山苍子嫁接愈合过程的组织解剖和生理特性.pdf

Vol.44 No.3Mar.2024第 44 卷 第 3 期2024 年 3 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2023-06-20基金项目：江西省重大科技研发计划专项（20203ABC28W016）；江西省林业局樟树研究专项（创新专项202007）。第一作者：王习政（），硕士研究生。通信作者：刘娟（liu_），副教授，硕士生导师。引文格式：王习政,陈霞,苏文娟,等.山苍子嫁接愈合过程的组织解剖和生理特性 J.中南林业科技大学学报,2024,44(3):56-64.WANG X Z,CHEN X,SU W J,et al.Tissue anatomy and physiological characteristics of grafting healing process of Litsea cubebaJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2024,44(3):56-64.山苍子嫁接愈合过程的组织解剖和生理特性王习政a，陈 霞a，苏文娟a，张运煜a，王毓曼a，谢荟清a，陈尚钘b，刘 娟a，b（江西农业大学 a.江西省森林培育重点实验室；b.国家林业草原木本香料（华东）工程技术研究中心，江西 南昌 330045）摘 要：【目的】通过分析山苍子嫁接愈合过程中嫁接口的组织结构和生理特性变化过程，明确山苍子芽接愈合过程的机制，对山苍子良种嫁接苗木的生产具有重要的指导意义。【方法】以山苍子 1 年生实生苗为砧木，以采穗圃优树 1 年生枝为穗条，采用嵌芽接嫁接技术，于芽接后不同时期取嫁接结合部位组织进行解剖结构的显微镜观察和分析，并测定可溶性淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等生理酶指标活性。【结果】山苍子嫁接愈合过程可分为 4 个时期：隔离层形成期（嫁接后 0 5 d）、愈伤组织形成与连接期（嫁接后 6 16 d）、形成层连接期（嫁接后 17 25 d）和维管组织分化形成期（嫁接后 26 35 d）。在嫁接后初期，嫁接口的砧木切口面先后出现隔离层和愈伤组织，嫁接后 17 25 d，砧穗间形成愈伤组织桥，且形成层相互连接，构成形成层环带；嫁接后 26 35 d 嫁接口处分化出维管组织，且砧穗紧密连接。各生理指标变化存在显著差异，在嫁接后第 15 天，可溶性淀粉、可溶性蛋白、POD、CAT 均上升到峰值水平，随后 5 d，可溶性糖和 SOD 出现峰值，此时 PPO 活性显著降低。【结论】山苍子在嫁接后第 35 天基本完成愈合，且愈伤组织形成与连接末期、形成层连接初期（嫁接后第 15 20 天）是山苍子嫁接成活的关键时期。在隔离层形成期，3 种抗氧化酶（SOD、POD、CAT）即时调控活性氧水平；在嫁接愈合后期(嫁接后 30 35 d)，POD、CAT 与 PAL 共同参与砧穗切口部位愈伤组织形成与木质化过程。关键词：山苍子；嫁接愈合；显微结构；生理特性中图分类号：S792.99 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2024)03-0056-09Tissue anatomy and physiological characteristics of grafting healing process of Litsea cubebaWANG Xizhenga,CHEN Xiaa,SU Wenjuana,ZHANG Yunyua,WANG Yumana,XIE Huiqinga,CHEN Shangxingb,LIU Juana,b(a.Jiangxi Provincial Key Laboratory of Silviculture;b.East China Woody Fragrance and Flavor Engineering Research Center of NFGA,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,Jiangxi,China)Abstract:【Objective】By analyzing the organizational structure of the grafting interface and the physiological characteristics of the grafting site,the mechanism of the budding healing process of Litsea cubeba has been clarified,which has important technical guidance significance for the production of high-quality L.cubeba grafted seedlings.