海水养殖动物主要病毒性疫病爆发机理与免疫防治的研究应用.doc

一、核心科学问题及研究内容
选取海水养殖业中经济和学术价值并重对虾和鱼类，针对研究最为进一步、致病性最高、危害最为严重对虾白斑综合征和鱼类虹彩病毒病，开展如下研究：
1. 疫病爆发流行分子病原学基本
l 病毒感染与疫病爆发细胞和分子基本：拟定病毒侵染、传播靶标器官和致病分子机制。研究病毒内吞与胞内移动分子过程，拟定病毒感染受体及作用网络。开展与病毒感染及致病等有关功能基因研究，以期理解病毒感染与疫病爆发分子基本。
l 病毒对宿主细胞机能操控机制：研究病毒、病毒编码基因及非编码病毒miRNA对宿主基因、细胞信号通路和调控网络调节作用，揭示病毒对宿主细胞机能操控机制和作用网络，进一步阐明病毒致病分子机理。
l 病毒遗传变异特性与分子流行病学：在野生和养殖对虾、鱼类及水体中查明病毒传播分子途径。研究病毒不同种株之间遗传变异和演化特性，阐明其遗传变异与感染宿主范畴及疾病流行关系。
2. 宿主应对病原侵染应答规律与疫病爆发机理
l 研究宿主应对病毒感染天然免疫反映核心途径，涉及对病原异己辨认分子基本、信号转导途径和效应分子作用机制。
l 摸索鱼类适应性免疫激活、维持与调控机制，比较低等脊椎动物抗感染免疫反映与哺乳动物异同。
l 分析病原侵染与环境变化对免疫细胞功能、免疫有关基因表达与神经内分泌-免疫网络影响，揭示疫病发生与爆发机理。
3. 疫病防治免疫学原理和核心技术途径
l 运用病原与宿主互相作用粘附蛋白和受体，研制对虾WSSV感染阻断剂；阐明对虾免疫因子和免疫增强剂作用机制，研发有效免疫活性物质及其导入途径。
l 针对危害严重鱼类虹彩病毒筛选、设计高效免疫原，构建高保护性疫苗，摸索疫苗效应机制；开展疫苗包埋剂和免疫佐剂研究，研发有效疫苗导入途径；创立高效疫苗保护效果实验室评价体系。
l 研究对虾和鱼类免疫稳态环境与生态操控原理，研发防控对虾白斑综合症和鱼类虹彩病爆发环境调控技术途径。

二、预期目的
（一）总体目的
1. 在海水养殖对虾和鱼类病毒性疫病爆发和免疫防治理论方面获得突破，丰富和拓展海洋动物病毒功能基因组学、分子流行病学、细胞免疫学、分子免疫学，开创国内鱼类系统疫苗学，引领国内海水养殖动物疫病发生和免疫防治学科发展。
2. 明确对虾和鱼类天然免疫系统应对病毒感染免疫反映核心途径，揭示鱼类适应性免疫激活、维持与调控机制，分析病原侵染与环境变化对免疫系统影响，摸索疫病发生与爆发分子机理。
3. 开辟海水养殖动物疫病免疫学防治新途径，全面提高疫病发生与控制方面研究水平，获得一批具备国际重要影响原创性成果，提高国内在国际海洋动物免疫学及病害控制领域前沿地位。
4. 针对由虹彩病毒和WSSV病毒引起疫病，建立和发展有效免疫防治技术和途径，有效遏制疫病爆发，增进海水养殖产业健康持续发展。
5. 组建一支在海洋水产疫病发生和免疫防治研究中具备创新能力团队，造就一批在国内外有影响力领军人物和中青年学科带头人。
（二）五年预期目的
1. 揭示WSSV和虹彩病毒感染致病与疫病爆发细胞和分子基本：明确WSSV和虹彩病毒侵染靶组织、侵染途径和增殖方式；阐明4个以上WSSV和虹彩病毒初期调控因子及毒力因子，拟定6-8个WSSV和虹彩病毒参加侵染和致病核心基因以及4-6个与其互相作用受体蛋白，揭示其对宿主细胞调控机制及其与疾病发生关系；构建1-2种具备感染性荧光标记重组虹彩病毒；揭示宿主受病毒基因和miRNA调控信号分子6-8个，信号传导通路3-4条，初步阐明WSSV和虹彩病毒对宿主细胞机能调控网络和操控机制，阐明不同致病株遗传与演化特性。
2. 诠释对虾和鱼类应对病毒感染免疫反映核心途径与调控网络：鉴定对虾抗病毒核心基因/蛋白8个以上；获得具备抗病毒活性次生代谢产物2个以上，抗病毒保护率达到50%以上；阐明对虾抗病毒信号转导通路，建立以对虾为代表甲壳类动物天然免疫系统基本框架构造；阐释鱼类应对病原感染免疫反映核心途径、调控网络及其对环境胁迫应答规律，揭示疫病爆发机制。
3. 拓展病毒性疫病防治免疫学途径和核心技术：获得3-4种可有效阻断WSSV入侵特异性抗体或2-3株活性单链抗体；构建具备稳定阻断效果RNAi载体；明确不同类型免疫增强剂免疫增强机理，筛选到4-6种高效、健康免疫增强剂和2-3种可增强对虾抗病力养殖环境和谐型外源生物；鉴定WSSV感染有关对虾重要免疫因子，实现3-5种抗病免疫因子基因在酵母或细菌中高效表达；优化对虾抗病生物活性物质导入途径；建立鱼类病毒疫苗设计方略和疫苗高效表达与导入技术；构建5个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70％；发现3个高效免疫佐剂，拟定其能提高免疫保护效率达15％以上；建立一种疫苗效应实验室评价体系。
