一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性.pdf

植物研究 2024，44（1）：118 131Bulletin of Botanical Research一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性刘亚洁1 安黎哲2，3*（1.兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室/农业农村部草牧业创新重点实验室/草地农业教育部工程研究中心/草地农业科技学院，兰州 730020；2.兰州大学生命科学学院，兰州 730000；3.北京林业大学生态与自然保护学院，北京 100083）摘 要 为探究油菜素内酯（BRs）诱导提高植物的抗寒性是否受一氧化氮（NO）信号分子调控，以高山离子芥（Chorispora bungeana）悬浮细胞为材料，分别用24-表油菜素内酯（EBR）、NO供体SNP、NO清除剂PTIO、一氧化氮合成酶（NOS）抑制剂L-NAME、EBR+PTIO以及EBR+L-NAME进行处理，分析在低温胁迫下以上处理对细胞抗寒性、活性氧（ROS）水平以及抗氧化防御系统的影响。结果表明：（1）外源EBR处理可以缓解低温胁迫对悬浮细胞活力的抑制以及离子渗漏和膜脂过氧化程度的加剧，从而增强细胞对低温的抗逆能力。SNP处理对上述生理指标的影响与EBR类似。（2）在低温胁迫下，与EBR处理细胞相比，EBR+PTIO以及EBR+L-NAME处理会导致悬浮细胞活力下降，离子渗漏和膜脂过氧化程度显著升高，表明阻断NO信号会降低EBR诱导提高的抗寒性。（3）与仅受低温胁迫的细胞相比，外源EBR处理导致细胞NO含量和NOS活性进一步升高，而EBR诱导的NO积累可以被PTIO或L-NAME所抑制。（4）EBR、SNP处理均可以明显抑制低温胁迫下离子芥悬浮细胞过氧化氢（H2O2）含量、超氧阴离子（O2）产生速率和羟自由基（OH-）含量的升高，并显著增强抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及增加抗坏血酸（AsA）和还原性谷胱甘肽（GSH）的含量，从而缓解低温造成的氧化损伤，而PTIO、L-NAME会不同程度抑制低温胁迫下EBR的这些保护功能。综上所述，EBR通过激活离子芥悬浮细胞的NOS活性来促进细胞内源NO积累，从而提高其抗寒性。EBR处理可以抑制低温胁迫下ROS过量积累并增强细胞的抗氧化防御能力，这 两个过程都受NO信号分子调控，从而缓解低温造成的氧化损伤，防止膜脂过氧化程度加剧，提高细胞对低温胁迫的抗逆性。因此，低温胁迫下，高山离子芥悬浮细胞NOS来源的NO是EBR信号转导的下游信号分子。关键词 油菜素内酯；一氧化氮；高山离子芥；抗寒性；活性氧；抗氧化防御系统中图分类号：Q945.78 文献标志码：A doi：10.7525/j.issn.1673-5102.2024.01.014Nitric Oxide Mediates Brassinosteroids-induced Chilling Tolerance in Chorispora bungeana Suspension Cultured CellsLIU Yajie1 AN Lizhe2，3*（1.State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems/Key Laboratory of Grassland Livestock Industry Innovation，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Engineering Research Center of Grassland Industry，Ministry of Education/College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020；2.School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000；3.School of Ecology and Nature Conservation，Beijing Forestry University，Beijing 100083）Abstract In order to investigate whether brassinosteroids（BRs）-induced chilling tolerance is regulated through nitric oxide（NO）signaling molecule，the suspension cultured cells of Chorispora bungeana were treated with 24-epibrassinolide（EBR），NO donor SNP，NO scavenger PTIO，nitric oxide synthase（NOS）inhibitor L-NAME，EBR+PTIO and EBR+L-NAME respectively，and the effects of the above treatments on 基金项目：国家杰出青年基金资助项目（30625008）。