【Method】The L.cubeba annual seedlings was employed as rootstocks,and the annual branches of superior trees in the scion garden as ear strips.Based on the inlay budding grafting technology,the tissues at the grafting junction were sampled at different budding stages for microscopic observation and analysis of the anatomical structure.In addition,the activities of physiological enzymes,including soluble starch,soluble sugar,soluble protein,peroxidase(POD),superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT),polyphenol oxidase(PPO),phenylalanine ammonia lyase(PAL),were measured.【Result】The grafted healing process of L.cubeba could be divided into four stages:isolation layer formation stage(0-5 days after grafting),callus formation and connection stage(6-16 days after grafting),cambium connection stage(17-25 days after grafting)and vascular tissue differentiation and formation stage(26-35 days after grafting).In the early grafting stage,isolation layer and callus tissue appeared successively on the cutting surface of the grafting interface rootstock.17-25 days after grafting,a callus bridge was formed between the rootstock and the scion,and cambium was connected to each other,forming cambium ring.Vascular tissues were Doi:10.14067/ki.1673-923x.2024.03.00657中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷山苍子 Litsea cubeba 又名山鸡椒，为樟科Lauraceae 木姜子属 Litsea 落叶灌木或小乔木，广泛分布于我国南方各省份和东南亚等地区1-2。山苍子是我国重要的木本香料和油料树种之一，根、茎、叶、果实等部位均含有芳香植物精油，其主要成分为柠檬醛。其中山苍子果实柠檬醛含量高达 80%，是我国天然柠檬醛的主要来源。柠檬醛是一种重要的化工基础生产原料3-4，可用于生产紫罗兰酮类、二氢大马酮、甲基紫罗酮等化合物5。近年来，随着经济的快速发展，人们对生活质量的要求越来越高，天然柠檬醛市场需求显著上升，极大推动了山苍子油产业链的快速发展。因此，为加快山苍子良种选育和良种化栽培进程，非常有必要加大对山苍子种质资源生物学和繁育技术的研究。尽管在贵州、江西、浙江、重庆等省市部分地区已有山苍子人工林，但多为实生起源，后代遗传分化较大，且无法快速分辨雌雄幼苗，严重制约了山苍子良种繁育的快速发展。