4. 获得一批具国际影响原创性成果：在SCI收录与水产病害和免疫有关TOP期刊上刊登论文150篇以上，申请国家或国际创造专利30项以上。
5. 培养一批中青年学术人才：培养研究生，博士和博士后150名以上；建立以中青年为主体，在海水养殖鱼虾类免疫防治研究中具高度自主创新能力团队，造就在国内外颇有影响力中青年学科带头人。

三、研究方案
（一）学术思路
本项目面对国内海水养殖业病害肆虐，形势严峻现状，凝练出海水养殖动物重要病毒性疫病爆发机理及其免疫防治科学问题，聚焦目的、突出重点，采用当代生命科学前沿技术、进一步摸索重要疫病爆发机理和免疫防治科学基本。一方面，从病原角度研究侵染、致病机理及疫病爆发流行机制。另一方面，从宿主角度探讨抗感染免疫分子和细胞基本，最后落足于为疫病防治提供免疫学基本与技术途径目的上。与“十五”和“十一五”973筹划支持有关项目相比，本项目聚焦于危害重大病毒性疫病，在继续强调病原与宿主互相作用关系同步，重点关注疫病爆发机理和疫病防治免疫学办法和途径，把理论和实际、基本研究和国家需求紧密结合，目的更加明确。
根据国内海水养殖业发呈现状，充分考虑到脊椎动物和无脊椎动物在免疫防御机制上明显差别，选用经济价值和科学价值并重对虾和鱼类为研究重点，锁定导致广泛危害且研究最为进一步对虾白斑综合征病毒和鱼类虹彩病毒，集中研究病原感染和宿主免疫应答以及疫病爆发与流行机制。在疫病控制方略上强调免疫学防治办法与途径，重点研究阻断、激活和增强机体免疫防御能力机理和有效途径，开发研制高效疫苗和抗病物质，并针对鱼、虾与陆生动物明显不同生物学特点和水体环境，摸索疫苗和免疫活性物质导入鱼、虾机理及途径，为系统研制高效免疫制剂和疫苗提供理论和技术支撑。
本项目将从病毒性疫病爆发和流行分子病原学基本、宿主应对病原侵染应答规律与疫病爆发机理、以及疫病防治免疫学原理和有效技术途径三个核心科学问题入手，开展海水养殖动物重要疫病爆发机制和免疫防治基本研究。研究内容既各有侧重，又互有关联，彼此支撑，形成一种有机整体。疫病爆发和流行机制研究不但揭示了疫病发生分子机理，同步也为免疫防治基本研究提供了精准分子靶标；宿主抗感染免疫机理阐释了病害发生过程中宿主免疫反映机制，为疫病免疫防治研究提供核心思路。
（二）技术途径
1. 技术路线
本项目将充分运用基因组学、转录组学、蛋白组学、生物信息学、分子免疫学等多学科先进研究办法和技术，借鉴人类医学和畜禽疫病防治新概念、新观点和新思路，从病原、宿主以及病原和宿主间互相作用入手，开展多学科交叉研究，从分子水平探讨海水养殖动物疫病爆发机制，发展疫病控制免疫学技术，全面提高国内该领域基本研究水平，实现质奔腾。技术路线如图1所示。

图1 项目拟采用技术路线

2. 重要研究办法
（1）疫病爆发流行分子病原学基本
运用免疫荧光技术、免疫电镜技术、PCR技术、从个体、组织、细胞和分子水平研究病毒侵染宿主途径和靶标，检测病毒感染引起宿主机体损伤和死亡机制；运用CO-IP技术、酵母双杂交技术、Pull-down技术、蛋白组学等技术，分析病毒初期调控因子与宿主分子间互相作用、病毒蛋白和miRNA对宿主免疫系统调控机制和作用网络；运用基因组学、生物信息学技术和分子流行病学手段，结合病毒感染实验和免疫组化、电镜技术等调查分析疫病爆发传染源，病毒遗传变异特性及致病力、宿主范畴差别，阐明疫病爆发机制。
（2）宿主应对病原侵染应答规律与疫病爆发机理
综合运用基因克隆、表达等分子生物学技术、生物信息学、DNA芯片、蛋白质组学、免疫共沉淀、pull-down技术、RNA干扰、免疫组织化学、比较免疫学、分子生态学等办法研究宿主免疫体系及其对病毒性病原侵染和环境变化应答机理、信号转导核心途径及其与疫病爆发关系等。
（3）疫病防治免疫学原理和核心技术途径
在对虾白斑综合征防控方面，运用受体封闭、抗体中和、RNAi等技术阻断病毒感染和复制途径；借助免疫学和当代生物学技术研究免疫活性物质免疫增强机理；采用不同材料和包被携带办法对免疫活性物质进行加工解决，建立饲料添加、生物携带等新导入途径。
