球孢白僵菌侵染长林小蠹的致病性及侵染显微观察.pdf

Vol.44 No.2Feb.2024第 44 卷 第 2 期2024 年 2 月中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Journal of Central South University of Forestry&Technologyhttp:/收稿日期：2023-06-02基金项目：国家重点研发计划项目（2021YDF1400300）。第一作者：张瀚文（），硕士研究生。通信作者：宇佳（），副教授，硕士研究生导师。迟德富（），教授，博士研究生导师。引文格式：张瀚文,陈汝婷,许建娇,等.球孢白僵菌侵染长林小蠹的致病性及侵染显微观察 J.中南林业科技大学学报,2024,44(2):62-72.ZHANG H W,CHEN R T,XU J J,et al.Scanning electron microscopy and pathogenicity of Beauveria bassiana infection with Hylurgus ligniperdaJ.Journal of Central South University of Forestry&Technology,2024,44(2):62-72.球孢白僵菌侵染长林小蠹的致病性 及侵染显微观察张瀚文1，陈汝婷1，许建娇1，周俊华1，石 鹏1，杨青山1，韩 俊2，初 奎3，宇 佳1，迟德富1（1.东北林业大学 森林生态系统可持续经营教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150000；2.烟台市牟平区大窑街道林业站，山东 烟台 264100；3.烟台市牟平区森林资源监测保护服务中心，山东 烟台 264100）摘 要：【目的】筛选球孢白僵菌并探究其对长林小蠹幼虫和成虫的致病性，以及分析球孢白僵菌对长林小蠹幼虫和成虫的侵染过程。【方法】1）通过形态学鉴定和分子生物学鉴定确定所筛选菌株的品系；2）利用 Excel 2016 软件计算累计校正死亡率，SPSS 26.0 软件进行方差分析，并计算毒力回归方程式和 LC50；3）利用扫描电镜观察球孢白僵菌侵染长林小蠹幼虫和成虫的过程。【结果】1）经鉴定，从长林小蠹僵虫虫体上分离纯化得到的是 4 株不同的球孢白僵菌（编号分别为 Bbz1、Bbz2、Bbz3 和 Bbz4）；2）对长林小蠹幼虫和成虫进行毒力测定，4 株球孢白僵菌对长林小蠹幼虫和成虫毒力并不相同，其中，菌株 Bbz4 对幼虫的毒杀效果最好，接种 7 d 后，1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液对长林小蠹幼虫致死率达到 100%，LC50为 3.68105孢子/mL，对成虫毒杀效果最好的是菌株 Bbz1，接种 7 d 后，1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液对长林小蠹成虫致死率达到 100%，LC50为 3.27106孢子/mL；3）使用菌株 Bbz4 和菌株 Bbz1 对长林小蠹幼虫和成虫的侵染进行超微结构观察发 现，在接种 0 12 h 时，菌株分生孢子接触并附着在长林小蠹体表；接种 18 h 时，发现孢子萌发并产生芽管；接种 36 h 时，发现有菌丝向内穿透体壁的现象出现；接种 72 h 时，菌丝伸出体外；接种 96 120 h 时，整个虫体被菌丝覆盖。【结论】确定了从长林小蠹僵虫虫体上分离到的是 4 株不同球孢白僵菌，其中菌株 Bbz4 和Bbz1 分别对长林小蠹幼虫和成虫致病性最强，并确定接种后不同时间节点上白僵菌的侵染进程。关键词：球孢白僵菌；长林小蠹；扫描电镜；侵染过程；致病性中图分类号：S763.11 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2024)02-0062-11Scanning electron microscopy and pathogenicity of Beauveria bassiana infection with Hylurgus ligniperdaZHANG Hanwen1,CHEN Ruting1,XU Jianjiao1,ZHOU Junhua1,SHI Peng1,YANG Qingshan1,HAN Jun2,CHU Kui3,YU Jia1,CHI Defu1(1.Key Laboratory of Sustainable Management of Forest Ecosystems of the Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150000,Heilongjiang,China;2.Forestry Station of Dayao Street,Muping District,Yantai City,Yantai 264100,Shandong,China;3.Forest Resources Monitoring and Protection Service Center of Muping District,Yantai City,Yantai 264100,Shandong,China)Abstract:【Objective】Beauveria bassiana was screened and its pathogenicity on larvae and adults of Hylurgus ligniperda was investigated,the infection process of B.bassiana on larvae and adults of H.ligniperda was verified.