此外，由于穗条内含物和分泌物抑制愈伤组织形成，导致山苍子扦插苗的成活率不高6。而采用嫁接技术能显著缩短经济林木的育种周期，最大程度固化良种的优良性状，提高后代遗传增益，且在生产实践中具有简便、低成本的明显优势，而且嫁接在提高产量、抗逆性、改变开花结果习性和改良果实品质等方面具有非常重要的应用价值。课题组前期对山苍子嫁接技术进行探索，发现采用嵌芽接的嫁接成活率达 93.75%。因此，作为一种果用型经济林，开展山苍子嫁接及愈合机理研究，是加快良种繁育速度，实现良种化栽培的重要途径。嫁接体愈合实质是砧木和接穗在切口面相互作用，在形成愈伤组织后，进行维管束分化和连接，最后形成有机整体的过程。研究表明，砧木和接穗的解剖结构可以反映出嫁接愈合的亲和性7。祁利潘等8将马铃薯与枸杞的嫁接愈合过程分为4 个阶段：隔离层产生期、愈伤组织形成期、愈伤组织分化期和新的维管组织形成期。苏文川9对薄壳山核桃的芽接愈合过程分为 5 个时期：隔离层期、愈伤组织形成期、愈伤组织连接期、形成层分化及连接期、维管组织分化形成期。此外，嫁接后植物的愈合切口会立即产生大量活性氧，造成嫁接部位细胞氧化损伤。过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）能即时清除切口面多余的活性氧，以维持活性氧含量的稳定，防止膜脂过氧化伤害程度加深10。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）分别在嫁接愈合中参与木质素的合成、促进细胞分化和木质化11。研究证实，亲和性强的黄瓜嫁接结合部含有较高的 SOD、POD 活性，亲和性甜瓜嫁接苗接口处具有较高的抗氧化酶活性和较低的活性氧含量，这类抗氧化物酶已成为评判嫁接愈合和砧穗亲和性强弱的重要指标12。目前，关于山苍子芽接愈合过程的研究尚未见有报道，且有关解剖学和生理生化等方面的山苍子嫁接愈合机制仍不清楚。本研究以 1 年生山苍子实生苗为砧木，以优树采穗圃的 1 年生枝作接穗，进行嵌芽接，通过对其嫁接结合部愈合进程进行解剖观察，判断嫁接结合部愈合的关键时期，同时通过分析嫁接结合部的营养物质含量和相关酶活性的变化，探讨山苍子嫁接成活的机理，为嫁接苗培育技术在生产上推广应用提供理论参考。1 材料与方法1.1 试验地概况试验地位于江西农业大学中药园基地（2845N，11549E），属于典型的亚热带季风气候区，光照充足，雨水充沛，年平均日照时数 1 723 1 820 h，年平均降水量 1 500 1 700 mm，年平均气温 18 左右，年平均湿度 78.5%。试验地地势平缓，通风排水良好，试验土壤基质为红壤土。differentiated from the grafting interface 26-35 days after grafting,and the rootstock and scion were tight junction.There were significant differences among various physiological indicators.On the 15th day after grafting,all soluble starch,soluble protein,POD,and CAT rose to the peak levels.On the following 5 days,soluble sugar and SOD reached the highest value,at which point PPO activity significantly decreased.【Conclusion】The healing process of L.cubeba is basically completed on the 35th day after grafting.The key period for survival of L.cubeba grafting is the late stage of callus formation,the early stage of cambium connection(15-20 days after grafting).During the formation of the isolation layer,three antioxidant enzymes(SOD,POD,CAT)immediately