第一作者简介：刘亚洁（1981），女，实验师，博士，主要从事种子检验及植物逆境生理学研究。*通信作者：E-mail：。收稿日期：2023年4月18日。刘亚洁等：一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性1 期chilling tolerance，reactive oxygen species（ROS）levels and antioxidant defense system were analyzed in the cells under low temperature stress.The results showed that：（1）exogenous EBR treatment enhanced chilling tolerance in the suspension cultures and alleviated the inhibition of cell viability and aggravations of ion leakage and membrane lipid peroxidation induced by low temperature.The effects of SNP treatment on the above physiological measures were similar to those of EBR.（2）Application of PTIO or L-NAME in combination with EBR significantly decreased cell viability and increased ion leakage and membrane lipid peroxidation in C.bungeana suspension cultures under chilling stress compared with those of EBR treatment alone，suggesting that the block in NO signaling decreased the EBR-enhanced chilling tolerance.（3）EBR treatment further increased NO production and NOS activity in the suspension cells compared with those under chilling stress alone，whereas the EBR-induced NO signal was quenched by the addition of PTIO or L-NAME.（4）Both EBR and SNP obviously inhibited the increases in hydrogen peroxide（H2O2）content，superoxide radical（O2）production rate and hydroxyl radical（OH-）content caused by chilling，and remarkably enhanced the activities of ascorbate peroxidase（APX），catalase（CAT），glutathione reductase（GR），peroxidase（POD）and superoxide dismutase（SOD）and contents of ascorbate（AsA）and glutathione（GSH）in the suspension cultured cells，thus alleviating oxidative injury caused by low temperature.However，PTIO and L-NAME blocked the protective effects of EBR.In conclusion，these results suggested that EBR-induced chilling tolerance in C.bungeana suspension cultured cells was through the promotion of NO accumulation by activating NOS activity.EBR might confer an increased tolerance to chilling stress by suppressing the accumulation of ROS caused by chilling and enhancing antioxidant defense system in the suspension cells，both of which were partially regulated by NO signal，resulting