在鱼类疫苗研究方面，运用蛋白质组学与生物信息学办法筛选免疫原，运用分子生物学和基因工程办法构建疫苗表达载体，运用免疫组化等办法检测疫苗组织分布，运用转录组学、蛋白质组学等办法检测免疫基因表达。采用系统生物学研究思路和技术办法，建立疫苗保护效应评价体系。
（三）创新点与特色
1. 学科理念创新
提出海洋动物病毒功能基因组学和蛋白组学、分子流行病学、系统疫苗学等新学科理念。在这些新理念指引下，从病原与宿主互相作用入手，系统诠释疫病爆发机理，发展基于免疫学基本疫病控制方略，将海水养殖动物疫病爆发和防治基本研究提高到新高度。
2. 研究手段创新
本项目将组学手段引入到病原构造、感染和致病过程，宿主免疫系统构成和免疫应答过程，疫病爆发和流行等不同研究环节，全面系统理解病原致病机制、宿主免疫应答调控网络和疫病爆发规律，在基因构造、基因转录翻译和表达调控等层面将系统生物学最新办法有机地应用于本项目研究，使本项目总体研究水平向国际医学和兽医学前沿趋势迈进。
3. 研究思路创新
本项目重点抓住具备普遍意义天然免疫防御系统并将其中核心因子及调控网络与适应性免疫系统进行比较分析，研究对象则针对具备国内特色重要海水养殖动物对虾和鱼类，跨越了从无脊椎动物到脊椎动物两大门类，研究摸索免疫系统构造与功能及核心免疫分子和调控网络来源与进化，有望在分子比较免疫学领域获得重要创新。
4. 研究成果创新
预期完毕几种国内新近发现病毒及其变异株基因组全序列测定，发现一系列新致病基因和致病机制，建立完善虹彩病毒新分类体系；从对虾和鱼类中发现新免疫抗病基因及免疫应答调控新途径，这些成就将大幅提高国内在国际同类研究中地位。
5. 特色组织管理方式
在“十五”和“十一五”973项目基本上，由山东省科技厅和中华人民共和国科学院详细组织中华人民共和国科学院、教诲部、农业部和国家海洋局等下属全国海洋科学研究单位，进一步吸取国内优势单位创新人才，构成一支研究队伍，为项目整体协调和研究工作全面推动创造了条件。
（四）可行性分析
1. 夯实工作基本
本项目继续瞄准国内海水养殖动物病害防治重大需求，在“十五”973筹划“重要海水养殖生物病害发生和抗病力研究”和“十一五”973筹划“重要海水养殖动物病害发生和免疫防治基本研究”基本上，聚焦目的，进一步进一步研究。研究工作基本好、起点高。
2. 雄厚技术力量
重要优势单位拥有此研究领域较强技术平台，涉及“有害生物控制与资源运用”和“微生物技术”国家重点实验室及9个省部级重点实验室，如中科院实验海洋生物学和海洋生物资源可持续运用两个重点实验室，国家教诲部遗传学与育种重点实验室和水产养殖重点实验室、教诲部动物疫病病原学与免疫控制重点实验室、教诲部濒危动植物保护生物学重点实验室、教诲部细胞生物学与肿瘤细胞工程教诲部重点实验室，农业部海水养殖病害与生态重点开放实验室、农业部动物病毒学重点实验室，国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室，以及国际对虾白斑综合征和传染性皮下及造血组织坏死OIE参照实验室。各研究平台优势互补并共享公用，所具备仪器设备和研究手段基本满足本项目规定。
3. 创新研究队伍
通过“十五”和“十一五”973筹划项目实行，已经培养起一支在海水养殖动物病害发生和防治领域得到国内外承认、有一定创新能力研究队伍。在此基本上，本项目依照研究内容需要，更广泛地吸取国内有关单位优势力量，组建成一支创新力强研究团队。这支研究队伍继承和发扬团结协作、联合攻关优良老式，加上项目组织部门有成熟先进管理经验，可以保证项目目的圆满完毕。
4. 广泛国际合伙
本项目重要学术骨干与美国、加拿大、法国、新加坡、德国、荷兰、挪威，日本等同行专家建立了较好合伙关系，订立了多项合伙合同，广泛开展了合伙研究。通过国际合伙和学术交流，及时掌握国际发展动态，借鉴和吸取国际同行成功经验和研究成果，加强提高创新能力，保证本项目研究工作在国际相似领域前沿性，对提高成果水平将起到良好增进作用。
5. 成功项目管理
项目承担单位和参加单位项目管理部门具备成熟管理经验，对课题实行提供保障和支持，可以保证本项目顺利实行和圆满完毕。
（五）课题设立
课题一 对虾白斑综合征爆发分子机制
研究内容：
1. WSSV感染初期病原与宿主互相作用
分析拟定WSSV最先侵入虾体靶组织分子证据，追踪病毒组分与细胞膜结合到进入细胞核分子过程，从组织、细胞和分子水平揭示WSSV入侵机制；研究病毒初期调控因子与宿主细胞分子互相作用网络，阐明病毒调理并运用宿主生理机能进行自我复制机理，揭示WSSV引起宿主病变细胞和分子基本。
