宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第7期2023年7月Vol.45，No.7Jul.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202302002宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究刘晓萌，苏文强，郑永辉，李苏楠*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨150069)摘要：严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后，S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别，并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响，本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段，并分别克隆至pCAGGS载体中，构建重组质粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag，均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞，48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T；利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系，并均经western blot鉴定。结果显示，上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、RRRR、SRAS和AAAA质粒分别转染HEK293T细胞，24 h后利用western blot检测S蛋白的表达。将pRRAR-Flag和pFurin-His共转染HEK293T细胞；同时将pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞，24 h后利用western blot检测上述两种细胞中S蛋白的表达。结果显示，转染pRRAR-Flag的细胞中检测到S蛋白和S2亚基的表达，即Furin能够切割S蛋白，但转染pAAAA-Flag和pSRAS-Flag的细胞中均检测不到S2亚基的表达，转染pRRRR-Flag的细胞中S2亚基的表达量增加。与仅转染pRRAR-Flag的对照细胞相比，在HEK293T细胞中共转染pFurin-His和pRRAR-Flag能够显著增加S蛋白切割为S2亚基的量；而在Furin-KO细胞中未检测到S2亚基的表达。采用假病毒系统包装Furin裂解位点RRAR及其突变体(SRAS、AAAA)的假病毒SARS-CoV-2；利用HEK293T和Furin-KO细胞包装SARS-CoV-2假病毒，通过计算荧光素酶活性Luc与各病毒p24蛋白含量的比值比较不同假病毒对Huh7-A+T细胞及内源性Furin对两种细胞包装的假病毒的相对感染性。结果显示，与pRRAR-Flag及HEK293T细胞包装的假病毒相比，pSRAS-Flag和pAAAA-Flag及Furin-KO细胞包装的假病毒对Huh7-A+T细胞的感染性均极显著降低(0.01)。将质粒pEGFP-RRAR、pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA与pEGFP-Furin分别转染HeLa细胞，24 h后经激光共聚焦显微镜观察Furin蛋白和S蛋白在细胞中的定位；将前4种质粒与表达Furin-His的质粒共转染HeLa细胞，24 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测Furin蛋白和S蛋白及其突变体在细胞中共定位。观察结果可见，Furin蛋白主要位于细胞浆中，S蛋白与Furin裂解位点突变的S蛋白均位于细胞膜；IFA结果显示，Furin与S蛋白及Furin裂解位点突变为RRRR的S蛋白在细胞浆中均存在共定位，但与Furin裂解位点突变为AAAA的S蛋白不存在共定位。将pRRAR-Flag、pSRAS-Flag分别与pCAGGS-mCherry共转染HEK293T细胞，同时利用细胞示踪剂(CMFDA)预处理Huh7-A+T细胞1 h后将两种细胞混合培养，24 h后观察结果显示，共转染pRRAR-Flag和pCAGGS-mCherry的HEK293T中出现明显的合胞体，而当Furin裂解位点突变为SRAS时，合胞体的形成明显减少。本研究首次证实Furin在细胞浆中对S蛋白预切割，且将S蛋白的Furin裂解位点突变为SRAS后能够降低SARS-CoV-2的感染性和细胞合胞体的形成能力。本研究为新冠疫情的防治提供新思路。关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2；弗林蛋白酶；刺突蛋白；S2亚基切割；共定位中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)07-0672-10收稿日期：2023-02-08基金项目：国家自然科学基金(32172836)；黑龙江省博士后科研启动金资助项目(LBK-Q21050)作者简介：刘晓萌(1997-)，女，河南新乡人，硕士研究生，主要从事囊膜病毒和宿主互作机制的研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorSARS-CoV-2 spike protein cleavage with Furin protease in host cellLIU Xiao-meng,SU Wen-qiang,ZHENG Yong-hui,LI Su-nan*(State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China)Abstract:After