in the alleviation of chilling-induced oxidative damage and membrane lipid peroxidation.Thus，NOS-derived NO might be a downstream signaling molecule of EBR signal in C.bungeana suspension cultured cells under low temperature stress.Key words brassinosteroids；nitric oxide；Chorispora bungeana；chilling tolerance；reactive oxygen species；antioxidant defense system低温是限制植物分布、生长、发育和降低农作物产量的最为严重的胁迫因子之一1。植物可以通过改变其细胞代谢和激活各种防御机制响应和适应低温。低温诱导植物体内产生过量的活性氧（ROS），包括过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O2）和羟自由基（OH-）2，过量产生的ROS可导致膜脂过氧化程度加剧、DNA损伤和蛋白质变性，也就是氧化损伤1，3。低温胁迫造成的氧化损伤是植物敏感组织响应低温的最初反应，也是造成低温损伤的一个重要因素3。植物体内有效清除ROS，修复氧化损伤的保护机制是抗氧化防御系统，它包括酶促和非酶促防御系统两类。酶促防御系统包括各种抗氧化酶如抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等。非酶类抗氧化剂包括脂溶性抗氧化剂（维生素E、类胡萝卜素）和水溶性抗氧化剂 抗坏血酸（AsA）、还原性谷胱甘肽（GSH）2。诸多研究表明植物抗低温胁迫能力的增强通常与抗氧化防御能力的提高密切相关，这对清除过量的ROS和修复低温造成的氧化损伤具有重要作用3-4。因此开展植物低温胁迫响应机制的研究及预防低温对植物造成伤害具有重要意义。油菜素内酯（BRs）是一类甾醇类植物激素，在植物界中普遍存在，其中24-表油菜素内酯（EBR）是使用最多、用途最广泛的一种。BRs可以增强植物对低温、干旱、盐、高温、金属离子和病原体侵染等各种非生物和生物胁迫的抗逆性，特别是在缓解低温对植物造成的损伤以及提高植物耐冷性方面表现出良好效果2，5-6。研究表明，BRs提高植物抗寒性与其提高细胞膜稳定性，调节光合作用以及增强细胞的渗透调节能力有关6-9。BRs还可以通过影响植物膜脂脂肪酸的组成及不饱和程度来调节其对低温胁迫的响应10-11。一氧化氮（NO）是一种具有生物活性的小分子气体自由基，它可以自由扩散透过细胞膜，参与调控植物生长发育的许多过程，如种子的萌发和休眠、植物组织的生长和发育、光形态建成、植物11944 卷植物研究细胞的成熟和衰老、开花、气孔关闭以及程序性细胞凋亡等12-14。在植物对各种生物及非生物胁迫的响应过程中，如干旱、盐、极端温度、紫外辐射、机械损伤、除草剂、臭氧、重金属以及病原体侵袭，NO作为一个重要的信号分子发挥调节功能，缓解逆境造成的损伤，提高其抗逆性13-15。已有研究证实NO通过参与渗透调节、维持细胞膜的完整性以及 提 高 抗 氧 化 酶 活 性 等 增 强 植 物 的 抗 寒 能力3-4，16。植物细胞内NO的产生主要有以下途径，即类似于哺乳动物一氧化氮合酶（NOS）、硝酸还原酶（NR）、其他酶促反应如亚硝酸还原酶和黄嘌呤氧化酶以及非酶促反应12，15。此外，NO在植物激素如生长素、细胞分裂素、脱落酸等调控的生理反应中发挥重要作用12-14，然而，作为第六大类植物激素，BRs增强植物抗寒性是否与NO信号分子有关的研究鲜见报道，NO在BRs调控植物响应低温胁迫中的作用机理及信号路径尚不明确。高山离子芥（Chorispora bungeana）是十字花科（Brassicaceae）离子芥属（Chorispora）的高山冰缘多年生草本植物，和模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）有较高同源性，是低温逆境生理学研究的理想材料17。本研究以高山离子芥悬浮细胞作为一个未分化的、均一的、相对脆弱的植物细胞模型，通过用NO清除剂PTIO以及NOS抑制剂L-NAME进行处理，研究在NO信号阻断的情况下BRs对细胞抗寒程度、ROS水平和抗氧化防御系统的影响，阐明 NO 信号分子是否与 BRs 提高细胞抗寒性、BRs在低温胁迫下调节ROS水平以及抗氧化防御有关，从而揭示BRs诱导提高植物抗寒性的信号转导机制。1 材料与方法1.1试验材料与设计高山离子芥取材于新疆天山乌鲁木齐河源区（4346 N，8715 E，海拔3 700 m），悬浮细胞的培养参照Guo等18的方法。为探究低温胁迫下BRs对高山离子芥悬浮细胞抗寒性的影响，将培养好的处于指数生长期的同一批材料转接于 0.01、0.10、1.00 mol L-1 EBR和不加EBR的MS液体培养基中，随后置于光照培养箱中 25、4、0 摇床培养处理 3 d，摇床转速为120 r min-1。