2. WSSV由潜伏感染转为急性感染诱因与机理
研究养殖条件下WSSV潜伏性感染维持机制，分析WSSV潜伏感染转化为急性感染过程核心诱因，阐明核心诱因对病毒感染调控分子过程；研究并揭示养殖环境诱导对虾白斑综合征疫病爆发分子机制。
3. WSSV基因组变异与疫病爆发流行趋势
针对不同毒力WSSV毒株，分析WSSV基因组变异规律及其与毒力之间关系，筛选鉴定可变异毒力基因并分析其对致病性贡献；研究致病力差别对病原感染和传播能力影响，揭示WSSV变异在疫病爆发流行中作用。
研究目的：
1. 明确WSSV最初侵染靶组织以及在组织间传播分子过程，揭示WSSV进入易感细胞方式和机制。
2. 阐明2个以上病毒初期调控因子对宿主细胞调控机制及其与疾病发生关系。
3. 阐明WSSV潜伏性感染机理，解析环境因子在WSSV潜伏感染转化为急性感染过程中作用。
4. 明确不同致病力WSSV毒株之间基因组差别及其变化规律，鉴定2个以上WSSV毒力因子，阐明毒力因子与疫病爆发和流行关系。
5. 刊登SCI收录期刊论文20篇以上，其中影响因子不不大于53篇；申请创造专利4项；培养研究生20名，博士5名。
课题负责人： 杨 丰
承担单位： 国家海洋局第三海洋研究所、中华人民共和国水产科学研究院黄海水产研究所、中华人民共和国海洋大学、中山大学
经费比例： 15.5%

课题二 鱼类虹彩病毒病爆发细胞基本与分子机制
研究内容：
1. 虹彩病毒感染与疫病爆发细胞和分子基本
在组织水平研究病毒侵染和传播途径，分析病毒作用靶组织和细胞；在细胞水平研究病毒对宿主细胞辨认、细胞内吞与胞内迁移过程，阐明鱼类虹彩病毒感染与疫病爆发分子基本。
2. 虹彩病毒对宿主细胞机能操控机制
研究病毒、病毒编码基因对宿主基因、细胞信号通路和调控网络操控作用；分析病毒非编码miRNA对病毒和宿主细胞作用靶点及作用机制，揭示病毒对宿主细胞机能操控机制。
3. 虹彩病毒遗传变异特性与疫病爆发流行机制
研究不同地区和不同水体环境条件下鱼类虹彩病毒感染性和宿主范畴，鉴定不同来源病毒遗传特性，分析养殖鱼类虹彩病毒病传染源，研究不同病毒种株遗传与演化特性，揭示感染和传播途径，阐明虹彩病毒致病株感染致病分子机理及疫病爆发流行规律。
研究目的：
1. 构建1-2种具备感染性荧光标记重组虹彩病毒，阐明鱼类虹彩病毒侵染靶组织、侵染途径和增殖方式；拟定6-8个病毒参加侵染和致病核心基因，以及4-6个与其互相作用模式辨认受体；揭示鱼类虹彩病毒感染与疾病暴发分子基本。
2. 揭示病毒对鱼类宿主细胞机能具备操控作用核心基因5-6个、miRNA3-4个，以及与其互相作用信号分子和信号通路，初步阐明虹彩病毒对鱼类细胞机能调控网络和操控机制。
3. 阐明3-4种鱼类虹彩病毒致病株遗传与演化特性，揭示虹彩病毒感染致病遗传变异与疫病爆发流行规律。
4. 在国际期刊刊登SCI论文20-25篇，其中在TOP期刊刊登论文8篇以上。
5. 建设一支具备国际竞争力研究团队，培养研究生20名以上。
课题负责人： 秦启伟
承担单位： 中华人民共和国科学院南海海洋研究所、国家海洋局第三海洋研究所、浙江大学、中山大学、中华人民共和国科学院海洋研究所
经费比例： 15.5%

课题三 对虾免疫系统对WSSV感染响应过程与特性
研究内容：
1. 对虾抗WSSV感染核心基因及次生代谢产物
运用组学技术研究对虾有关基因在不同组织、病毒感染不同步间转录和翻译水平变化，明确对虾抗病毒感染核心基因；采用GC-MS、LC-MS技术，比较对虾在病毒感染先后产生次生代谢产物，拟定与病毒感染密切有关次生代谢产物及其免疫调节作用。
2. 对虾应对WSSV感染信号转导及调控网络
重点研究对虾对病毒模式辨认受体、信号传导分子和效应分子，拟定NF-kB、JAK/STAT、MAPK途径和RNA干扰途径在对虾抗病毒免疫中功能及其交互作用；研究并阐明次生代谢产物在细胞吞噬和细胞凋亡信号转导中作用。
3. 对虾免疫稳态调节及白斑综合征爆发过程
，富花8分析比较不同种类对虾在慢性感染期和急性感染期免疫反映，揭示对虾白斑综合征疫病爆发重要免疫学特性；研究核心环境因子（如温度、溶解氧等）骤变对对虾免疫稳态影响，拟定核心环境因子与对虾白斑综合征爆发关系。
研究目的：
1. 鉴定对虾抗病毒核心基因/蛋白8个以上。
2. 获得具备抗病毒活性次生代谢产物2个以上，抗病毒保护率达到50%以上。