the binding of the S protein of Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2(SARS-CoV-2)to the hostsurface receptor ACE2,the RRAR sequence in the S protein is recognized by the Furin protease(Furin)in the host cell,and the Sprotein is cut from the Furin cleavage site into S1/S2 subunits.In order to study the effect of Furin on the cleavage activity ofSARS-CoV-2 S protein,the infectiveness of the virus and the formation of syncytial cells,in this study,a nested PCR was used toexpand the coding gene fragments of the Furin cleavage site mutation encoding S protein(the cleavage site was mutated fromRRAR to RRRR,SRAS and AAAA,respectively).Recombinant plasmids pPRRR-Flag,pSRAS-Flag and pAAAA-Flag wereconstructed and identified by both enzyme digestion and sequencing.And then,pEGFP-RRRR,pEGFP-SRAS and pEGFP-AAAAplasmids were constructed and confirmed by sequencing.HEK293T cells were packaged with lentivirus system to infect Huh7cells.After 48 hours,blasticidin was used to screen Huh7 cells that co-expressed ACE2 and TMPRSS2.Furin-knockout cell lines(Furin-KO)were constructed using CRISPR-Cas9 method and identified by western blot.The results showed that the above twokinds of cells were correctly constructed.The plasmids expressing RRAR,RRRR,SRAS,AAAA and fusion with Flag weretransfected into HEK293T cells,respectively,and the expressed S protein was detected by western blot 24 hours later.HEK293Tcells were transfected with pRRAR-Flag and pFurin-His,respectively.At the same time,pRRAR-Flag was transfected intoHEK293T and Furin-KO cells,respectively.Twenty-four hours later,western blot was used to detect the effect of cells thatoverexpressed or knocked out endogenous Furin on S protein cleavage.The results showed that the expression of S protein and S2subunit could be detected in all cells transfected with pRRAR-Flag,that is,Furin could cut S protein.However,the expression ofS2 subunit was not detectable in the cells transfected with pAAAA-Flag and pSRAS-Flag,and the expression of S2 protein wasincreased in the cells transfected with pRRRR-Flag.Compared with the control cells transfected with pRRAR-Flag only,co-transfection of pFurin-His and pRRAR-Flag in HEK293T cells significantly increased the amount of S protein cleaved to S2subunit.The expression of S2 protein was not detectable in Furin-KO cells.Furin cleavage site RRAR and SARS-CoV-2pseudoviruses mutated at this cleavage site(SRAS,AAAA)were packaged in a pseudovirus system.The relative infectivity ofdifferent pseudoviruses to Huh7-A+T cells was compared by calculating the ratio of luciferin activity Luc to the p24 contents ofeach virus.HEK293T