处理结束后，用双层筛网（400目）过滤细胞，并用蒸馏水清洗3遍，用滤纸吸干表面水分，鲜样称取质量，测定相关生理指标。为了探究BRs对高山离子芥抗寒性的影响是否受NO信号分子调控，将悬浮培养好的处于指数生长期的同一批材料转接于加入不同化学试剂的MS液体培养基中进行处理。这些处理包括：（1）灭菌水；（2）0.1 mol L-1 EBR；（3）100 mol L-1 SNP（硝普钠，外源 NO 供体）；（4）0.1 mol L-1 EBR+100 mol L-1 PTIO；（5）0.1 mol L-1 EBR+300 mol L-1 L-NAME；（6）100 mol L-1 PTIO；（7）300 mol L-1 L-NAME。随后将这些处理的悬浮细胞分为3组，一组在光照培养箱中25 培养，而另外两组分别置于4 和0 低温培养箱中，摇床培养3 d，以不加任何化学试剂处理并培养于25 的细胞作为对照。处理结束后收集细胞测定相关指标。1.2测定指标与方法1.2.1相对细胞活力测定细胞活力的主要生理指标是氯化三苯四氮唑（TTC）还原能力18。0.2 g细胞中加入0.4%TTC溶液和100 mmol L-1磷酸钠缓冲液（pH=7.0）于25 下避光反应13 h，弃去上清液，用蒸馏水洗涤细胞3次后，再加入95%乙醇，60 温浴30 min，静置于室温下至细胞无色，取上清测定485 nm处吸光值，以光密度值的大小表示细胞活力。相对细胞活力=处理细胞活力/未经任何处理细胞活力100%。1.2.2相对离子渗漏率和膜脂过氧化程度测定相对离子渗漏率测定参照Zhao等19的方法并稍加修正，即取样结束，细胞中加入16 mL去离子水，真空抽气8 min，抽气3次，每次间隔2 min，然后震荡使上下层液体混匀，静置20 min，测电导率C1，沸水浴30 min，自来水冷却10 min，震荡待静置1 h后，测电导率C2，用公式计算相对离子渗漏率（C1/C2100%）。膜脂过氧化程度用丙二醛（MDA）含量表示，采用硫代巴比妥酸法测定20。1.2.3NO含量和NOS活性测定NO 含量和 NOS 活性的测定参考 Liu 等21的方法。1.2.4ROS含量测定用硫酸钛法测定H2O2含量，OH含量的测定采用2-脱氧核糖法21。采用Zhao等19的方法并稍加修改测定O2产生速率。收集的悬浮细胞用 65 mmol L-1 PBS（pH=7.8）缓冲液研磨，提取液于4 120刘亚洁等：一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性1 期下 5 000 g 离心 10 min。取上清加入 65 mmol L-1 PBS（pH=7.8）和10 mmol L-1盐酸氢氨，于25 下温浴 20 min，再加入对氨基苯磺酸和-萘胺，于25 下继续温浴20 min，在530 nm处测定吸光值。1.2.5抗氧化酶类活性测定收集的悬浮细胞用50 mmol L-1磷酸钾缓冲液（含1%PVP，pH=7.8）冰浴研磨提取，提取液于4，15 000 g离心20 min，上清液用于酶活性分析，用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。APX活性测定用AsA比色法，CAT活性采用H2O2分解法测定，GR 活性采用测定 NADPH 氧化速率的方法，POD活性测定采用愈创木酚显色法，SOD活性测定采用氮蓝四唑光化学还原法21。1.2.6抗氧化剂含量测定收集的细胞用0.5 mmol L-1 EDTA溶液（含3%三氯乙酸）研磨提取，提取液于4，15 000 g离心10 min，上清液用于抗氧化剂含量分析。AsA含量采用2，6-二氯酚锭酚（DCPIP）光度测定法，GSH含量用5，5-二硫代对硝基苯甲酸（DTNB）比色法进行测定21。1.3数据处理所有试验重复3次，用SPSS 19.0软件对数据进行统计和方差分析，不同处理数据之间的差异性用Duncan多重检验进行分析，当P0.05认为有显著性差异。用Origin 9.0绘制数据图。2 结果与分析2.1不同浓度EBR对离子芥悬浮细胞抗寒性的影响如图 1所示，在 4 和 0 胁迫下，不加 EBR处理的悬浮细胞活力分别降低至正常温度下细胞活力的 81.4%和 78.4%，相对离子渗漏率增加了36.8%和 63.6%，MDA 质量摩尔浓度也升高了19.7%和37.9%，说明低温处理明显抑制离子芥悬浮细胞活力，导致相对离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度显著升高，而且这种变化随着温度的降低表现得越为明显。不同浓度EBR处理对正常温度下（25）生长的悬浮细胞的细胞活力、相对离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度没有产生显著影响。而在4 低温环境下，与不加 EBR 单独低温处理相比，0.01、0.10、1.00 mol L-1 EBR处理细胞相对活力分别提高了12.4%、19.4%和6.3%，相对离子渗漏率降低了10.7%、21.7%和6.9%，同时MDA质量摩尔浓度显著降低了 9.5%、15.1%和 8.6%。