某些证据表白在它是通过辨认基因组5端转录调节信号（transcription regulation signal ，TRS），来指引这种非持续性亚基因组mRNA合成（Marco，）。TRS除了在SARS冠状病毒基因组开头浮现一次之外，在基因组其她位置还浮现了六次。依照TRS背景，再结共计算机分析，计算出SARS冠状病毒粒子将会浮现8.3,4.5,3.4,2.5,2.0和1.7kbmRNA，在对SARS冠状病毒RNA进行Northern杂交实验中，Paul等用3端非翻译区作为探针，分别检测到了8.3kb（相应S蛋白）,1.7kb(N蛋白)，4.5kb(涉及x1，x2和E蛋白)，3.4kb(M蛋白和x3),2.5(x4和x5)，实实在在阐明了SARS冠状病毒中S、N、E和M等构造蛋白存在（Paul，）。 构造蛋白和基因组RNA复制完毕之后，将在宿主细胞内质网处装配，形成新冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌至细胞外，完毕其生命周期。下图为冠状病毒细胞内复制模式图： 图5：冠状病毒细胞内复制模式图（from Microbiology & Immunology）1.4 SARS冠状病毒基因组测序和分析从香港大学微生物系实验室在世界上第1个报道了SARS也许是由一种新型冠状病毒所致，至今为止，全世界完毕全基因组测序并提交到Genebank 病毒株已达到11 株（分别为：BJ01、CUHK-W1、CUHK-Su10、HKU-39849、Tor2、Urbani、SIN 系列5 条）。5 月1 日至2 日，加拿大、美国和中华人民共和国三个研究组分别刊登了各自完毕测序病毒株基因组分析论文(Paul，Marco& QIN,)。比较美国（CDC,USA）和加拿大（BCCA Genome Centre）已经公开病毒全基因组序列，发既有很小差别。美国Urbani株长度为29，727 nt，其5端多余一段TTATTAGGTTTTTAC（15nt）；加拿大Tor株长度为29，736nt，通过计算机预测，有14个Orf，其3端多余24个A，中华人民共和国BJ01病毒株长度为29，725nt。相对于Urbani株，加拿大Tor株其她位置差别依次为： 7919（TC），16622（TG），19064（GA），19183（CT），20596（AG），20910（GT），23220（TG），24872（CT），26857（CT）。 SARS病毒基因组与其她冠状病毒基因组构造相似，基因组前三分之二中有2个开放阅读框（ORF）1a和1b，编码RNA聚合酶，ORF 1b下游是某些编码构造和几种非构造蛋白基因。以Urbani株为例，它基因组序列，包括了除RNA聚合酶(Rep)以外编码信息，自5端到3端共有10个开放性阅读框（如图），其中E和X2有交叉重叠，别的ORF之间由内含子隔开，S、E、M、NORF为病毒构造蛋白编码基因，分别相应S蛋白（Spike protein），E蛋白（Envelope protein），M蛋白（Membrane protein），N蛋白（Nucleocapsid phosphoprotein），别的为非构造蛋白编码基因。 图6：SARS冠状病毒urbani株基因组构造图（from Paul et al，）通过和其她冠状病毒S蛋白、E蛋白序列比较，SARS冠状病毒和其她冠状病毒蛋白之间相似性都不高，通过冠状病毒之间蛋白进行种系发育分析，SARS病毒蛋白都处在一种独立分支上。可以看出，SARS病毒明显不同于同其她三个冠状病毒群，也许归属于新冠状病毒群。SARS冠状病毒蛋白与其她类冠状病毒蛋白相似性如下表：图7：冠状病毒蛋白同源性比较（from Paul et al，） 对SARS冠状病毒基因组测序所得到数据，都支持了这样一种观点：SARS病毒并没有和其她病毒（涉及已知三种冠状病毒）发生过重组或互换事件，据此咱们可以推测SARS冠状病毒本来寄生于某一种动物上，通过突变而获得了侵染人类致病能力，也有也许SARS病毒是从本来一种对人无害人冠状病毒进化而来。但是最初实验证明了没有接触过SARS冠状病毒人血清里面不含针对它抗体，这个暗示在人体里没有一种与SARS冠状病毒很相近但是没有致病性病毒。要阐明SARS病毒来源和动物宿主还必要通过进一步调查、实验和数据分析来获得（Marco，）。而在中华人民共和国研究组刊登病毒基因组分析论文中，除了对BJ01这病毒株进行注释外，还将其与加拿大、美国和香港科学家完毕4株冠状病毒全基因组测序进行了对比分析。