and Furin-KO cells were used to package SARS-CoV-2 pseudovirus,and the effect of endogenous Furin onthe infection of the pseudovirus was detected.The results showed that compared with pRRAR-Flag packaged pseudoviruses,theinfectiveness of pSRAS-Flag and pAAAA-Flag pseudoviruses to Huh7-A+T cells was significantly decreased(0.01).Theinfectiveness of the pseudovirus packaged in Furin-KO cells was also significantly lower than that in HEK293T cells(0.01).Theplasmid pEGFP-RRAR,pEGFP-RRRR,pEGFP-SRAS,pEGFP-AAAA and pEGFP-Furin were co-transfected into HeLa cells,respectively,and the localization of Furin and S proteins in the cells was observed by confocal laser microscope 24 hours later.HeLa cells were co-transfected with the first four plasmids and the plasmid expressing Furin-His.Twenty-four hours later,theco-localization of Furin and S proteins as well as their mutants were detected by indirect immunofluorescence assay(IFA).Theresults of confocal laser microscopy showed that the Furin protein was mainly located in the cytoplasm,and the S proteins andtheir mutated at the Furin cleavage site were located in the cell membrane.IFA results showed that Furin and S protein,as well asS protein with Furin cleavage site mutation to RRRR,have significant co-localization in the cytoplasm,but there is noco-localization with the S protein mutated to AAAA at the Furin cleavage site.HEK293T cells were transfected with pRRAR-Flag,pSRAS-Flag and pCAGGS-mCherry,respectively,and Huh7-A+T cells were pretreated with cell tracer(CMFDA)for 1 hour,andthe two cells were mixed and cultured 24 hours later.HEK293T co-expressing pRRAR-Flag and pCAGGS-mCherry showedsignificant cell-cell fusion,while the formation of cell-cell fusion was significantly reduced when the Furin cleavage site wasmutated to SRAS,This study demonstrated for the first time that S protein precleaves with Furin in cytoplasm and mutates theFurin cleavage site of S protein to SRAS can reduce SARS-CoV-2 infectivity and the formation ability of cell syncytium.This刘晓萌，等.宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究第7期673由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的2019年新型冠状病毒肺炎(COVID-19)自暴发以来呈大流行趋势，截止到2023年2月2日，约675491 566人被 感染，6 764 989人 死亡(https:/www.worldometers.info/coronavirus/)1。SARS-CoV-2编码的刺突蛋白(Spike protein，S)属于I型膜融合蛋白，除插入到病毒粒子中并介导病毒侵入之外，S蛋白还存在于感染细胞膜表面，诱导相邻的细胞-细胞膜融合形成合胞体2-5。S蛋白由3个相同单体形成同源三聚体结构，每个单体包含S1和S2亚基，S1亚基负责与宿主细胞膜表面的受体ACE2结合6，S2亚基介导病 毒 与 细 胞 的 融 合 过 程7。与SARS-CoV相 比，SARS-CoV-2 S蛋白插入了R682RAR引685(引：切割位点)，使得该病毒对S蛋白切割为S1/S2亚基的活性明显增强，且在S蛋白成熟并组装到病毒粒子的过程中，宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)在S蛋白合成过程中预切割S蛋白中的Furin裂解位点(切割为S1/S2亚基)，产生的S1亚基和S2亚基通过非共价的方式结合后，可以降低病毒侵入宿主细胞过程中对宿主蛋白酶的需求，促进SARS-CoV-2的侵入8-9。