天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202212025天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究李泽宇，段卓凡，邰安然，刘芯怡，刘心愿，于婷婷，文静，杨莉，付强*，史慧君*(新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)摘要：为分析天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛肠道病毒(BEV)的复制，本研究以不同浓度的BBM与牛肾细胞(MDBK)共孵育后，采用MTT法检测BBM对MDBK细胞的影响，结果显示，与对照浓度相比，1滋mol/L、5滋mol/L、10滋mol/L BBM对细胞增殖抑制作用均较小(0.05)。因此选择上述3种浓度的BBM分别处理MDBK 12 h后以103TCID50BEV感染，24 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测BEV双链RNA(dsRNA)，以确定BBM对BEV的最佳抑制浓度。MDBK细胞经10滋mol/L BBM处理后感染BEV，观察48 h内BEV致细胞病变效应(CPE)，采用荧光定量PCR检测BEV 5UTR mRNA转录水平及测定子代病毒滴度，以确定BBM体外对BEV的抑制效果。IFA结果显示，与对照组相比，10滋mol/L BBM对BEV dsRNA具有极显著性抑制作用(0.01)；细胞形态观察结果显示，BBM对BEV引起的细胞大面积脱落具有一定的抑制效果；荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，在感染48 h的细胞中BEV 5UTR mRNA转录水平极显著降低(0.01)；子代病毒滴度测定结果显示，在BEV感染24 h和36 h时子代病毒滴度极显著降低(0.01)。小鼠预防试验时将24只BALB/c小鼠均分为3组，分别为对照组(0)、低剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg)，每日将BBM灌胃1次。给药后3 d滴鼻感染1015TCID50BEV，间隔48 h重复感染一次。感染后分别于5 d、10 d剖杀各组小鼠并采集各组织，采用荧光定量PCR检测BEV 5UTR mRNA的转录水平。小鼠感染治疗试验时将48只BALB/c小鼠均分为BEV阳性对照组(BEV/DMSO)、感染给药组(BEV/BBM)、给药对照组(BBM)，BEV阳性对照组和BEV/BBM组小鼠滴鼻感染1015TCID50BEV后，各组每天按原剂量灌胃BBM一次，感染后0、3 d、6 d和10 d剖杀各组小鼠并采集各组织，检测BEV 5UTR mRNA的转录水平，并制备病理切片观察各组织的病变。BALB/c小鼠预防试验结果显示，各浓度BBM均具有显著或极显著抑制BALB/c小鼠肝、脾、肾、小肠组织中BEV 5UTR mRNA转录水平升高的作用(0.05或0.05).Microscopic examination of the BEV infection caused cell death,andBBM-inhibited cell death was performed.In addition,IFA showed that 10滋mol/L of BBM significantly reduced the accumulationof BVDV dsRNA(0.01).Besides,RT-qPCR showed that the level of BEV 5-UTR mRNA reduced considerably(0.01)afterBBM treatment for 72 hours.Moreover,viral titers decreased significantly after BBM treatment for 24 hours and 36 hours(0.01).Subsequently,the prevention and therapeutic of BEV infection in BALB/c mice were investigated.Twenty-four micewere randomly divided into three different groups and treated with varying concentrations of BBM,named control group(0),lowdose group(50mg/kg),high dose group(100mg/kg)by oral administration every 24 hours,followed by infection with 1015TCID50/滋LBEV by nasal drip,and re-infection after 48 hours.Tissues were collected for RT-qPCR to determine the BEV 5-UTR mRNAreplication level,and an inverted microscope observed histopathologic characteristics at 5 days and 10 days.Another forty-eightmice were randomly divided into three different concentration groups,named positive control group(0),high dose group(100mg/kg),and un-infection control group(100mg/kg).The control and high-dose groups were infected with 1015TCID50/滋L ofBEV by nasal drip and given the indicated concentration BBM by oral administration every 24 