regulate the level of reactive oxygen species;In the late stage of grafting healing,POD,CAT,and PAL jointly participate in the formation of callus and lignification process at the cutting site of the rootstock.Keywords:Litsea cubeba;grafting healing;microstructure;physiological characteristics王习政，等：山苍子嫁接愈合过程的组织解剖和生理特性58第 3 期1.2 试验材料处理2022 年 9 月上旬，以 1 年生山苍子实生苗为砧木，选取 3 年生优树采穗圃上 1 年生穗条上饱满的腋芽为接穗进行嵌芽接。于砧木主干位置嫁接，每株砧木接 1 个腋芽，共 300 株，嫁接成活率为 48.33%。具体操作方式为：先在砧木距地面20 cm 的光滑位置使用刀片斜向下削约 3 cm，随后在刀口下方 2.5 cm 处与垂直方向呈 30 切断。穗条切割方法与砧木一致，将腋芽置于芽片中部，将芽片嵌入砧木切口，用嫁接膜捆绑包扎，露出腋芽。待接穗长出新叶嫁接成活后，将嫁接部位以上砧木截断，并在截断面涂抹植物愈伤膏，防止水分养分流失，提高嫁接成活率。1.3 试验方法1.3.1 解剖结构制作与观察在嫁接后 0 8 d 内每天取样；8 20 d 内每2 天取样；20 40 d 内每 5 天取样，共取样 19 次。每次取样 3 个重复，随机选取 3 株嫁接苗为 1 重复，剪取嫁接结合部位约 1.0 cm 的茎段，立即浸入 70%FAA 固定液中，置于低温下保存备用。采用常规石蜡切片法13制作永久石蜡切片。具体操作为：将固定好的样品取出，使用10%乙二胺溶液软化，软化后用刀片切成 1 mm 的薄片。将薄片经酒精脱水后，使用体积比为 21、11、12 无水乙醇与二甲苯混合溶液以及纯二甲苯按顺序逐级透明 30 min；随后用石蜡包埋，并利用 Leica RA2235 切片机进行切片，厚度约10 m；待染色完成后置于显微镜（ZEISS Scope.A1）下观察拍照记录。1.3.2 生理指标的测定嫁接当天进行第 1 次取样，后每隔 4 d 取样，共 9 次。每次取样 3 个重复，随机取 3 5 株混合样为 1 重复。用枝剪剪取嫁接结合部位约 1.5 cm 的茎段，立即放入液氮罐中，带回实验室置于-80 超低温冰箱中保存。可溶性糖和可溶性淀粉含量采用蒽酮法14测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法15测定。过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）参考苏春丽等16的方法进行测定，过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）均采用分光光度法测定，试验所用试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。1.4 数据处理与分析利 用 Excel 2010、SPSS Statistics 26.0 软 件对试验数据进行整理分析，使用单因素方差分析（One-way Anova）比较不同时期的嫁接口生理指标有无显著性差异，并使用 Duncan（邓肯）法进行多重比较。不同时期的砧穗切口部位显微结构图使用 Photoshop CS6 软件进行制作，不同时期的各个生理指标图表使用Origin 2022软件进行绘制。2 结果与分析2.1 山苍子嫁接愈合过程中的解剖学观察2.1.1 隔离层形成期隔离层由坏死的细胞组织构成，对伤口主要起保护作用。从图 1 可看出，砧木与穗条分别在嫁接后的第 3 天（图 1A）和第 5 天（图 1B）的切口处形成层位置观察到一层颜色较深的薄层，即隔离层。2.1.2 愈伤组织形成与连接期图 1C 清晰显示，有少量不规则多边形的薄壁细胞（愈伤组织）在砧木伤口附近出现。通过观察图 1D 可知，接穗在嫁接后第 9 天观察到愈伤组织。图 1E 为山苍子嫁接后的第 12 天，砧木切口处堆积了大量杂乱排列的愈伤组织细胞，体积较大且形状不规则。图 1F 显示，愈伤组织基本填满砧木和接穗间的连接处，两者的愈伤组织薄壁细胞相互抱和，并形成愈伤组织桥。