【Method】1)Morphological identification and molecular biology identification were used to determine the strain of the selected strains;2)The cumulative corrected mortality rate was calculated using Excel 2016 and the SPSS 26.0 was used for ANOVA and the virulence regression equation and LC50 were calculated;3)Electron microscopy scanning was used to observe the infection of larvae and adults of H.ligniperda.【Result】1)Through bioassay,it was found that 4 strains of B.bassiana were not the same virulence to the larvae and adults of H.ligniperda,named Bbz1,Bbz2,Bbz3 and Bbz4;2)Among them,the strain Bbz4 had the best poisoning effect on larvae,after inoculation for 5 days,the killing effect of 1108 spores/mL concentration of spore suspension on the larvae of H.ligniperda reached Doi:10.14067/ki.1673-923x.2024.02.00763中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷白僵菌是一种昆虫病原真菌，由昆虫学家Agostino Bassi 发 现1-3。球 孢 白 僵 菌 Beauveria bassiana 通过产生孢子、水解酶、侵染结构和有毒的次生代谢物来破坏寄主角质层，帮助侵染寄主4-6。常寄生于鞘翅目、鳞翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等 15 个目 149 个科的 700 多种昆虫与螨类7，在农业、兽医和林业害虫管理中发挥了关键作用。20 世纪 70 年代以来，我国应用白僵菌防治马尾松毛虫 Dendrolimus punctatus、星天牛 Anoplophora chinensis 等主要森林害虫取得了较好的效果，对控制森林害虫的严重发生和减少环境污染均发挥着不可替代的作用，并取得了显著的经济效益、社会效益和生态效益8-9。近几年来，在我国浙江、福建、湖南、内蒙古和新疆等地利用白僵菌防治水稻黑 尾 叶 蝉 Nephotetlix cincticeps、茶 毛 虫 Euproctis pseudoconspersa Strand、蝗虫、棉铃虫 Heliothis zea、油菜茎象甲 Ceuthorhynchus asper Roelofs、小地老虎 Agrotis ipsilon 和田菜夜蛾 Spodoptera exigua 等害虫均获得了较好的防治效果9。近年来草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda 在我国爆发，有关白僵菌防治草地贪夜蛾的研究随之开展。温绍海等10、庞继鑫等11、陈培华等12确定白僵菌对草地贪夜蛾有较好的生防潜力。随着对白僵菌控制森林害虫高毒效菌株的筛选以及推广应用，白僵菌将被应用于更多森林害虫的防治。长 林 小 蠹 Hylurgus ligniperda 隶 属 鞘 翅目 Coleoptera 象 虫 科 Curculionidae 小 蠹 亚科 Scolytinae 切 梢 小 蠹 族 Tomicini 林 小 蠹 属Hylurgus13。原产于欧洲南部和中部、俄罗斯、地中海地区和附近的大洋岛屿，以松属植物为食，是次期性害虫，通常树干基部附近的厚大树皮或大根中危害14-16，特别容易随松材制品运输而传播。在整个欧洲以及非洲、澳洲、亚洲、美洲的部分国家与地区有分布。长林小蠹除了能通过直接取食危害寄主植物外，还能传播植物病原真菌，对许多松属植物造成了重大危害，造成了严重的经济损失，被国际植物保护公约、北美植物保护组织等国际性或区域性组织列为重要的检疫性害虫。我国在 2007 年将其列入进境检疫性有害生物17-18，于 2019 年 7 月，陆续发现山东省泰安市、威海市和烟台市存在长林小蠹，目前已确定长林小蠹在我国定殖并造成严重危害13。