Furin属于前体蛋白转化酶(PC)家族，能够识别病毒S蛋白中Furin裂解位点RRAR氨基酸序列并切割。Furin在真核生物体内广泛存在且保守，主要位于细胞的高尔基体内，能够在病毒组装及侵入过程中切割S蛋白10-11。目前研究发现敲除Furin基因能够降低SARS-CoV-2的 感染 性，减少 丝氨 酸 蛋 白 酶(TMPRSS2)依赖的合胞体的形成12。然而，Fruin如何通过切割S蛋白为S1/S2亚基进而影响SARS-CoV-2的感染和细胞-细胞之间的传播目前尚不清楚13-14。全球各国都在积极开发治疗COVID-19的特效药物以及疫苗，但目前SARS-CoV-2的具体致病和分子机制仍不清楚。本研究通过构建不同Furin裂解位点突变的S蛋白表达质粒和Furin基因敲除细胞系，从各方面探究宿主细胞Furin对S蛋白S1/S2位点切割、病毒的感染性和细胞膜融合作用的影响，为进一步了解宿主细胞Furin在SARS-CoV-2感染过程中的功能及研发抑制Furin位点切割病毒S蛋白的药物提供思路。1材料与方法1.1主要实验材料人胚胎肾细胞(HEK293T)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(Huh7)、人免疫缺陷病毒型(HIV-1)前病毒质粒pNL4-3、慢病毒过表达 载 体Lenti-ACE2、Lenti-TMPRSS2、辅 助 质 粒psPAX2、pCDNA3.1-VSV-G、pCAGGS-3Flag、pCAGGS-mCherry、表 达Furin的 质 粒pCAGGS-Furin-His和pEGFP-Furin均由本实验室保存。融合表达EGFP和CRISPR-Cas9的质粒pX458购自Addgene公司；C端融合表达Flag标签的S基因由吉林省库美生物科技有限公司合成，由本实验室克隆至pCAGGS和pEGFP-N1载体中，构建重组质粒pS-Flag和pEGFP-S。RIPA裂解液、HRP标记的鼠源Flag单克隆抗体(MAb，Flag-HRP)、HRP标记 的鼠 源HA(HA-HRP)MAb均 购 自Sigma公 司；HRP标 记 的 鼠 源actin(actin-HRP)MAb和兔源Furin多克隆抗体(pAb)购自武汉三鹰公司；鼠源ACE2 pAb购自Santacruz公司；兔源TMPRSS2 pAb购自Proteintech公司；聚乙烯亚胺转 染 试 剂(Polyethylenimin，PEI)购 自Polyscience公司；Lipofectamine 3000(Lip3000)转染试剂、杀稻瘟菌 素(Blasticidin HCL)和CMFDA细 胞 示 踪 剂 购 自Thermo公司；Alexa-Flour-647标记的羊抗鼠IgG购自Invitrogen公司；兔源S2 pAb和HIV-1衣壳蛋白p24ELISA检测试剂盒购自义翘神州公司；HRP标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和羊抗兔HRP-IgG均购自Jack-son公司；萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promage公司；PVDF膜购自Merck-Millipore公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；质粒大提试剂盒和细胞/组织基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、0.25%胰酶、Opti-MEM和DMEM均购自Gibco公司。1.2引物的设计与合成以合成的SARS-CoV-2 S蛋白基因序列为模板，采用SnapGene软件设计3对S基因2 044 bp2 055 bp处Furin裂解位点(aa682aa685)精氨酸(Arg，R)-R-丙氨酸(Ala，A)-R突变的套式PCR扩增引物(表1)：即将RRAR的A突变为R得到RRRR突变体的编码基因序列、第一位的R与A突study provides new ideas for the prevention and treatment of COVID-19.Key words:SARS-CoV-2;Furin;spike protein;S2 cleavage;co-localization中 国 预 防 兽 医 学 报2023年674变为丝氨酸(Ser，S)得到SRAS突变体的编码基因序列和将R均突变为A得到AAAA突变体的编码基因序列的扩增引物。根据pCAGGS载体采用SnapGene软件设计引物pCAGGS-R/E I-R用于配合上述3对S基因引物用于Furin裂解位点突变的套式PCR扩增(表1)。CRISPR/Cas9是一种快速有效的基因编辑工具，它在识别DNA时需要靶基因序列下游有一个特定的序列，称为PAM，在NCBI下载Furin基因序列(NM_002569.4)，利用CRISPR-Cas9分析网站CHOP-CHOP分析Furin基因，选择特异性强且末端含有PAM结构的20个碱基作为sgRNA序列(表1)；同时采用软件SnapGene设计Furin基因鉴定引物Furin-F/R。上述引物及sgRNA均由吉林省库美生物科技有限公司合成。1.3重组质粒的构建与鉴定以pS-Flag为模板，以pCAGGS-R I-F为 上 游 引 物，分 别 以AAAA-R、SRAS-R、RRRR-R为下游引物经第一轮PCR扩增获得产物1；分别以AAAA-F、SRAS-F、RRRR-F为上游引物，以pCAGGS-E I-R为下游引物经PCR扩增获得产物2；第二轮以第一轮获得的PCR产物1和2为模板，以pCAGGS-R I-F、pCAGGS-E I-R为引物经PCR扩增即获得Furin裂解位点突变体(RRRR、SRAS、AAAA)的S蛋白编码基因片段，并分别克隆至pCAGGS中 构 建 重 组 质 粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag，并均经R I、I酶切鉴定正确后，将上述Furin裂解位点已突变的S蛋白编码基因片段分别克隆至pEGFP-N1载体，构建重组质粒pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA；采 用T4连接酶将Furin-sgRNA克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-Furin-sgRNA，上述重组质粒均由吉林库美生物科技有限公司测序鉴定。