3. 阐明对虾抗病毒信号转导通路，从而建立以对虾为代表甲壳类动物天然免疫系统基本框架构造。
4. 申请国家创造专利8-10项；刊登SCI收录论文30-40篇，其中在病毒学领域、水产领域和有关领域国际权威期刊刊登论文不少于20篇。
5. 培养研究生10-15人，博士后2-3人。
课题负责人： 相建海
承担单位： 中华人民共和国科学院海洋研究所、浙江大学、国家海洋局第三海洋研究所、厦门大学
经费比例： 17%

课题四 鱼类应对虹彩病毒感染免疫反映与调控网络
研究内容：
1. 鱼类应对病原感染天然免疫反映核心途径与调控
研究鱼类模式辨认受体构造功能、表达调控，揭示受体辨认病毒分子机制；研究干扰素免疫系统构成与信号通路调控以及新型抗微生物多肽基因表达调控与作用，阐明宿主清除病原分子机理。
2. 鱼类应对病原感染适应性免疫激活、维持与调控网络
研究并揭示鱼类参加抗病原感染T细胞和B细胞亚群免疫遗传表型和分化发育规律；研究抗原递呈细胞活化初始T细胞途径，分析细胞免疫和体液免疫以及Treg免疫抑制形成机制，阐明其在抗病毒侵染中作用；研究并查明抗病毒适应性免疫形成和维持细胞与分子基本及核心调控网络。
3. 鱼类抗病毒感染环境因素及其免疫调控
分析鱼类病毒病发生环境诱因，明确环境因素与鱼类抗病力耦合关系；研究不同环境因素对鱼类抗病毒免疫力影响，揭示鱼类应对环境胁迫免疫信号通路及其调控网络；研究并阐明环境因素对免疫力亲子传递与维持影响。
研究目的：
1. 确立鱼类辨认病毒核心基因和蛋白15个、防御病毒核心基因和蛋白15个，阐明宿主辨认与清除病原分子机理。
2. 明确鱼类应对病原感染免疫反映核心途径2-3条、调控网络2-3个，确立环境胁迫影响鱼类抗病力机制，为疫病防治奠定理论基本。
3. 为鱼类疫苗、免疫佐剂和抗病毒制剂开发和应用，提供符合鱼类免疫机理和特点、有针对性理论指引。
4. 在国际有关刊物刊登SCI论文25-30篇；申请国家创造专利3-5项。
5. 培养博士生20名，研究生研究生20名，博士后2名。
课题负责人： 张士璀
承担单位： 中华人民共和国海洋大学、浙江大学、中华人民共和国科学院南海海洋研究所、中华人民共和国科学院海洋研究所
经费比例： 15.5%

课题五 对虾白斑综合征防治免疫学途径和核心技术原理
研究内容：
1. 阻断或抑制WSSV侵染与复制原理和途径
优选调控WSSV侵染与复制核心靶标，研究针对病毒入侵、复制、组装和传播等核心过程阻断、抑制和干扰技术原理；应用受体封闭、竞争抑制和RNAi等办法与途径，实现对WSSV侵染有效阻断。
2. 对虾免疫系统激活与调节技术原理
研究对虾抗感染核心免疫因子激活途径和运用原理；优选可调控核心免疫因子免疫激活与调节制剂；发展维持对虾免疫稳态环境与生态操控技术，找出提高对虾抗WSSV感染免疫力有效办法与技术途径。
3. 免疫活性物质导入途径与技术
研究免疫活性物质不同包被解决办法和导入方式，分析比较摄取、吸取和免疫增强效果，拟定高效导入途径；研究使用共生菌载体直接导入免疫效应分子技术原理。
研究目的：
1. 定位WSSV侵染过程中病毒与宿主核心蛋白或基因；获得3-4种可有效阻断WSSV入侵特异性抗体；构建具备稳定阻断效果RNAi载体，为对虾白斑病等病害防治开辟新途径。
2. 明确不同类型免疫增强剂免疫增强机理，筛选到4-6种高效、健康免疫增强剂；明确不同类型免疫增强剂免疫机理；鉴定WSSV感染有关对虾重要免疫因子，阐明其功能。
3. 获得2-3株能有效阻断WSSV入侵特异性抗体活性单链抗体；实现3-5种抗病免疫因子基因在酵母或细菌中高效表达，获得具备相应生物学活性重组蛋白；优化对虾抗病生物活性物质导入途径。
4. 筛选到2-3种可增强对虾抗病力养殖环境和谐型外源生物。
5. 刊登学术论文20-25篇；申请创造专利 3-5项，培养研究生30-40名。
课题负责人： 宋林生
承担单位： 中华人民共和国科学院海洋研究所、中华人民共和国海洋大学、中华人民共和国水产科学研究院黄海水产研究所、山东大学、天津师范大学
经费比例： 21%

课题六 鱼类疫病免疫防治系统疫苗学原理与技术途径
研究内容：
1. 疫苗设计与传递方略
针对危害严重鱼类虹彩病毒等重要疫病病原，基于免疫学、生物信息学和组学技术，筛选免疫原，拟定保护原，开发新型疫苗、免疫佐剂和疫苗递呈载体，建立高效疫苗设计与导入技术。
2. 疫苗效应机制