由于长林小蠹在我国定殖时间较短，对长林小蠹防治技术尚处于初步探索阶段。本试验研究了长林小蠹僵虫中分离出来的高致病力球孢白僵菌株对长林小蠹成虫和幼虫的致病性，利用扫描电镜记录了球孢白僵菌在长林小蠹成虫和幼虫体表的发育和侵染过程，可为利用球孢白僵菌防治长林小蠹奠定基础。1 材料与方法1.1 培养基本试验选用 4 种培养基，分别是马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖水培养基（PDB）、萨氏培养基（SDAY）和孟加拉红琼脂培养基（RBA）。1.2 菌株的分离将从受害的黑松坑道中获得的长林小蠹僵虫在超净工作台中用 75%酒精表面消毒 30 s，再用无菌水漂洗 3 次，用灭菌滤纸吸净水分后将每个僵虫分为头、胸、腹 3 部分，呈三角形接入同一个 RBA 平板上，三角形边长为 4 cm。置于 恒温培养箱中 25、RH90%、暗培养，定期观察，待虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝至新的 PDA 平板上，按上述条件培养。重复操作 3 次得到纯化的菌株，转至斜面培养基 4 冰箱保存备用19。1.3 菌株的形态学观察在超净工作台上，将分离纯化得到的菌株接100%,LC50 was 3.68105 spores/mL.The best poisoning effect on the adult of H.ligniperda was the strain Bbz1.After inoculation for 5 days,the killing effect of 1108 spores/mL concentration of spore suspension on the alduts of H.ligniperda reached 100%,and the LC50 was 3.27106 spores/mL;3)Scanning electron microscopy was performed on the infection of larvae and adults of H.ligniperda used strain Bbz4 and strain Bbz1,and it was found that the conidia of these strains touched and attached to the body surface of H.ligniperda during 0-12 h after inoculation.When inoculated for 18 h,spore germination was found and bud tubes were produced;At 36 h,there was mycelium penetrating the body wall;When inoculated for 72 h,hyphae appeared on the surface of the worm;At 96-120 h of inoculation,the entire body was covered with hyphae.【Conclusion】It was determined that four different strains of B.bassiana were isolated from the body of H.ligniperda,among which strains Bbz4 and Bbz1 were the most pathogenic to the larvae and adults of H.ligniperda,and determined their infection process on H.ligniperda at different time points after inoculation.Keywords:Beauveria bassiana;Hylurgus ligniperda;scanning electron microscope;infestation process;pathogenicity张瀚文，等：球孢白僵菌侵染长林小蠹的致病性及侵染显微观察64第 2 期种到 PDA 培养基上，置于 25、RH90%培养箱中暗培养，定期观察菌落生长情况，记录其颜色及形态，并结合扫描电镜观察孢子形态，参考真菌鉴定手册20，对分离得到的菌株进行形态学 鉴定。1.4 菌株的分子生物学鉴定使用天根 DNA 提取试剂盒（DNAsecure 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒）提取各菌株的基因组 DNA。利用真菌菌种鉴定通用引物，ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3），ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）进行PCR扩增。PCR 反应体系总体积 25 L，其中引物各 1 L；DNA 模板 0.5 L；2rapid Tap Master Mix（绿色）12.5 L；ddH2O 补足至 25 L。反应程序：94 预变性5 min；94 变性30 s，51退火30 s，72 延伸 1 min，35 个循环；72 延伸 10 min。