1.4共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系的构建与鉴定SARS-CoV-2通过识别宿主ACE2受体侵入细胞，并且TMPRSS2能够显著提高病毒的侵入效率，因此构建共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系用于后续假病毒感染实验。采用PEI转染试剂分别将慢病毒表达载体Lenti-ACE2、Lenti-TMPRSS2、辅助质粒psPAX2 含有BSD基因，BSD基因所表达的蛋白对杀稻温菌素Blasticidins HCL具有抗性，表达该蛋白时，细胞能够在含Blasticidins HCL的培养基中正常生长及pCDN3.1-VSV-G共转染HEK293T细胞包装慢病毒。48 h后收集慢病毒上清液感染Huh7细胞，12 h后补加新鲜培养基，48 h后利用含Blasti-cidins HCL的培养基筛选阳性单克隆细胞，未感染慢病毒的Huh7细胞由于不能表达BSD抗性基因在含Blasticidins HCL的培养基中死亡。经过多次传代培养，待细胞在含Blasticidins HCL的培养基中能够稳定生长后即获得Huh7-A+T细胞，采用预冷的RIPA于4裂解Huh7与Huh7-A+T细胞20 min后，12 000 r/min离心10 min，取上清加入Loading Buffer，煮沸10 min后取上清，分别以鼠源ACE2 pAb(1颐2 000)和兔源TMPRSS2 pAb(1颐1 000)为一抗4孵育过夜，以羊抗鼠IgG-HRP(1颐5 000)和羊抗兔HRP-IgG(1颐5 000)做为二抗室温孵育2 h，以鼠源actin-HRP MAb(1颐10 000)为内参，4孵育过夜，经western blot检测Huh7-A+T细胞中ACE2与TMPRSS2蛋白的表达。1.5Furin基因敲除(Furin-KO)细胞系的构建与鉴定利用转染试剂PEI将pMD19-T-Furin-sgRNA+pX458共转染HEK293T细胞，24 h后采用纳米流式细胞仪分选表达绿色荧光蛋白的Furin-KO细胞系。采用细胞/组织基因提取试剂盒提取细胞基因组并作为模板，以表1中的Furin-F/R引物经PCR扩增，并由吉林库美生物科技有限公司测序鉴定。按照1.4的方法获得细胞蛋白，以兔源Furin pAb(1颐1 000)为一抗4孵育过夜，羊抗兔IgG-HRP(1颐5 000)为二抗室温孵育2 h，以鼠源actin-HRP MAb(1颐10 000)为内参，4孵育过夜，利用western blot检测细胞中Furin的表达。1.6Furin裂解位点突变对S蛋白切割影响的west-ern blot检测利用转染试剂PEI将重组质粒pRRAR-Flag、pRRRR-Flag、pSRAS-Flag和pAAAA-Flag分别转染6孔板中生长密度达60%70%的HEK293T细胞，24 h后利用1.4方法获得细胞蛋白。分别以鼠源Flag-HRP MAb(1颐20 000)及 鼠 源actin-HRP MAb表1本研究用到的引物及sgRNA序列sgRNA and primersFurin-FFurin-RAAAA-FAAAA-RRRRR-FRRRR-RSRAS-FSRAS-RpCAGGS-R I-FpCAGGS-E I-RFurin-sgRNASequence(5-3)ATCGAGGAGTGACGAAGCGGTTCCTCCATCCAAGAGCTCATACCCAGACCAACTCCCCCGCCTCCGTGGCCTCCCAGTCTGGACTGGGAGGCCACGGAGGCGGGGGAGTTGGTCTGGACCCAGACCAACTCCCCCCGTCGTCGACGCTCCGTGGCCTCCCAACTGGGAGGCCACGGAGCGTCGACGACGGGGGGAGTTGGTCTGGCCCAGACCAACTCCCCCTCACGCGCCTCATCCGTGGCCTCCCAGTCCAGACTGGGAGGCCACGGATGAGGCGCGTGAGGGGGAGTTGGTCTGGGTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGTTCGTGTTCCTGGTGCTGTCGTCCTTGTAGTCTCCGGAGGTGTAGTGCAGCTTCACGCGACTAAACGGGACGTGTACC刘晓萌，等.宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究第7期675图1S蛋白中Furin裂解位点突变质粒的酶切鉴定结果5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp(1:10 000)4孵育过夜，利用western blot检测细胞内S蛋白的表达情况，分析Furin裂解位点突变对S蛋白切割的影响。1.7过表达或者敲除Furin对S蛋白切割影响的western blot检测为了检测内源性Furin蛋白对S蛋白切割的影响，利用PEI将重组质粒pRRAR-Flag+pCAGGS-3Flag(阴性对照)和pRRAR-Flag+pCAGGS-Furin-His分别共转染HEK293T细胞；将pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞，24 h后按照1.4方法获得两组试验的细胞蛋白，分别以Flag-HRPMAb(1颐20 000)及鼠源actin-HRP MAb(1颐10 000)4孵育过夜，利用western blot检测过表达或者敲除内源性Furin对S蛋白切割的影响。