在同其她四株已测定病毒比较中发现，SARS病毒S蛋白质（Spike protein）和M蛋白质（membrane protein）具备极强变异性，在5株病毒中，S蛋白质和M蛋白质变异点位达到31个，其中有9个点位变异都能在2株或3株病毒基因组序列中获得印证。这阐明SARS病毒具备极强变异能力，意味着研究SARS疫苗也许会同研究流感疫苗同样困难重重。2 SARS病毒引起非典型性肺炎治疗方案当前SARS还缺少特效治疗，当前治疗涉及抗病毒治疗如利巴伟林（病毒唑），奥司她伟，血清疗法等；用激素减少免疫系统对肺损伤；用抗生素治疗潜在细菌感染；辨证中西医结合治疗；呼吸机应用以及应激和ARDS(Acute respiratory distress syndrome)对症支持治疗等。国内钟南山院士提出四条有效临床治疗经验：（1）在起病初期病人浮现类似流感症状时，用中西医结合办法，清热解毒治疗有效；（2）肺纹理或病理变化酷似纤维化病程时，及时使用大剂量糖皮质激素；（3）病人浮现缺氧，呼吸困难时，及早使用无创通气；（4）对中后期严重免疫功能低下者，关注患者继发感染。利巴伟林是一种嘌呤类似物，构造上和鸟嘌呤相似，可以拮抗各种RNA病毒。血清疗法是病人通过静脉输入康复者血清。香港中文大学内科及药物治疗系主任沈祖尧说，SARS病人如果在发病两个星期内使用血清，病人住院时间和发热期会较短，死亡率会较低。广州中山大学附属第三医院从2月2日开始，对21例SARS患者进行了血清中IgM和IgG浓度跟踪调查，历时三个月，她们发现：患者发病一周内两种抗体均未产生，1014天，IgM开始浮现并不久达到高峰，60天时，约有1/3患者可以检测到IgM，90天时基本消失，IgG抗体也在1014天开始浮现，60天达高峰，90天仍持续高水平，从这可以推断SARS保护性抗体很有也许是IgG，这为康复病人血清可以治疗重症病人提供了根据（李黔等，）。3 开发抗SARS新药研究思路和办法SARS病毒基因序列明确对拟定SARS病原，分析病毒转播和发病机理具备重要意义，同步为后续开发诊断试剂、疫苗和防止治疗药物研究提供了诸多便利。当前德国Bernhard Nocht研究中心开发了世界首个非典型性肺炎病原体/冠状病毒定量检测试剂盒。该试剂盒运用RT-PCR反映来对这种新型冠状病毒基因组一段80bp区段进行扩增并定量检测。在国内，清华大学生物芯片国家工程研究中心与国家疾病防止控制中心已经研制出SARS迅速早诊基因芯片，并用于临床样本检测获得成功。中山大学生物技术研究因此RT-PCR技术为基本，研制出初期迅速诊断检查试剂盒。在筛选抗SARS冠状病毒药物方面，虽然到当前还缺少特效药，但是从事这方面研究科学家提出了诸多重要观点。美国科罗拉多大学微生物学专家Kathryn VHolmes博士是研究冠状病毒顶尖人物，她指出，SARS冠状病毒自身有某些潜在抱负靶点可以用来设计药物。例如，针对RNA 聚合酶抑制剂可以用来抑制SARS冠状病毒复制。尚有，S蛋白在宿主辨认、抗体产生、介导细胞毒等密切有关，它基因突变会影响病毒毒力和宿主选取（Thomas，），因此，针对S蛋白抗体将会阻断SARS病毒和宿主细胞融合，也许有效防止SARS病毒感染（Kathryn，）。从上面所述病毒复制及其阻断机理入手研究防治药物，上海生命科学研究院研究人员成功克隆了SARS病毒中S、M、N、E及RNA聚合酶、（3CL）蛋白水解酶等6种重要蛋白基因，并在病毒重要蛋白质基因表达、分离、纯化实验中，获得了SARS病毒中E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶等三种蛋白表达样品（SHEN Xu，et al，），成果显示基因工程表达S蛋白可以与特异性抗体结合，6个重要蛋白基因表达样品已进行药物虚拟筛选。与此同步，德国Lbeck大学生物化学研究所Anand研究小组，在自己以往对冠状病毒蛋白质构造研究基本之上，获得了TGEV冠状病毒重要蛋白酶3CL蛋白水解酶样品，同步依照氨基酸序列同源性，刊登了蛋白酶三级构造，并对于该蛋白高档构造特性和已知蛋白酶化学抑制剂结合特性进行了详尽分析，给出了一种也许作为药物筛选先导物(leader)重要抑制剂-AG7088。由于TGEV冠状病毒3CL蛋白水解酶和SARS冠状病毒3CL蛋白水解酶具备较高同源性，同步通过计算机预测，它们三维构造也相似，因此该工作为抗SARS 药物设计和筛选，提供了重要构造根据（Kanchan，et al，）。接种疫苗是人类对付传染病有力武器。自从2前牛痘疫苗消灭了天花之后，疫苗就成了人类对付众多传染病终极法宝。对某些冠状病毒防止来说，疫苗也是一条可行道路。