扩增产物在 1.0%的琼脂糖凝胶 1TAE 缓冲液中电泳，紫外灯下凝胶成像。将有目标片段大小的单带出现的样品扩增产物送生物公司进行测序，将测序获得的序列在 NCBI 网站进行 Blast 同源性比对分析，选出比对结果中相似度较高并且种属关系确定的序列。利用 MEGA 7.0 软件，选择邻接法（Neighbor-Joining method）构建系统发育树。1.5 供试菌株和昆虫将分离并鉴定过的球孢白僵菌菌株接种在PDA 培养基上，在 25、RH90%、黑暗条件下培养 15 d，刮取孢子粉放入 40%甘油，保存于东北林业大学森林害虫防治实验室-80 冰箱中备用。试验前准备好分生孢子。供试昆虫采自山东省烟台市牟平区沿海防护林，经分子和形态特征鉴定13，确定其为长林小蠹。用黑松韧皮部在恒温培养箱中 25、RH90%、黑暗条件下饲养。1.6 孢子悬浮液制备参照何劲等21的方法略做改进，将保存的4 株球孢白僵菌接种于 SDAY 培养基上，25、RH90%、黑暗条件培养，14 d 后获得大量分生孢子22。刮取分生孢子于 1.5 mL 离心管中。取一定量的分生孢子于 100 mL 锥形瓶中，加入 50 mL 的0.5%吐温 80，用振荡仪振荡 20 min 将分生孢子充分打匀，用血球计数板在显微镜下计数，配置108、107、106孢子/mL 悬浮液，4 下保存备用。1.7 室内生测采用浸渍法接菌。分别取 40 mL 配置好的108、107、106孢子/mL 的孢子悬浮液，倒入一次性养虫盒中，将长林小蠹成虫和幼虫分别放入菌液浸泡 30 s。对照组昆虫用等体积无菌 0.5%吐温 80 浸泡 30 s，成虫处理后接入灭菌的树皮饲料中，再放入黑色的一次性养虫盒中；幼虫处理后放入装有灭菌的树皮饲料的 24 孔板中，扣盖。共设置 3 个重复，每个重复 12 头试虫。放入 25、RH90%、黑暗条件中培养，每隔 24 h 记录试虫死亡数，共记录 7 d。1.8 扫描电镜样品制备扫描电镜样品采用浸渍法接菌。取 40 mL（1108孢子/mL）孢子悬浮液倒入一次性养虫盒中，将长林小蠹成虫或幼虫放入菌液浸泡 30 s。对照组昆虫用等体积的 0.5%吐温 80 浸泡 30 s。处理过的试虫放入 25、RH90%、黑暗条件中培养。分别在接菌后 6、12、18、24、26、48、60、72、96、120 和 144 h 取出成虫和幼虫各 6 头，共计 132 头。用 2.5%戊二醛固定液固定 24 h，用0.1 mol/L pH 值为 7.4 的磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次 30 min；再用 30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇逐级脱水，每级 30 min；再用乙酸异戊酯与无水乙醇 11 混合液浸泡 30 min；之后用乙酸异戊酯置换 2 次，每次 30 min。最后将样品放在室温干燥通风位置风干，将样品取出，贴在样品台上，喷金，在扫描电子显微镜下观察、拍照。1.9 数据处理参照邓嘉茹等23的方法，根据统计的死亡数，采用 Excel 2016 软件计算累计校正死亡率，利用SPSS 26.0 软件进行方差分析，并计算毒力回归方程式和 LC50。累计校正死亡率=（处理组累计死亡率-对照组累计死亡）/（1-对照组累计死亡率）。2 结果与分析2.1 菌株形态学及分子生物学鉴定从长林小蠹僵虫虫体上共分离纯化得到 4 株菌株，分别编号为Bbz1、Bbz2、Bbz3和Bbz4（图1）。观察菌株在 PDA 平板上的培养形态，菌落边缘呈絮状，中心呈粉状并略微凸起，菌落较厚。初呈乳白色，后颜色变为淡黄（图 1AD），菌落背面均为淡黄色（图 1EH）。通过扫描电镜观察65中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷分生孢子，各菌株分生孢子多为球形至近球形（图1IL）。经形态学观察初步鉴定，菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 及 Bbz4 均归类为白僵菌属（图 1）。将各菌株所得序列在 NCBI 数据库中进行BLAST 比对，发现测试菌株的 ITS 序列与已报道的球孢白僵菌菌株对应序列的相似性达到 99%以上。选取相关序列通过 MEGA7.0，使用 NJ 法进行 1 000 次步长计算，构建系统发育树，在基于rDNA-ITS 序列片段构建的系统发育树中（图 2），菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 和 Bbz4 归为不同分支。A D：菌落正面；E H：菌落背面；I L：扫描电镜下孢子形态。A-D:front colony;E-H:reverse colony;I-L:the conidia under scanning electron microscopy.图 1 4 株真菌的形态特征Fig.1 The morphological characteristics of four strains fungi括号内为菌株在 GenBank 中的登录号；各分支上的数字表示支持率。