1.8S蛋白 Furin裂解位点及其突变体对 SARS-CoV-2假病毒感染性影响的荧光素酶试验利用PEI将HIV-1前 病 毒 质 粒pNL4-3分 别 与pRRAR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag共转染HEK293T细胞，以包装SARS-CoV-2假病毒；将pNL4-3+pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞以包装假病毒。转染48 h后分别收集上述两种不同类型的假病毒上清液，利用夹心ELISA检测试剂盒检测各病毒中p24蛋白含量。同时将含不同病毒的上清液感染Huh7-A+T细胞，48 h后弃上清，利用萤火虫荧光素酶试剂盒中的裂解液裂解细胞并加入检测底物，使用多功能酶标仪检测Huh7-A+T细胞中的荧光素酶活性(Luc)。通过计算Luc/p24的比值得到不同SARS-CoV-2假病毒对Huh-A+T细胞的相对感染性。1.9Furin与S蛋白及其突变体在细胞中的定位及共定位的激光共聚焦试验利用转染试剂Lip3000将质粒pEGFP-RRAR、pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA和pEGFP-Furin分别转染HeLa细胞，24 h后以DARI染核，利用高分辨率活细胞共聚焦显微镜观察Furin蛋白及不同S蛋白在细胞中的定位。利用Lip3000将 质 粒pEGFP-RRAR+pCAGGS-Furin-His(对 照)、pEGFP-RRRR+pCAGGS-Furin-His、pEGFP-AAAA+pCAGGS-Furin-His共转染HeLa细胞，24 h后以鼠源Flag MAb(1颐1 000)为一抗，Alexa-Flour-647标记的山羊抗鼠IgG(1颐500)为二抗，DAPI染核后，经间接免疫荧光试验(IFA)使用高分辨率活细胞激光共聚焦显微镜观察细胞内Furin蛋白和Furin裂解位点突变S蛋白的共定位。1.10S蛋白Furin位点突变对S蛋白介导的膜融合(合胞体)形成影响的检测利用PEI将pRRAR-Flag、pSRAS-Flag分别与pCAGGS-mecherry共转染HEK293T细胞。6 h后采用胰酶消化细胞并于4、1 000 r/min离心5 min弃胰酶；同时利用细胞示踪剂(CMFDA)预处理Huh7-A+T细胞1 h，再将两种细胞1颐1混合培养于6孔板中，24 h后使用倒置荧光显微镜观察两种细胞的融合情况。1.11统计学分析本研究采用SPSS软件处理所有实验数据，所有试验至少重复3次，结果以 依 表示。利用SPSS中的配对双尾 检验统计分析各组实验数据。*：0.05，表示差异显著；*：0.01、*：0.001均表示差异极显著。2结果2.1重组质粒的构建与鉴定结果以pS-Flag为模板，采用套式PCR分别扩增Furin裂解位点RRAR突变的S蛋白编码基因序列，并分别克隆至pCAGGS中，构建重组质粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag、pRRRR-Flag。利用R I、I酶切鉴定并测序，结果显示，各重组质粒均出现3819 bp的目的片段和4 755 bp的载体片段(图1)；测序结果显示插入的各目的基因片段均正确。表明上述重组质粒均正确构建。将RRAR突变为SRAS、RRRR、AAAA的S蛋白编码基因片段分别克隆至pEGFP-N1载体中，构建重组质粒pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA；将Furin-sgRNA克隆至pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19-T-Furin-sgRNA。上述质粒的测序结果显示，插入的Furin裂解位点突变为SRAS、RRRR、AAAA的S蛋白编码基因序列和Furin-sgRNA序列均正确，表明正确构建上述重组质粒。中 国 预 防 兽 医 学 报2023年676图4Furin裂解位点突变对S蛋白切割影响的western blot鉴定结果S茁-actinS2刘晓萌，等.宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究第7期677*：0.001A：Huh7-A+T细胞中ACE2蛋白表达的检测及ACE2条带的灰度分析；B：Huh7-A+T细胞中TMPRSS2蛋白表达的检测及TMPRSS2条带的灰度分析A:Detection of ACE2 expression in Huh7-A+T and analysis of theintensity of ACE2 bands;B:Detection of TMRPSS2 expression inHuh7-A+T and analysis of the intensity of TMPRSS2 bands图2共表达ACE2和TMPRSS2细胞系的western blot鉴定结果151050151050ACE2茁-actinTMPRSS2茁-actinABA：Furin-KO细胞中Furin基因的测序结果；B：Furin-KO细胞中Furin蛋白的表达结果A:Sequencing results for Furin gene in Furin-KO cell line;B:Expression of Furin in Furin-KO cell line图3Furin-KO细胞系的构建与鉴定结果茁-actinFurinAB2.2共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系的鉴定结果将Lenti-ACE2、Lenti-TMPRSS2、psPAX2及pCDN3.1-VSV-G共转染HEK293T细胞，48 h后收集慢病毒上清液感染Huh7细胞，48 h后采用Blasti-cidins HCL筛选单克隆细胞，并通过western blot鉴定。结果显示，与对照Huh7细胞相比，筛