当前疫苗总共可分为六大类，即灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、抗体文库、马血清和运用腺病毒载体构建疫苗。例如通过接种削弱毒力活病毒粒子（Avian infectious bronchitis virus，IBV和Porcine epidemic diarrhea virus）来防止禽类和猪由于冠状病毒引起疾病。然而，用灭活SARS冠状病毒作为免疫原对于人来说有潜在危险，并且，灭活菌体疫苗需要通过体外培养大量病毒，SARS病毒致病性如此强大，不能有任何泄露，只有在万无一失前提下才干大量生产，否则将对生产工人和环境导致无法挽救损失，第三，有些疫苗有时反而会加重病情，例如，当接种了猫冠状病毒疫苗动物接触到野生型病毒粒子时，由于机体过度免疫反映，病情相比更为严重（Kathryn，）。国内防治非典型肺炎指挥部科技攻关组已于4月底组织国内某些科研和生产单位正式启动了非典疫苗研制工作，集中力量研制“灭活疫苗”。疫苗安全性已被初步证明，下一步科研人员可以进行大规模动物实验，研制工作进度将大大加快。如果在免疫病理研究等方面不出意外话，国内有望于今年10月底前批准“灭活疫苗”进入临床研究阶段。此外，生物制药公司GenVec公司从此外一种途径来开发抗SARS病毒疫苗，该公司与美国国立卫生研究院（NIH）合伙，用腺病毒载体技术开发SARS疫苗。GenVec腺病毒载体技术原理是将腺病毒有毒物质去除，留下病毒外壳作为遗传物质载体，将SARS冠状病毒特定DNA序列重组到腺病毒中，这些DNA编码一定蛋白，进入人体细胞后便会表达特定蛋白。这些蛋白则会触发人体自然免疫反映达到对抗外来入侵物质目。通过采用基因工程办法研制非典防治药物，表达SARS病毒重要抗原蛋白，发展阻断病毒和细胞结合或病毒自身复制防治制剂，或运用老式疫苗使生物体内形成免疫能力，这些办法是在SARS防治领域中研究两大方向。除此以外，国内外已有研究机构将RNA干扰技术用于SARS治疗攻关研究。RNA干扰（RNA interference）是一种由双链RNA诱发基因沉默（gene silencing）。在此过程中，与双链RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制了该基因表达。RNA干扰是存在于许多生物（涉及植物和人）体内一种自身防御机制，同步也也许是一种内源性基因表达调控机制。通过RNA干扰抑制基因表达具备高特异性和高效率。尽管RNA干扰详细机制尚不清晰，大量体外实验研究资料已经显现出该技术在基因功能研究中应用前景和新药开发中巨大潜力，但是，RNA干扰技术用于治疗人类疾病安全性仍是个未知数。中华人民共和国科学院生物化学细胞所抗SARS反义核酸药物和核糖核酸干扰药物研究已全面启动，其中，由金由辛专家领导科研小组详细从事核酸研究，她们准备运用两种途径研究两种药物。其中一种是反义寡脱氧核苷酸药物，这也是美国AVI公司宣布要做抗病毒药物。此类药物可在转移核糖核酸水平阻断蛋白质生物合成，从而抑制病毒生长。另一种是核糖核酸干扰药物研究。她们一方面对所懂得约3万个核苷酸长度SARS冠状病毒基因组核糖核酸，以及编码重要蛋白信使核糖核酸构造进行了计算机模仿，同步检查人类基因与否具有这些靶点，如果有，就会对人类导致伤害，当前，她们已经通过检索，证明在人类基因组中不具有这些靶点。从4月27日开始，她们开始在细胞水平上进行实验，对这两类药物进行检查，看与否能抑制SARS病毒中重要基因表达。由于SARS病毒在细胞中生长，她们将在细胞中加入药物进行实验，但愿从中筛选出有效靶点，同步与其她单位协作，进行抑制病毒生长实验，最后目是将它们制成喷雾剂，直接喷入SARS病人气管以杀死病毒。4.问题与展望在6月中旬，WHO宣布中华人民共和国北京为SARS非疫区，这阐明咱们在这一场战役中打了胜仗，基本控制了SARS疫情。但是应当结识到，人类与传染病斗争始终贯穿于整个人类发展史，如在与血吸虫病、结核病和霍乱等疾病斗争中，人类每次都是在付出巨大代价后获得了最后胜利。SARS 病毒是一种新冠状病毒，其毒力远远强于其他已知家族成员，SARS与否会卷土重来，这是一种难以预料问题。对于它来源、入侵、复制、传播以及它引起机体损伤中许多问题还等待咱们进一步去摸索认知。通过揭示其病源学途径，研制出有效疫苗和特异性药物，并依托有效疫病公共防治体系惠及整个社会，疫病才不致于重新危害人类，并且，对SARS冠状病毒研究必将给咱们后来面对新冠状病毒时带来新研究和防治方略。参照文献：Paul A. 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