The numbers in parentheses represent GenBank accession numbers.The numbers in each branch point denote the percentages supported by bootstrap.图 2 基于 ITS 序列构建目的菌株与球孢白僵菌及近缘种的系统发育树（NJ 法）Fig.2 Construction of phylogenetic tree of the isolated strain and B.bassiana strains as well as other closely related species based on ITS region sequence(Neighbour-Joining method)张瀚文，等：球孢白僵菌侵染长林小蠹的致病性及侵染显微观察66第 2 期2.2 不同球孢白僵菌菌株对长林小蠹幼虫的累计校正死亡率以及剂量效应使用不同浓度的 4 株球孢白僵菌菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 和 Bbz4 的孢子悬浮液处理长林小蠹幼虫，观察其累计校正死亡率变化（表 1）。处理 5 d 后，菌株 Bbz4 的 1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理的长林小蠹幼虫累计校正死亡率达到 100%，与 1107孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理过的长林小蠹幼虫累计校正死亡率差异不显著（P 0.05），与 1106孢子/mL 的孢子悬浮液处理过的长林小蠹幼虫累计校正死亡率差异显著（P 0.05），且显著高于其他菌株相同浓度处理的长林小蠹幼虫致死效果（P 0.05）。菌株 Bbz1、Bbz2 和 Bbz3 组内，同一天不同浓度的处理之间，长林小蠹幼虫的累计校正死亡率差异不显著（P 0.05）。处理 7 d 时，各处理累计校正死亡率均达到最高，菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 及Bbz4 的 1108孢子/mL 的孢子悬浮液对长林小蠹幼虫累计校正死亡率分别达到 56.25%、53.13%、78.13%和100%。其中菌株Bbz4的110孢子/mL 和 1107孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理的长林小蠹幼虫累计校正死亡率之间差异不显著（P 0.05），但显著高于其他菌株相同浓度处理组（P 0.05）。不同菌株的各浓度处理后的累计校正死亡率总体随着时间的增加而增加；在相同时间的各处理组中，累计校正死亡率也会随着处理浓度的增加而增加。表 1 接种球孢白僵菌后长林小蠹幼虫的累计校正死亡率Table 1 Accumulative adjusted mortality of H.ligniperda larva after inoculating of B.bassiana球孢白僵菌B.bassiana处理Treatment/(孢子mL-1)处理 1 d 后1 day after treatment处理 3 d 后3 days after treatment处理 5 d 后5 days after treatment处理 7 d 后7 days after treatmentBbz111060.00 b0.000.47 cd0.000.82 f15.630.82 h11070.00 b5.710.82 bcd9.091.63 ef40.630.67 ef11080.00 b-2.860.00 d18.181.63 def56.250.94 cdBbz211062.780.47 ab8.571.25 bcd12.121.25 def25.000.82 gh11070.00 b8.571.25 bcd33.330.47 cd43.750.82 def11080.00 b17.140.47 bcd27.270.82 cde53.130.82 deBbz311060.00 b5.710.82 bcd18.180.82 def37.500.47 fg11072.780.47 ab17.140.94 bcd27.271.41 cde68.750.47 bc11085.560.47 ab25.711.89 b48.181.25 bc78.130.47 bBbz411062.780.47 ab5.710.82 bcd66.670.47 b68.750.94 bc11078.330.82 a20.001.25 bc87.880.94 a93.750.94 a11085.560.47 ab94.290.47 a1000.00 a1000.00 a 不同字母表示同一列的累计校正死亡率差异显著。下同。Different letters indicate significant differences in cumulative corrected mortality for the same column.The same below.根据4株球孢白僵菌侵染长林小蠹幼虫的累计校正死亡率与浓度的对数关系，求得菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 及 Bbz4 对长林小蠹幼虫的毒力回归方程（表 2）分别为：y=0.78x-5.62、y=0.32x-2.31、y=0.85x-5.25、y=2.14x-11.90。