hours.Tissues were collected forRT-qPCR to determine the effect of BEV 5-UTR mRNA replication level,and an inverted microscope observed histopathologiccharacteristics at 0,3 days,6 days,and 10 days.The prevention experiment showed that BBM inhibited the BEV at differentconcentrations,significantly inhibiting the BEV 5-UTR mRNA level in the liver,spleen,kidney,and small intestine(0.01 or0.05).The histopathologic results showed that BBM significantly inhibited the histopathologic changes in tissue,particularly inthe high-dose group.The therapeutic results showed that BBM inhibits BEV inflection in tissue from one day after infection.Thehistopathological result showed that hyperemia,bleeding,and inflammatory cell infiltration were recovered.In conclusion,weconfirmed that BBM significantly inhibited BEV replicationand in,provided a new method for preventing and treatingBEV,and provided a reference for treating bovine diarrhea and developing BBM as an antiviral drug.Key words:natural small molecule drugs;berbamine;bovine enterovirus;viral replication牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)是小RNA病毒科()肠道病毒属()的单股正链RNA病毒1，目前经分离鉴定得知BEV有两种血 清 型，牛 肠 道 病 毒1型(Bovine enterovirus-1，BEV-1)和2型(Bovine enterovirus-2，BEV-2)2。BEV感染后主要引起牛发热、腹泻、呼吸困难等，可引起新生犊牛死亡，感染动物黏膜、排泄物可大量排毒，并通过接触、环境中水体循环、飞沫等途径感染健康动物3，从而引发疫病的大面积流行，导致乳、肉牛生产性能下降，严重危害养牛业。国内相关治疗药物的研发工作仍处于初级阶段，尚未进入临床治疗。因此，寻求治疗BEV的药物，尤其新型抗BEV药物显得尤为重要。天然小分子药物小檗胺(Berbamine，BBM)是从我国中草药小檗属植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱4。BBM具有促进白细胞增生、抗炎、抗结核、抗矽肺、抗肿瘤、降血压、抗心肌缺氧缺血、抗心律失常等多种生物学功能，目前已经用于癌症的化疗、放疗，慢性苯中毒后的免疫调节5-6。有研究报道BBM及其衍生物作为钙调蛋白拮抗剂对抑制脑恶性胶质细胞瘤、人宫颈癌细胞、腹水癌细胞及黑色素瘤细胞的增殖也有明显作用7；BBM可减少氧自由基对细胞的损害，减轻细胞内钙超载，对缺血组织有一定的保护作用8；还可通过抑制细胞线粒体功能和细胞凋亡过程来改善异丙肾上腺素引起的心肌梗塞9。BBM的抗病毒作用也已逐步被中 国 预 防 兽 医 学 报2023年882挖掘，研究表明BBM可效抑制SARS-CoV-2(Severeacute respiratory syndrome coronavirus 2)及日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感 染10。但 对BEV是否具有类似作用，目前尚未见报道，因此，本研究首次对BBM是否在体内外具有抑制BEV复制的作用进行研究，为牛腹泻病治疗以及开发BBM为抗病毒药物提供参考依据。1材料与方法1.1病毒株和细胞致细胞病变型(Cytopathic ef-fect，CP)BEV分离株BL311由新疆农业大学动物医学学院抗病毒药物研究实验室分离并保存11。牛肾细胞(Madin-darby bovine kidney，MDBK)购自中国科学院上海细胞库。1.2主要试剂BBM(HY-N0714A)购自Med ChemExpress公司；DMSO购自美国Sigma公司；MTT试剂盒(ST316)购自上海碧云天生物技术有限公司；Anti-dsRNA MAb J2(10010200)购自美国SCICONS公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(PerfectRealTime)(RR036A)试剂盒购自TaKaRa公司；SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒购自QIAGEN公司；细胞爬片(801010)购自无锡耐思生物科技有限公司；胎牛血清FBS、DMEM和青链霉素购自BI公司；CoraLite488标记的驴抗鼠IgG(H+L)购自武汉三鹰生物技术有限公司。1.3BBM对细胞增殖的影响待96孔细胞培养板中MDBK细胞汇合度达50%时，使用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)将BBM浓度分别稀释为1滋mol/L、5滋mol/L、8滋mol/L、10滋mol/L、15滋mol/L、20滋mol/L，使用各浓度BBM分别处理各孔MDBK细胞0、12 h、24 h、36 h、48 h，更换新鲜的100滋L细胞培养液和10滋L MTT溶液(终浓度为0.01 mol/L)，37孵育4 h后弃上清，每孔加入150滋L DMSO，100 r/min避光振荡30 min，检测OD570nm值。