在 0 低温环境下不同浓度EBR处理对上述生理指标的影响与图1在正常生长温度（25）和低温胁迫下（4 和0），不同浓度EBR处理对高山离子芥悬浮细胞相对活力（A）、相对离子渗漏率（B）和MDA质量摩尔浓度（C）的影响图中数据为平均值标准差；柱上不同字母表示经Duncan法检验在P0.05水平差异显著；下同。Fig.1Effects of different EBR concentrations on relative cell viability（A），relative ion leakage（B）and MDA molality（C）in the suspension cultured cells from C.bungeana under normal growth tem-perature（25）and chilling stress（4 and 0）Each value represented meanstandard deviation；Different letters on the bars indicated significant difference at P0.05 level by Duncan test；the same as below.12144 卷植物研究在4 类似，表明EBR能够明显缓解低温胁迫下细胞活力的下降及离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度的增加。另外，在 3种处理浓度中，0.10 mol L-1 EBR对低温胁迫下悬浮细胞的保护效果最理想，在后续试验中使用该浓度EBR处理细胞。2.2EBR、EBR+PTIO以及EBR+L-NAME对离子芥悬浮细胞抗寒性的影响由图2所示，在常温下，EBR、EBR+PTIO以及EBR+L-NAME处理细胞的相对活力、相对离子渗漏率、MDA质量摩尔浓度没有显著性差异。而在低温胁迫下，EBR处理可以明显提高悬浮细胞相对活力，降低相对离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度。在4 低温胁迫下，与只加入EBR处理相比，EBR+PTIO、EBR+L-NAME复合处理细胞的相对活力显著降低了21.8%和35.8%，而相对离子渗漏率明显升高了 80.0%和 79.4%，同时 MDA 质量摩尔浓度明显增加了 27.8%和 23.7%。在 0 低温环境下，EBR、EBR+PTIO以及EBR+L-NAME对相对细胞活力、相对离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度的影响与4 环境下类似。由此可见在低温胁迫下，EBR中加入PTIO或L-NAME复合处理细胞时，EBR对细胞的保护作用被抑制。2.3低温胁迫下EBR对离子芥悬浮细胞NO含量和NOS活性的影响如图3所示，在4 和0 低温下，细胞NO质量摩尔浓度分别升高了62.2%和83.1%，而NOS活性也同时上升了78.1%和139.3%，说明低温处理可明显提高细胞内源NO质量摩尔浓度和NOS活性，这种变化随着温度的降低表现的越为显著。在正常生长状况下（25），EBR处理略微提高了细胞NO质量摩尔浓度和NOS活性。而在4 和0 低温环境下，与仅处于逆境胁迫的细胞相比，EBR处理细胞的NO质量摩尔浓度分别显著提高了44.6%和40.0%，NOS活性也明显增加了58.6%和32.5%，表明EBR处理可以影响细胞内源NO质量摩尔浓度和NOS活性，在低温胁迫下，EBR处理细胞的内源NO水平和NOS活性更高。在4 和0 低温下，EBR+PTIO复合处理明显抑制了EBR对NO质量摩尔浓度的诱导提高效应，与单独EBR处 理 相 比 NO 质 量 摩 尔 浓 度 降 低 了 65.3%和55.8%，但 EBR、EBR+PTIO 处理细胞的 NOS 活性没有显著差异。同时，在低温下 NOS 抑制剂 L-NAME的加入也显著抑制了EBR对NO积累的促进效应，与4 和0 单独EBR处理相比NO质量摩尔浓度降低了64.3%和43.5%。此外，L-NAME也可以抑制EBR处理增强的NOS活性。图2在正常生长温度（25）和低温胁迫下（4 和0），EBR、PTIO以及L-NAME处理对高山离子芥悬浮细胞相对活力（A）、相对离子渗漏率（B）和MDA质量摩尔浓度（C）的影响EBR.0.1 mol L-1 EBR；EBR+PTIO.0.1 mol L-1 EBR+100 mol L-1 PTIO；EBR+L-NAME.0.1 mol L-1 EBR+300 mol L-1 L-NAME；下同。