各 菌 株 对 长 林 小蠹 幼 虫 的 致 死 中 浓 度 LC50分 别 为：2.08107 孢子/mL、1.68107孢子/mL、1.41106孢子/mL 和3.68105孢子/mL，其对长林小蠹幼虫的毒力大小为：菌株 Bbz4 菌株 Bbz3 菌株 Bbz2 菌株 Bbz1。综上所述，菌株 Bbz4 对长林小蠹幼虫致病力最强。结合表 1，应选用球孢白僵菌菌株 Bbz4的 1108孢子/mL 的孢子悬浮液对长林小蠹幼虫进行防治。2.3 不同球孢白僵菌菌株对长林小蠹成虫的累计校正死亡率以及剂量效应4 株球孢白僵菌菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 及Bbz4 的不同浓度孢子悬浮液处理长林小蠹成虫后，其累计校正死亡率变化如表 3 所示。在处理 5 d 后，长林小蠹成虫累计校正死亡率开始出现明显升高，其中菌株 Bbz1 的 1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理的长林小蠹成虫累计校正死亡率上升最明显，其累计校正死亡率达到 100%，显著（P 0.05）高于其他处理组相同浓度处理的长林小蠹成虫累计校正死亡率（P 0.05）；并且在处理 5 d 后，随着接种时间的延长与处理浓度的增加，长林小蠹成虫累计校正死亡率也随之增67中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷加；在处理 7 d 后，各菌株的 1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理的长林小蠹成虫累计校正死亡率最高，分别达到 100%、18.18%、87.88%和87.88%。菌株 Bbz1 与菌株 Bbz3 和 Bbz4 的 1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理组的长林小蠹累计校正死亡率上没有显著性差异（P 0.05），与Bbz2 相同浓度处理组差异显著（P 0.05）。表 2 球孢白僵菌对长林小蠹幼虫的剂量效应（7 d）Table 2 Dose effect of B.bassiana on larva of H.ligniperda(7 days)球孢白僵菌B.bassiana致死中浓度LC50/(孢子mL-1)95%置信区间95%confidence interval/(孢子mL-1)回归方程Regression equation卡方检验（c2）Bbz12.081075.86106 1.81108y=0.78x-5.622.28Bbz21.681071.12106 1.511011y=0.32x-2.312.28Bbz31.411065.89104 4.46106y=0.85x-5.251.47Bbz43.681051.53104 8.42106y=2.14x-11.906.62表 3 接种球孢白僵菌后长林小蠹成虫的累计校正死亡率Table 3 Accumulative adjusted mortality of H.ligniperda adult after inoculating of B.bassiana球孢白僵菌B.bassiana处理 Treatment/(孢子mL-1)处理 1 d 后1 day after treatment处理 3 d 后3 days after treatment处理 5 d 后5 days after treatment处理 7 d 后7 days after treatmentBbz111060.00 a0.00 d5.710.82 g15.150.47 d11070.00 a5.560.94 cd40.000.82 cd72.731.41 b11080.00 a8.330.00 cd100.000.00 a100.000.00 aBbz211060.00 a0.00 d0.000.47 g-6.060.47 e11070.00 a0.00 d-2.860.00 g-3.030.47 e11080.00 a0.00 d8.570.00 fg18.181.63 dBbz311065.560.94 a25.000.82 b25.711.25 de27.270.82 cd11072.780.47 a38.891.70 a42.861.25 c45.450.82 c11082.780.47 a19.441.25 bc60.001.70 b87.880.94 abBbz411060.00 a0.00 d11.430.47 efg18.181.41 d11072.780.47 a11.111.25 bcd22.860.82 ef27.270.82 cd11080.00 a5.560.47 cd62.860.47 b87.880.47 ab根据4株球孢白僵菌侵染长林小蠹成虫后累计校正死亡率与浓度的对数关系，求得菌株 Bbz1、Bbz2、Bbz3 及 Bbz4 对长林小蠹成虫的毒力回归方程（表 4）分别为：y=1.58x-10.32、y=0.69x-6.22、y=0.79x-5.32、y=0.91x-6.40，其对长林小蠹成虫的致死中浓度 LC50分别为：3.27106孢子/mL、1.12109孢子/mL、5.05106孢子/mL、1.03107孢子/mL，对长林小蠹成虫的毒力大小依次为菌株 Bbz1 Bbz3 Bbz4 Bbz2。