研究不同接种途径疫苗被宿主细胞摄取效率，分析疫苗在宿主组织中分布及稳定性；研究抗原激活与信号传递，分析疫苗诱发免疫应答特性并拟定其与疫苗保护效应关系。
3. 疫苗免疫效应批示和评价体系
基于疫苗效应机制研究，优选核心免疫分子，对比疫苗接种实际免疫保护效果，针对不同类型疫苗和代表性重要经济鱼类，拟定疫苗效应分子批示，建立疫苗效应评价体系。
研究目的：
1. 建立鱼类病毒疫苗设计方略和疫苗高效表达与导入技术。
2. 构建5个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70％；筛选出3个高效免疫佐剂，其可以提高免疫保护效率15％以上。
3. 初步阐明一种疫苗免疫效应机制和一种疫苗佐剂作用机制。
4. 建立一种疫苗效应实验室评价体系。
5. 刊登SCI收录论文30篇，其中10篇刊登于有关研究领域TOP学术刊物；申请国家创造专利10项。
6. 培养研究生和博士研究生15-20名。
课题负责人： 孙 黎
承担单位： 中华人民共和国科学院海洋研究所、中山大学、中华人民共和国科学院南海海洋研究所、中华人民共和国海洋大学
经费比例： 15.5%
（六）课题间关系
从病原角度，设立2个课题，分别对对虾和海水鱼类重要病原（WSSV和鱼类虹彩病毒）开展致病因子及其与宿主互相作用机制和分子流行病学研究，以查明病原致病机理及疫病爆发流行机制，为免疫防治提供核心分子靶位。
在宿主免疫系统方面，设立2个课题，分别研究对虾、鱼类抗病毒侵染核心分子过程、调控网络及其与环境关系，其研究成果将有助于揭示宿主抗感染机制，也为免疫防治提供重要理论根据。宿主和病原之间存在互相作用，这两个课题承上启下，贯穿整个项目。
此前4个课题为基本，设立课题5和课题6，研究阻断病原感染或提高宿主免疫力原理与应用途径。以上课题设立及其互有关系见图2所示。

图2. 六个课题设立及其互有关系

四、年度筹划
（一）第一年度筹划内容和目的
1. 研究内容
（1）WSSV和虹彩病毒侵染与致病：制备高纯度WSSV经口服或鳃涂布攻毒后，用定量PCR和电镜技术分析WSSV入侵途径、最初感染组织及在组织间传播方式；WSSV潜伏感染对虾模型建立，研究诱导WSSV潜伏感染转为急性感染理化因子；对WSSV极初期基因启动子进行缺失突变，寻找最小功能元件；分析不同WSSV分离株毒力，研究近年WSSV流行株基因型特性及演化规律；，测定3-5株致病力差别大毒株全基因组，通过序列比对，找出差别基因作为候选毒力基因。构建、筛选纯化有感染性荧光标记重组鱼类虹彩病毒；鉴定病毒基因功能，研究其与病毒感染力及侵染关系；预测虹彩病毒miRNA潜在病毒或宿主基因靶标；调查不同生境中鱼类虹彩病毒。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制： 运用组学技术研究对虾和鱼类有关基因在不同组织、病毒感染不同步期转录和翻译水平变化，筛查抗病毒感染核心基因；进一步研究比较免疫辨认蛋白、信号转导分子和效应分子构造特性、组织分布和表达调控规律；研究鱼类干扰素免疫系统有关基因，研究其表达与组织分布；分离鉴定新型抗微生物多肽，克隆新型抗微生物多肽基因；分离鱼类参加抗病原感染鱼类T、B细胞等核心免疫细胞，研究其免疫遗传表型。
（3）免疫防治原理和技术：筛选和鉴定WSSV侵染黏附蛋白和对虾抵抗WSSV侵染核心免疫因子；RNAi技术体系构建；筛选免疫增强剂和养殖环境和谐型外源微生物。运用免疫学、生物信息学和组学等技术，系统筛选虹彩病毒免疫原，检测其保护效应；拟定免疫保护抗原，构建抗原表达载体，检测载体稳定性。
2. 预期目的
（1）WSSV和虹彩病毒侵染与致病：初步拟定WSSV在个体水平入侵途径、最初感染组织及在组织间传播方式；获得WSSV极初期基因启动子最小功能元件；建立WSSV潜伏感染凡纳滨对虾模型；获得3-5株毒力差别株全序列，获得候选毒力基因。成功获得1-2株有感染性荧光标记重组鱼类虹彩病毒；拟定2-3个病毒参加侵染和致病核心基因；筛选得到虹彩病毒miRNA病毒或宿主靶基因；初步拟定虹彩病毒疫病爆发流行状况。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制：筛选获得对虾在WSSV感染后差别表达重要基因或蛋白20个以上；克隆获得参加鱼虾抗病毒体液免疫重要基因10-15个，分析其基因构造特性和表达特性；得到参加抗病毒细胞免疫重要基因序列2-3个；分离鉴定鱼类T、B等免疫细胞亚群。