Fig.2Effects of EBR，PTIO and L-NAME on relative cell viability（A），relative ion leakage（B）and MDA molality（C）in the suspension cultured cells from C.bungeana under normal growth tem-perature（25）and chilling stress（4 and 0）EBR.0.1 mol L-1 EBR；EBR+PTIO.0.1 mol L-1 EBR+100 mol L-1 PTIO；EBR+L-NAME.0.1 mol L-1 EBR+300 mol L-1 L-NAME；the same as below.122刘亚洁等：一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性1 期2.4SNP、PTIO以及L-NAME对离子芥悬浮细胞抗寒性的影响在4 和0 环境下，NO供体SNP处理悬浮细胞的相对活力相比单纯低温处理显著提高了13.6%和 20.7%，相对离子渗漏率明显减少了22.6%和 36.6%，同时 MDA 质量摩尔浓度也显著降低了12.4%和26.8%（见图4：AC），表明NO能够明显抑制低温胁迫下细胞活力的降低以及离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度的升高。在4 低温下，与仅受逆境胁迫处理的细胞相比，PTIO或 L-NAME会导致相对细胞活力明显下降，降低的程度达到51.0%和52.1%，同时相对离子渗漏率显著升高了 57.2%和 42.5%，MDA 质量摩尔浓度增加了23.6%和19.8%。在0 低温环境下，SNP、PTIO以及 L-NAME对相对细胞活力、相对离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度的影响与4 环境下类似。在正常生长温度（25）下，SNP、PTIO、L-NAME处理细胞的相对活力、相对离子渗漏率和MDA质量摩尔浓度没有显著性差异，说明 SNP、PTIO 及 L-NAME对常温下生长的悬浮细胞不会产生影响。此外，图4DE显示，无论在正常生长温度还是在低温胁迫下，与不加任何试剂处理的细胞相比，虽然SNP是NO的供体可以促进悬浮细胞内源NO质量摩尔浓度大幅度上升，然而却明显抑制细胞NOS活性，PTIO是NO清除剂可以降低细胞NO水平，但却增强了NOS活性，这表明细胞NO质量摩尔浓度与其 NOS 活性之间存在反馈抑制。L-NAME处理在抑制细胞NOS活性的同时也降低了细胞NO质量摩尔浓度。2.5低温胁迫下EBR、SNP、PTIO以及L-NAME对离子芥悬浮细胞ROS含量的影响如图5所示，悬浮细胞处于低温环境时，与对照相比其H2O2质量摩尔浓度、O2产生速率和OH-含量明显上升，这种变化随着温度的降低表现的越为显著，在4 和0 低温下，H2O2质量摩尔浓度增加了 66.5%和 105.9%，O2产生速率升高了84.3%和 114.0%，同样 OH含量增加了 45.9%和53.0%。在4 环境下，外源EBR处理细胞的H2O2质量摩尔浓度、O2产生速率和OH-含量相比仅处于低温胁迫的细胞明显下降了 30.2%、42.0%和27.1%，而在EBR中加入PTIO后H2O2质量摩尔浓度、O2产生速率和OH含量又显著增加，相比单独EBR处理分别增加了101.3%、83.0%和33.0%，同样 EBR+L-NAME 与单独 EBR 处理相比上述指标分别明显增加了 90.7%、64.8%和 37.1%。在0，EBR、EBR+PTIO 以及 EBR+L-NAME 对 H2O2质量摩尔浓度、O2产生速率和OH含量的影响与4 类似。由此可见EBR可以抑制低温所引起的ROS大量积累，而用PTIO清除NO或用L-NAME抑制 NOS 活性可以阻抑 EBR 降低 ROS 含量的这种生理效应。在4 和0 胁迫下，SNP处理细胞的H2O2质量摩尔浓度相比单纯低温处理显著降低了26.3%和 34.2%，O2产 生 速 率 明 显 减 少 了 43.6%和42.3%，同 时 OH-含 量 也 显 著 降 低 了 28.5%和18.4%，说明NO也可以抑制低温所引起的ROS大量积累。另外，与仅受低温胁迫的细胞相比，PTIO或L-NAME单独处理会明显提高细胞的H2O2质量摩尔浓度、O2产生速率和OH-含量。图3在正常生长温度（25）和低温胁迫下（4 和0），EBR、PTIO 以及 L-NAME 处理对高山离子芥悬浮细胞NO质量摩尔浓度（A）和NOS活性（B）的影响Fig.3Effects of EBR，PTIO and L-NAME on NO molality（A）and NOS activity（B）in the suspension cultured cells from C.bungeana under normal growth temperature（25 ）and chilling stress（4 and 0）12344 卷植物研究2.6低温胁迫下EBR、SNP、PTIO以及L-NAME对离子芥悬浮细胞抗氧化防御系统的影响与对照相比，低温胁迫下悬浮细胞APX、GR、POD和SOD活性明显升高，而CAT活性却被胁迫逆境抑制，在4 和0 低温下，CAT活性下降了18.1%和 38.8%（见图 6）。在 4，外源 EBR处理后 APX、CAT、GR、POD 和 SOD 活性显著增强，相比单独低温胁迫分别明显增加了 54.1%、30.8%、36.7%、42.5%和29.3%，外源SNP处理同样也显著提高了上述抗氧化酶活性。在0，EBR以及SNP对 APX、CAT、GR、POD和 SOD活性的影响与 4 类似。