2.1.3 形成层连接期从图 1G 观察到，在嫁接后第 25 天，砧木切口部位的形成层已经分化出新的薄壁细胞组织，与接穗形成层细胞结合在一起，构成完整的形成层带，呈扭曲带状结构，此时嫁接口已经愈合。2.1.4 维管组织分化形成期由图 1H 可看出，在砧穗结合部位外围形成层处开始分化出结构完整的木质部和韧皮部。嫁接后第 35 天（图 1I），形成层向内分化出大量的木质部，且导管清晰可见。砧穗完整地连接在一起，表明嫁接体已形成一个新的个体。根据显微结构的观察结果划分山苍子嫁接愈合过程主要时期并概述各时期主要特征如下表 1。2.2 山苍子嫁接愈合过程中生理生化特性变化2.2.1 嫁接愈合过程营养物质含量动态变化嫁接口部位可溶性淀粉含量变化趋势如图 2A所示。在嫁接后第 0 天到第 5 天，可溶性淀粉含量小幅下降。在第 15 天（愈伤组织形成与连接期）缓慢上升至峰值，且此时的可溶性淀粉含量在嫁59中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷接愈合过程中最高。随后逐步下降，在第 20 天时到达最低值，此时的可溶性淀粉含量低于嫁接第 0天约 13.2%。在第 20 30 天内又出现上升趋势。第 30 40 天，可溶性淀粉含量下降至整个嫁接愈合期最低值，低于嫁接后第 15 天（最高值）约25.9%。A.嫁接后第 3 天砧木；B.嫁接后第 5 天接穗；C.嫁接后第 6 天砧木；D.嫁接后第 9 天接穗；E.嫁接后第 12 天砧木；F.嫁接后第 16 天砧穗结合体；G.嫁接后第 25 天砧穗结合体；H.嫁接后第 30 天砧穗结合体；I.嫁接后第 35 天砧穗结合体。IL.隔离层；St.砧木；Sc.接穗；Ci.愈伤组织；Ca.形成层；Ph.韧皮部；Xy.木质部；V.导管。A.stock on the third day after grafting;B.panicle on the 5th day after grafting;C.rootstock on the 6th day after grafting;D.panicle on the 9th day after grafting;E.rootstock on the 12th day after grafting;F.anvil ear combination on the 16th day after grafting;G.Rootstock ear union on the 25th day after grafting;H.anvil spike union on the 30th day after grafting;I.anvil ear combination on the 35th day after grafting;IL.Isolation layer;St.rootstock;Sc.Scion;Ci.callus;Ca,cambium;Ph.phloem;Xy.woody part;V.Catheter图 1 山苍子嫁接体砧穗显微结构Fig.1 Microstructure of L.cubeba grafts表 1 山苍子嫁接愈合过程主要时期Table 1 Main period of grafting healing for L.cubeba嫁接后天数Days after grafting/d嫁接愈合时期Grafting healing period各时期形成特征Each period of the formation of characteristics0 5隔离层形成期深色的薄层6 16愈伤组织形成与连接期形状不规则的薄壁细胞（愈伤组织桥）17 25形成层连接期扭曲带状的形成层带26 35维管组织分化形成期结构完整的木质部、韧皮部和导管图 2B 中，在第 0 10 天可溶性蛋白含量持续下降至嫁接当天的 71.43%，后在第 15 天（愈伤组织形成与连接期）出现峰值后下降，在第 25天时达到最低点，可溶性蛋白含量为嫁接当天的51.02%。此外，第40天可溶性蛋白含量达到最高点，高于最低点（第 25 天）约 112%。山苍子嫁接结合部可溶性糖含量变化趋势如图 2C 所示，第 5 天可溶性糖含量显著下降至最低点。随即在第 20 天逐步上升至峰值（形成层连接期），显著高于嫁接第 5 天，且在形成层连接期（15 20 d）可溶性糖含量与可溶性淀粉含量变化相反。嫁接后 20 25 d 可溶性糖含量显著下降。嫁接后 25 40 d 可溶性糖又持续上升，第 40 天时可溶性糖含量与第 25 天达显著差异。