结合表 1，菌株 Bbz1 的 1108孢子/mL 浓度的孢子悬浮液处理组在 5 d 后已经达到 100%的死亡率，所以菌株Bbz1 是对长林小蠹成虫防治效果最好的菌株，且防治的最佳浓度是 1108孢子/mL。表 4 球孢白僵菌对长林小蠹成虫的剂量效应（7 d）Table 4 Dose effect of B.bassiana on adult of H.ligniperda(7 days)球孢白僵菌B.bassiana致死中浓度LC50/(孢子mL-1)95%置信区间95%confidence interval/(孢子mL-1)回归方程Regression equation卡方检验（c2）Bbz13.271061.96106 5.20106y=1.58x-10.323.81Bbz21.121091.92108 6.321012y=0.69x-6.228.17Bbz35.051061.97106 1.08107y=0.79x-5.325.33Bbz41.031073.29106 3.54107y=0.91x-6.4010.802.4 球孢白僵菌分生孢子侵入长林小蠹幼虫体表的过程接种球孢白僵菌菌株 Bbz4 分生孢子后的不同时间段，利用扫描电镜观察分生孢子侵染长林小蠹幼虫体表过程（图 3）。由图 3A 可以观察到长林小蠹幼虫头部比较光滑，除头部以外其他部位褶皱不平，由于长林小蠹幼虫体表的物理结构差异，使分生孢子在其体表的分布状况有所不同，张瀚文，等：球孢白僵菌侵染长林小蠹的致病性及侵染显微观察68第 2 期在接种 0 12 h 时是接触期；由图 3B 可以观察到球孢白僵菌分生孢子在虫体体表背部黏附较多，并且在刚毛之间的凹陷处（Co 和 Br）有大量分生孢子黏附（图 3B）；接种 18 h 后，观察到有分生孢子开始萌发并在一端形成芽状突起，继而生长成为芽管（Gt2），有的沿体壁方向生长（图3C），有的沿刚毛方向生长（Gt1）（图 3C）；接种36 h后，观察到沿体壁方向生长的芽管（Ph），在末端接触体壁部位有穿透菌丝由外向内穿透长林小蠹幼虫体表的现象（图 3D）；接种 72 h 后，长林小蠹幼虫虫体表面（Hy）出现白色菌丝（图3E），并且菌丝体（Co）上长出新的分生孢子（图3E）；接种 96 h 后，长林小蠹幼虫虫体被菌丝包被形成僵虫（图 3F）。Co：分生孢子 Conidia；Br：刚毛 Bristle；Gt：芽管 Germ tube；Ph：穿透菌丝 Penetrant hyphae；Hy：菌丝 Hypha.图 3 球孢白僵菌分生孢子在长林小蠹幼虫体表的萌发和侵入Fig.3 Germination and invitation of B.bassiana conidia on the cuticle of H.ligniperda larva2.5 球孢白僵菌分生孢子在长林小蠹成虫体表的侵染部位及侵染过程图 4 是长林小蠹成虫在接种球孢白僵菌菌株Bbz1 的分生孢子后，利用扫描电镜观察的分生孢子在长林小蠹成虫体表分布状况。通过对微观结构观察发现，长林小蠹成虫体表物理结构存在差异，使分生孢子的附着具有明显的选择性。分生孢子在前胸背板以及上部刚毛窝（图4A）、前胸褶皱处（图4B）、腹节节间膜（图 4C）、复眼（图 4D）、触角鞭节（图 4E）以及足与其表面刚毛窝（图 4F）等部位均有分布。并且发现长林小蠹前胸背板上（Sa）的刚毛窝分布均匀且大小一致（图 4A），足上（Sa）的刚毛窝分布较为复杂（图 4F），并且刚毛窝（Co）和刚毛窝（Co）之间以及前胸褶皱处（Co）有大量的分生孢子附着（图 4A，图4B，图 4F）；由于长林小蠹成虫腹节连接处（Im）形成凹陷并且节间膜（图 4C）相对外骨骼更容易附着，因此分生孢子大量附着在腹节节间处（Co）（图 4C）；而长林小蠹成虫触角鞭节与前胸背板和前胸褶皱处（Co）相比相对较平整，仅有少量的鳞状凸起，因此附着的分生孢子数量较少（图4E）；由图 4D 可以观察到其复眼小眼之间的凹陷处（Om）也有孢子分布，但在较光滑的小眼面上无孢子分布（图 4D）。球孢白僵菌对长林小蠹成虫的侵入主要包括分生孢子在虫体表面的附着、吸附、萌发、透过体壁和繁殖等阶段。在接种球孢白僵菌菌株 Bbz1的分生孢子后，在接种 0 6 h 时可以观察到孢子依靠简单的物理作用附着在虫体表面（Co）（图5A），此时并未观察到分生孢子溶解虫体表皮的现象；在接种 6 12 h 时观察到分生孢子（Ed）溶解小蠹表皮（图 5B），使孢子更紧密地吸附在虫体体表，帮助其侵入虫体表皮，并且可以明显观察到分生孢子陷入虫体表皮中的现象；接种18 h后，发现虫体体表（Gt）的分生孢子萌发，形成芽状突起（图 5C）；接种 36 h 后，有芽管（Gt）形成（图5D），并沿体壁方向生长，且发现菌丝向内穿透了长林小蠹成虫表皮层（Ph）（图 5D）；接种 72 h 后，发现菌丝伸出长林小蠹成虫体表（Hy）（图5E）；在接种 120 h 后，发现菌丝体上长出新的分生孢子（Co）（图 5F）。3 结 论1）本研究从山东省烟台市牟平区沿海防护林69中 南 林 业 科 技 大 学 学 报第 44 卷中采集长林