如图 7所示，低温处理下悬浮细胞 AsA 和GSH质量摩尔浓度显著增加，与对照相比，在4 胁迫下增加了44.2%和90.5%，在0 胁迫下增加了 20.9%和 16.9%，而在加入 EBR 后 AsA 和 GSH质量摩尔浓度进一步明显提高，相比单纯4 低温图4在正常生长温度（25）和低温胁迫下（4 和0），SNP、PTIO以及L-NAME处理对高山离子芥悬浮细胞相对活力（A）、相对离子渗漏率（B）、MDA质量摩尔浓度（C）、NO质量摩尔浓度（D）和NOS活性（E）的影响SNP.100 mol L-1 SNP；PTIO.100 mol L-1 PTIO；L-NAME.300 mol L-1 L-NAME。Fig.4Effects of SNP，PTIO and L-NAME on relative cell viability（A），relative ion leakage（B），MDA molality（C），NO molality（D）and NOS activity（E）in the suspension cultured cells from C.bungeana under normal growth temperature（25）and chilling stress（4 and 0）SNP.100 mol L-1 SNP；PTIO.100 mol L-1 PTIO；L-NAME.300 mol L-1 L-NAME.124刘亚洁等：一氧化氮参与调控油菜素内酯增强高山离子芥悬浮细胞抗寒性1 期处理增加了28.9%和17.4%，与仅处于0 胁迫处理相比提高了 50.8%和 47.4%。同时外源 SNP处理也显著提高了AsA和GSH质量摩尔浓度。以上结果说明，EBR和NO可以增强低温胁迫下细胞的抗氧化防御能力。如图6所示，在4 低温胁迫下，EBR中加入PTIO后APX、CAT、GR、POD和SOD活性又明显降低，与单独 EBR 处理对比分别减少了 48.4%、43.8%、42.2%、36.9%和22.8%，同样EBR+L-NAME与单独EBR处理相比上述抗氧化酶活性分别显著降低了 55.3%、42.6%、40.3%、45.3%和 26.3%。在0，EBR+PTIO以及EBR+L-NAME对APX、CAT、GR、POD和SOD活性的影响与4 类似。与此同时，4 低温下在 EBR中加入 PTIO或 L-NAME复合处理细胞的AsA质量摩尔浓度与只加入EBR处理相比明显降低31.7%和31.0%，同样GSH质量摩尔浓度也显著减少了 28.4%和 23.3%。在 0 环境下，EBR+PTIO以及EBR+L-NAME对AsA和GSH质量摩尔浓度的影响与4 类似。可见PTIO及L-NAME在不同程度上阻碍了低温胁迫下EBR对抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的诱导提高效应。此外，与仅受低温胁迫的细胞相比，PTIO及L-NAME单独处理会导致细胞APX、CAT、GR、POD和SOD活性以及AsA和GSH质量摩尔浓度明显下降。3 讨论3.1EBR对离子芥悬浮细胞抗寒性的影响在本研究中，低温胁迫会明显抑制悬浮细胞活力，外源EBR处理可以使胁迫下细胞活力部分恢复。相对离子渗漏率是反映植物细胞膜受低温逆境损伤的一个重要生理指标，MDA是膜脂过氧化产物，其含量的多少可以反映膜脂过氧化程度。低温胁迫会引起细胞膜损伤，胞内可溶性物质和电解质大量向膜外渗漏以及膜脂过氧化程度加剧，而EBR处理可以缓解离子渗漏和膜脂过氧化程度的加剧。低温胁迫导致植物体内ROS过量积累，EBR处理可以抑制低温胁迫下离子芥悬浮细胞H2O2含量、O2产生速率和OH-含量的升高，提高抗氧化酶 APX、CAT、GR、POD 和 SOD 的活性，促进抗氧化剂AsA和GSH的积累，增强细胞的抗氧化防御能力，从而缓解ROS大量积累对细胞造成的氧化损伤，防止膜脂过氧化程度加剧，以维持低温状态下细胞膜系统结构和功能的稳定性，保证图5低温胁迫下，EBR、SNP、PTIO 以及 L-NAME 处理对高山离子芥悬浮细胞H2O2质量摩尔浓度（A）、O2产生速率（B）、OH含量（C）的影响CK.对照，细胞不加任何化学试剂处理并培养于25；C.低温胁迫；C+E.低温胁迫+0.1 mol L-1 EBR；C+S.低温胁迫+100 mol L-1 SNP；C+E+P.低温胁迫+0.1 mol L-1 EBR+100 mol L-1 PTIO；C+E+L.低温胁迫+0.1 mol L-1 EBR+300 mol L-1 L-NAME；C+P.低温胁迫+100 mol L-1 PTIO；C+L.低温胁迫+300 mol L-1 L-NAME；下同。Fig.5Effects of EBR，SNP，PTIO and L-NAME on H2O2 molality（A），O2 production rate（B）and OH-content（C）in the suspension cultured cells from C.bungeana under chilling stressCK.The control suspension cultures were treated without any chemicals and cultivated at