整个嫁接愈合过程中，第 20 天（最高值）的可溶性糖含量显著高于第 5 天（最低值）约 25.2%。2.2.2 嫁接愈合过程酶活性动态变化图 3A、图 3B 和图 3C 分别为超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性的变化趋势。图3A中，嫁接愈合初期（第05天），SOD活性呈上升趋势，随后在嫁接后第515天 SOD 活性持续下降，显著低于嫁接后第 5 天。在形成层连接时期（第 20 天）出现峰值后，在第王习政，等：山苍子嫁接愈合过程的组织解剖和生理特性60第 3 期30 天下降至整个嫁接愈合过程的最低点，第 35 天嫁接成活后，SOD 活性逐步上升，且在第 40 天时上升至最高点，高于最低点（第 30 天）15.3%。POD 活性在嫁接愈合过程中的呈“M”型变化趋势（图 3B），嫁接后缓慢上升直到 15 天出现峰值（愈伤组织形成与连接期），POD 活性呈现缓慢上升趋势。在形成层连接期（第1725天）POD 活性逐渐降低，且在第 25 天大幅下降，比第 20 天降低 73.56%。在维管组织分化形成期（第26 35 天），POD 活性呈显著上升趋势，嫁接后第35天POD活性上升至最大值，高于最小值（第25 天）约 3.18 倍。在第 35 40 天，POD 活性显著下降。如图 3C 所示，在嫁接愈合时期的前 20 d，CAT 活性在 4 10 U/mL 之间上下波动，两个峰值点（第 5 天和第 15 天）CAT 活性均显著高于第0 天、第 10 天和第 20 天，且在第 5 天的 CAT 活性显著高出嫁接当天 125.28%。随后在嫁接后的第20 25 天，CAT 活性呈小幅度上升趋势，在 25 d 达到第 3 个峰值。在维管组织分化形成期（26 35 d），CAT 活性在逐渐降低后显著上升。嫁接后第 35 天到第 40 天，CAT 活性持续升高，且在第40 天达到最高，显著高于嫁接当天（第 0 天）约 2.25 倍。图 3D 中，在隔离层形成阶段（第 0 5 天），PAL 活性呈现缓慢降低趋势，随后在嫁接后的第5 10 天，缓慢上升至与嫁接当天同一显著水平活性。在第 10 天时，PAL 活性大幅度降低，且与前 5 d（第 10 天）相比，降低约 18.7%；嫁接后第 15 20 天，酶活性缓慢上升；第 20 30 天，图中误差线上方不同小写字母表示各指标在不同时期差异达显著水平（P 0.05）。Different lowercase letters above the error line in the figure indicate that each index has significant differences in different periods(P 0.05).图 2 嫁接结合部愈合过程中营养物质含量动态变化Fig.2 Dynamic changes in nutrient content of grafting junction during the healing process图中误差线上方不同小写字母表示各指标在不同时期差异达显著水平（P 0.05）。Different lowercase letters above the error line in the figure indicate that each index has significant differences in different periods(P 0.05).图 3 嫁接结合部愈合过程中酶活性动态变化Fig.3 Dynamic changes in enzyme activity of grafting junction during healing process61中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷此时为形成层连接时期和维管组织分化时期，PAL活性急剧上升至整个愈合时期的最高水平。嫁接成活后（35 40 d），PAL 活性降至最低点，且低于最高值（第 30 天）约 31.8%。在嫁接愈合初期（第 0 10 天），PPO 活性在嫁接后 0 10 d 的变化规律为先显著上升后下降，恰好与 PAL 活性变化趋势相反。在第10 20 天期间，PPO 活性先在第 15 天（愈伤组织形成与连接期）达到低谷期，后又升高至与第 10 天同一显著水平活性（图 3E）。