（3）免疫防治原理和技术：鉴定出WSSV侵染核心蛋白和对虾抵抗WSSV侵染重要免疫因子；初步建立起对虾RNAi技术体系；克隆到1-2个免疫因子基因，并阐明其也许抗病毒机理；筛选2-3种免疫增强剂，拟定免疫增强效果；获得候选养殖环境和谐型外源生物；获得4种免疫保护原，建立保护原表达技术。
（4）论文刊登、专利申请和研究生培养：刊登SCI源刊物论文20-25篇，申请专利4-6项，培养研究生20名。
（二）次年度筹划内容和目的
1. 研究内容
（1）WSSV和虹彩病毒侵染与致病：用电镜技术或荧光标记技术研究WSSV进入细胞过程，判断病毒是通过直接膜融合还是内吞方式进入细胞；筛选能结合WSSV极初期基因启动子宿主细胞转录因子；运用免疫共沉淀和凝胶阻滞实验筛选WSSV初期调控因子作用靶分子；拟定诱发WSSV潜伏转为急性感染核心理化因子及其浓度；对候选毒力基因进行初步功能预测和克隆，在昆虫细胞或原代虾细胞中过量表达，分析对细胞与否产生直接影响或伤害，拟定重要毒力基因。观测重组虹彩病毒感染后不同阶段细胞内感染轨迹和病毒入侵途径；克隆、鉴定与病毒感染有关模式辨认受体基因，研究其在病毒黏附和入侵过程中作用；开展鱼类虹彩病毒及病毒基因对宿主免疫信号分子调节作用；研究虹彩病毒miRNA对病毒或宿主靶标基因调节作用；继续调查和比较不同种类虹彩病毒宿主范畴。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制：研究鱼虾对病毒辨认分子、信号传导分子和效应分子功能和表达调控，揭示受体辨认病毒分子机制；研究在对虾细胞吞噬免疫反映中起核心作用基因及其表达调控；采用GC-MS、LC-MS技术，比较对虾在病毒感染先后产生免疫效应产物；研究在养殖温度、溶解氧等环境因子骤变条件下白斑综合征病毒在对虾体内复制变化特性；研究干扰素免疫系统信号通路调控作用；研究抗微生物多肽基因表达、调控与功能；研究鱼类参加抗病原感染T、B等免疫细胞亚群分化发育规律。
（3）免疫防治原理和技术：运用中和抗体和受体抗体阻断WSSV侵染技术建立；筛选和鉴定WSSV大规模复制核心蛋白；构建具备高效、稳定阻断作用RNAi载体；继续免疫因子鉴定和基因克隆，进行重要免疫因子基因重组表达；开展免疫增强剂作用机理研究；分析养殖环境和谐型外源微生物生态功能。在鱼类方面着重开展疫苗免疫佐剂筛选研究，运用免疫保护原及其表达载体，设计、构建高效病毒疫苗，检测疫苗免疫保护效应；研究疫苗口服/浸泡、注射等传递技术，比较其效应，拟定有效免疫途径。
2. 预期目的
（1）WSSV和虹彩病毒侵染与致病：明确WSSV病毒是通过膜融合还是内吞方式进入对虾细胞；获得2个以上也许与极初期基因启动子结合宿主细胞转录因子；获得2个以上WSSV初期调控因子潜在靶分子；拟定2个以上诱发WSSV潜伏感染转为急性核心环境因子；拟定重要毒力基因2个以上。阐明鱼类虹彩病毒侵染运动轨迹及复制方式；拟定2-3个与病毒黏附或入侵有关模式辨认受体；拟定1-2个对宿主细胞机能具备调控作用病毒基因；拟定1-2个对病毒复制或宿主免疫系统具备调节作用虹彩病毒miRNA；拟定虹彩病毒宿主范畴，揭示其流行特性。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制：获得对虾抗WSSV感染核心候选分子3个以上，明确其在组织、细胞中定位；阐明细胞吞噬信号转导通路及其抗WSSV作用；初步查明在不同环境因子条件下虾体内WSSV数量消长变化规律。获取鱼类模式辨认/效应分子核心基因10-15个，明确其表达和功能；阐明鱼类T、B等免疫细胞亚群分化规律。
（3）免疫防治原理和技术：初步建立单克隆抗体阻断WSSV侵染技术；鉴定出负责WSSV复制核心蛋白；构建出导入效果较佳RNAi载体；获得有具备生物学活性重组免疫因子3-5个；筛选免疫增强剂2-3种，明确其作用机理；明确微生物在对虾养殖生态系统中营养及生态防病功能；构建出1个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70％；获得1个高效免疫佐剂，其可以提高免疫保护效率15％；建立1种疫苗高效导入技术。
（4）论文刊登、专利申请和研究生培养：刊登SCI论文30篇，申请专利6项，培养博士后和研究生共30名。
（三）第三年度筹划内容和目的
1. 研究内容