在形成层连接期与维管组织分化形成期阶段，（嫁接后第20 35 天），PPO 活性先大幅下降再缓慢上升后下降至最低点（第 35 天），随后在第 40 天时PPO 活性急剧增加值最高水平。3 讨论与结论3.1 讨 论3.1.1 嫁接结合部愈合过程中的解剖学观察嫁接愈合过程实际上是砧木和接穗切口结合部位通过形成隔离层与愈伤组织、形成层连接以及维管组织分化，从而结合成一个新个体的过程。王春梅等17将枫杨与核桃的嫁接愈合过程分 4 个阶段：隔离层形成期、愈伤组织形成期、形成层环形成期和维管组织分化形成期；薄壳山核桃9的芽接成活过程被划分为 5 个时期；苗丽等18认为嫁接体的愈合过程主要分为 3 个阶段：砧穗间的隔离层的形成、愈伤组织完整分化、维管束的成功连接。嫁接体在愈合过程中存在相似的解剖学特征，但其嫁接成活时间会因植物种类、年龄、嫁接方式和部位不同而存在差异。马铃薯与枸杞嫁接后第 17 天愈合完成19；核桃在芽接后第 9 天导管分化形成20；黄瓜的愈合过程在嫁接后第 15天基本结束21。本试验中，山苍子在芽接后第 35天完成愈合，根据嫁接口在愈合过程中的动态变化，将山苍子芽接愈合过程分为隔离层形成期、愈伤组织形成与连接期、形成层连接期和维管组织分化形成期 4 个时期。隔离层和愈伤组织是植物体嫁接愈合过程中的重要解剖学特征。嫁接后 0 5 d，切口处的细胞组织在酶的作用下发生氧化缩合反应，形成一层坏死的细胞组织，即隔离层。其能保护砧穗切口防止病菌感染以及水分的散失22。嫁接后 616 d，切口处形成层细胞开始分化出愈伤组织，隔离层细胞逐渐被其吸收，砧穗愈伤组织相互抱和，形成愈伤组织桥，加强砧穗连接。研究表明，愈伤组织在嫁接后形成时间越早，砧穗亲和性越强23。黄航等24发现圆齿野鸦椿隔离层和愈伤组织首次出现是在嫁接后第 3 天和第 5 天的砧木中，分别早于接穗 3 和 5 d，有利于其愈合成活。本试验中，山苍子嫁接后第 3 天和第 6 天砧木开始形成隔离层和愈伤组织，砧木愈伤组织数量高于接穗，且砧木恢复生理活动时间比接穗早，表明山苍子优树接穗与普通砧木间亲和性良好，能保证嫁接口正常愈合。多数研究表明，嫁接成活的标志是砧穗维管束组织完整连通9,25。山苍子嫁接后第 17 天，嫁接口形成层开始连接，薄壁细胞逐渐分化出新的木质部和韧皮部结构，并形成完整的形成层环。在第 26 天形成层细胞分化出新的导管，且在嫁接后第 35 天维管组织分化完成，愈合过程基本结束，嫁接体成活。随即砧木将水分与矿物质向接穗运输，确保砧穗间进行正常生理活动。3.1.2 嫁接结合部愈合过程中生理生化变化在植物嫁接愈合期间，可溶性糖与可溶性淀粉为细胞分裂和分化等生理活动提供能量，同时也能作为砧穗细胞间联系的信号交流物质，促进砧穗间相互联系26-27。本试验中，山苍子在嫁接后第 15 20 天为愈伤组织分化末期与形成层连接初期，此时需要分化出大量新的组织细胞促进形成层结构连接。在第 20 天可溶性淀粉含量出现下降，可溶性糖显著提升，说明可溶性糖在形成层连接初期被严重消耗，其浓度较低，可溶性淀粉在酶的作用下即时分解向其转化，保证砧穗形成层的完整连接。植物细胞抗氧化系统清除酶主要包括过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(POD)，可作为嫁接亲和性的判定指标23,28。本试验中三类抗氧化酶活性在嫁接后 0 5 d 呈上升趋势，由于刀片对嫁接口产生机械损伤后，植物体内抗氧化系统被激活，清除自由基能力得到提升，防止伤口受到氧化损伤。此外，多数研究表明CAT 与 POD 参与抗氧化过程的同时，通过催化细胞壁多糖物质合成，促进愈伤组织分化形成29-30。在嫁接后 15 d 时，CAT 与 POD 活性上升至峰值，结合显微观察结果显示，在嫁接第 9 天后愈伤组织细胞面积不断扩大，表明 CAT 与 POD 能共同促进砧穗嫁接口愈伤组织细胞的增殖与分化形成，且嫁接后 9 15 d 为愈伤组织分化生长的高峰时期。研究发现，CAT 能够调节过氧化氢含量，并与 POD 共同参与木质素的合成途径（脱氢聚合反应），以此调控维管组织形成分化过程31-32。嫁王习政，等：山苍子嫁接愈合过程的组织解剖和生理特性62第 3 期接后 30 35 d，CAT 与 POD 活性均处于高水平，形成层维管组织木质化速度加快，有利于砧穗切口的愈合。在植物嫁接愈合过程中，PAL 活性升高能加快细胞分化和木质化，其活性通常与嫁接成活率呈正相关11。PAL 可将苯丙氨酸催化为肉桂酸，并产生多种醇类物质（如松柏醇、芥子醇等），在酶的作用下形成木质素，促使维管组织形成32。试验结果显示，山苍子嫁接后在第 25 35 天PAL 活性较高，且第 30 天时达到顶峰，此时为维管组织分化形成期，表明 PAL 参与并促进嫁接口组织细胞木质化过程。此结果与冯金玲等33在油茶嫁接口愈合过程中 PAL 活性变化趋势一致。PPO 在嫁接愈合前期能促进隔离层的合成，同时在愈合后期参与维管组织的形成过程34。本试验中，在嫁接初期（隔离层形成期），PPO 活性迅速上升，即时促进隔离层细胞增殖分化，保护嫁接口不受外界伤害。但持续高活性的 PPO 会在嫁接口处形成大量难分解的醌类物质，砧穗无法正常连接，不利于嫁接口愈合23。在维管组织形成分化连接期，PPO 活性显著降低，在愈伤组织的作用下，隔离层逐渐消失，有利于形成层连接与维管组织分化，从而促进嫁接口的愈合。此外，嫁接口愈合过程同时受季节、光照、温度、湿度等环境因素的影响35。本次秋季嫁接试验成活率大幅低于课题组前期在同年春季的嫁接成活率。这可能由于伏秋高温干旱天气，空气湿度低，嫁接口愈合过程受到抑制，同时砧木树体蒸腾速率较快，导致幼苗极易失水，不利于嫁接成活。本研究对山苍子芽接愈合过程进行解剖学观察以及生理特性分析，为山苍子嫁接繁育技术在生产上利用推广提供理论支持。除本试验中的相关评价指标外，植物激素36、矿质元素37、酚类化合物38等因素均会对嫁接愈合过程造成影响。在后续研究中，应从上述多个角度探讨山苍子芽接愈合形成机制，推动山苍子基于嫁接技术的良种繁育的不断发展。3.2 结 论1）本试验通过对山苍子嫁接结合部进行解剖学显微观察，山苍子愈合过程在嫁接后第 35 天基本结束，主要分为 4 个时期：隔离层形成期（嫁接后 0 5 d）、愈伤组织形成与连接期（嫁接后6 16 d）、形成层连接期（嫁接后 17 25 d）和维管组织分化形成期（嫁接后 26 35 d）。2）可溶性淀粉、可溶性蛋白、POD、CAT 在嫁接后第 15 天出现峰值，SOD 可溶性糖在嫁接后第20天出现峰值，且此时PPO活性出现显著下降，表明嫁接后第 15 20 天（愈伤组织形成与连接末期和形成层连接初期）是山苍子嫁接成活的关键时期。3）可溶性淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白为嫁接愈合过程提供能量，且在可溶性糖含量不足时（嫁接后第 5、25 天），可溶性淀粉及时分解为组织细胞提供能量；POD 与 CAT 不仅具有抗氧化的功能，且在嫁接愈合后期与 PAL 和 PPO 共同参与维管组织的分化形成过程。参考文献：1 K A M L E M,M A H ATO D K,L E E K E,e t a l.Ethnopharmacological properties and medicinal uses of Litsea cubebaJ.Plants,2019,8(6):150.2 张水英,郭强,高小力,等.樟科药用植物山鸡椒的化学成分和药理活性研究进展 J.中国中药杂志,2014,39(5):769-776.ZHANG S Y,GUO Q,GAO X L,et al.A phytochemical and pharmacological advance on medicinal plant Litsea cubeba(Lauraceae)J.China Journal of Chinese Materia Medica,2014,39(5):769-776.3 谷战英,杨玲,陈昊,等.湖南省山苍子 6 个天然居群果皮精油成分分析 J.中国粮油学报,2019,34(4):87-91.GU Z Y,YANG L,CHEN H,et al.Analysis of essential oil in pericarp from 6 wild Listea cubeba populations in Hunan provinceJ.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2019,34(4):87-91.4 WANG Y S,WEN Z Q,LI B T,et al.Ethnobotany,phytochemistry,and pharmacology of the genus Litsea:an updateJ.Journal of Ethnopharmacology,2016,38(181):66-107.5 张爱华,唐春艳,胡楠,等.我国山苍子产业发展现状及对 策 J.生物质化学工程,2020,54(6):2