（1）WSSV和虹彩病毒侵染与致病：应用针对性阻断剂对WSSV穿透过程（Penetration）进行阻断，确认病毒借助了哪条途径进入细胞；应用亚细胞构造标志物并结合通路阻断剂，分析WSSV如何在细胞内运送并将遗传物质传递入核；验证细胞转录因子与WSSV极初期基因启动子互相作用，进一步确认极初期蛋白与靶分子结合；研究核心环境因子对对虾免疫有关信号转导途径及其系列基因影响，拟定环境影响核心信号转导途径和基因；通过RNA干扰办法，对候选毒力基因进行沉默，比对分析宿主机体损伤限度，并对感染虾死亡率进行比较，评估毒力基因与致病力关系。研究分析重组虹彩病毒感染后不同阶段组织内感染轨迹、病毒入侵途径；继续开展虹彩病毒核心致病基因功能研究；继续克隆鉴定病毒感染有关模式辨认受体，进一步研究其在病毒黏附和入侵过程中作用；继续开展鱼类虹彩病毒基因对宿主信号通路调节作用；开展鱼类虹彩病毒遗传变异规律研究。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制：研究体液免疫信号通路（TOLL，MAPK等）在对虾抗病毒免疫中作用；研究非编码小RNA在细胞凋亡中表达调控机制及其在对虾抗病毒中作用；筛选抗病毒感染免疫效应产物；研究环境胁迫对虾类免疫稳态影响。分离鉴定构成鱼类重要免疫信号转导途径（涉及干扰素调节途径）核心元件；研究不同环境因素对鱼类免疫信号通路及其调控网络影响；研究新型抗微生物多肽基因作用机制；研究抗原递呈细胞活化初始T细胞机制，分析细胞免疫和体液免疫以及Treg免疫抑制形成机制，阐明其在抗病毒侵染中作用。
（3）免疫防治原理和技术：筛选能阻断WSSV侵染单克隆抗体；分析RNAi对WSSV复制抑制效果；鉴定重组免疫因子抗病毒活性；优选免疫增强剂；拟定不同免疫增强剂间互相增进/协同或颉抗关系；分析养殖环境和谐型外源生物作用于对虾机制。设计、构建不同类型疫苗，筛选疫苗免疫佐剂，分析佐剂免疫效应；研究不同接种途径疫苗被宿主细胞摄取效率，分析疫苗在宿主组织中分布及稳定性。
2. 预期目的
（1）WSSV和虹彩病毒侵染与致病：确认WSSV进入细胞并将遗传物质传递入核途径；明确极初期基因及其产物与宿主分子互相作用；揭示环境因子影响重要对虾信号转导途径和基因；理解重要WSSV毒力基因与致病力关系。阐明鱼类虹彩病毒侵染靶组织和侵染途径；拟定2-3个病毒参加侵染和致病核心基因；鉴定2-3个与病毒黏附或入侵有关模式辨认受体；拟定可以调节宿主免疫信号通路2-3个病毒基因；初步揭示鱼类虹彩病毒遗传变异特性。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制：拟定对虾体液免疫中核心分子在抗WSSV感染过程中作用；阐明细胞凋亡miRNA调控信号转导通路及其抗病毒作用；揭示对虾在WSSV慢性感染和急性感染中免疫响应特性异同。合计获取鱼类模式辨认/效应分子核心基因不少于30个，明确其表达和某些基因功能；阐明抗原递呈细胞活化初始T细胞机制。
（3）免疫防治原理和技术：筛选出具备阻断效果单克隆抗体和能阻断WSSV复制干扰基因片段；鉴定出具备抗病毒活性重组免疫因子；优化出3-5种效果明显免疫增强剂，拟定它们间协同机制；明确养殖环境和谐型外源生物作用机制。构建2个高效候选疫苗，其相对保护率不低于70％；获得2个高效免疫佐剂，其可以提高免疫保护效率15％；初步阐明1种佐剂作用机制。
（4）论文刊登、专利申请和研究生培养：刊登SCI论文30-40篇，申请专利8项以上，培养博士后和研究生30名以上。
（四）第四年度筹划内容和目的
1. 研究内容
（1） WSSV和虹彩病毒侵染与致病：研究参加WSSV病毒穿透过程（Penetration）宿主蛋白，以及细胞骨架有关蛋白在WSSV遗传物质入核过程中作用；运用报告基因技术研究WSSV极初期基因启动子受细胞转录因子调控机制通过在细胞中过表达初期调控因子来研究它们对宿主细胞生理状态影响；研究对虾免疫有关信号转导途径及基因对WSSV潜伏感染维持影响；运用免疫共沉淀或酵母双杂交等技术筛选重要毒力因子靶蛋白。继续进行虹彩病毒核心基因功能分析和鉴定；进一步解析病毒蛋白和宿主免疫基因互相作用及调控机制；继续研究虹彩病毒miRNA对宿主细胞机能和免疫信号通路操控作用；继续开展鱼类虹彩病毒遗传变异规律研究。
（2）对虾和鱼类免疫防御机制：研究不同免疫信号通路之间交互作用和免疫效应产物在细胞吞噬信号转导中作用；研究维持免疫稳态重要因子在环境变化下表达变化特性，分析潜伏感染与病毒病爆发关系。研究鱼类抗病毒适应性免疫激活和维持核