各组结果以平均值依标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行独立样本的 检验，比较组间数据的显著性差异，采用GraphPad Prism 5.0软件作图，分析BBM对细胞增殖的影响。*：0.05代表差异显著；*：0.01代表差异极显著。实验设仅含DMSO的MDBK细胞为对照组。1.4BBM对BEV dsRNA荧光变化影响的IFA检测待24孔细胞培养板中细胞爬片上的MDBK细胞汇合度达70%时，分别加入1滋mol/L、5滋mol/L、10滋mol/L(根据1.3结果确定)BBM处理MDBK细胞，12 h后加入103TCID50BEV，继续培养24 h，使用4%多聚甲醛室温下固定20 min，更换成封闭液孵育1 h，以Anti-dsRNA MAb J2(1颐1 200)为一抗，以CoraLite488标记的驴抗鼠IgG(H+L)(1颐250)为二抗，置于常温下孵育2 h后加入PI染核，并使用PVP封片液封片，4避光晾干后于激光共聚焦显微镜下观察。实验设仅加DMSO的MDBK细胞为阴性对照组。1.5BEV感染BBM处理的MDBK细胞后复制情况的检测待6孔 细 胞 板 中MDBK细 胞 汇 合 度 达60%时，加入10滋mol/L BBM处理12 h，吸弃培养液后加入103TCID50BEV吸附2 h后PBS冲洗，分别于感染BEV后0、12 h、24 h、36 h、48 h时在显微镜下观察CPE并收集细胞和培养液，一部分用于提取RNA并反转录为cDNA，经荧光定量PCR检测试剂盒检测BEV 5UTR mRNA转录水平，使用GraphPad Prism 5.0作图分析BBM对BEV抑制情况；另一部分冻融3次裂解细胞，1 000 r/min离心取上清病毒悬液，病毒悬液10倍倍比稀释后，分别加入96孔细胞培养板中汇合度约70%的MDBK细胞中，吸附2 h后更换成5%FBS的培养液，每个稀释度平行做8个复孔，病毒感染3 d5 d统计CPE，根据Reed-Muench法计算子代病毒的TCID50。上述各实验均设仅加DMSO，但BEV感染的MDBK细胞为阳性对照组。1.6BBM对BEV感染BALB/c小鼠的预防保护试验参照文献12，将24只BALB/c小鼠随机均分为高剂量实验组(100 mg/kg BBM灌胃BALB/c小鼠)、低剂量实验组(50 mg/kg BBM灌胃BALB/c小鼠)、BEV阳性对照组(仅灌服DMSO)。每24 h灌胃一次，连续3次后以浓度为1015TCID50/滋L BEV按10滋L/只小鼠滴鼻感染各组小鼠，48 h后以相同剂量再次感染，首次感染后每24 h各组小鼠继续按相应剂量BBM灌胃。于首次感染后第5 d和10 d时分别对各组小鼠安乐死，每次每组4只，取肝、脾、肾、小肠等组织，常规处理后采用1.5中实时荧光定量PCR检测各组织内BEV 5UTR mRNA的转录水平，同时制备病理切片，观察组织病理变化。1.7BBM对BEV感染BALB/c小鼠的治疗试验将48只BALB/c小鼠随机均分成3组：BEV阳性对照组(BEV/DMSO)、感染给药组(BEV/BBM)、给药对照李泽宇，等.天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究第9期883组(BBM)。其中BEV阳性对照组和感染给药组小鼠均使用1015TCID50/滋L BEV按10滋L/只滴鼻感染，48 h后再次以同剂量感染，二次感染后感染给药组和给药对照组小鼠以100 mg/kg BBM灌胃小鼠。BBM每24 h灌胃一次，于给药后第0、3 d、6 d和10 d时分别剖杀各组小鼠，按1.6方法处理各组织并检测各组织中BEV 5UTR mRNA的转录水平，并同1.6中方法进行病理变化观察。2结果2.1BBM对MDBK细胞增殖影响的检测结果为分析BBM对MDBK细胞增殖的影响，本实验采用MTT法检测不同浓度BBM处理MDBK细胞于不同时间时细胞增殖情况，结果显示，与对照组相比，1滋mol/L、5滋mol/L、8滋mol/L、10滋mol/L、15滋mol/L和20滋mol/L BBM处理MDBK细胞0和12 h时对细胞OD570nm值均无明显影响，BBM处理24 h时15滋mol/L和20滋mol/L细胞OD570nm值极显著降低(0.01)。可见随时间延长和BBM浓度增大，细胞活性也逐渐降低(图1)。表明BBM对MDBK细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性，且1滋mol/L10滋mol/L BBM处理24 h内对细胞增殖的抑制作用较小，因此选择该浓度范围BBM进一步试验。*:0.05,*:0.01,the same as below.图1BBM对MDBK细胞增殖影响的MTT法检测结果Hours post treatment with BBMNegative control1滋mol/L5滋mol/L8滋mol/L10滋mol/L15滋mol/L20滋mol/L1.51.00.5048h36h24h12h02.2BBM对BEV dsRNA荧光变化影响的IFA检测结果采用不同浓度BBM预处理MDBK后感染BEV，通过IFA检测BBM对BEV dsRNA荧光的影响。结果显示，与阴性对照组相比，BBM对BEV dsRNA荧光形成有抑制作用，且随浓度增加而该抑制作用增强；其中1滋mol/L的BBM可使细胞质内特异性绿色荧光数量明显减少，10滋mol/L BBM处理的细胞质中的绿色荧光几乎消失(图2)。表明10滋mol/L BBM可有效抑制BEV的胞内复制，因此选取该浓度为最适抑制浓度用于后续试验。2.3BBM对BEV在MDBK细胞中复制影响的检测结果本研究对BEV感染BBM处理的MDBK细胞于不同时间点观察其形态；收集细胞及培养液，检测BEV5UTR mRNA转录水平及子代病毒滴度。细胞形态观察结果显示，与阳性对照组相比，感染BEV 24 h、36 h、48 h时，BBM对MDBK细胞的CPE现象有明显抑制作用，尤其是BBM处理BEV感染后36 h和48 h时的MDBK细胞中多数细胞仍贴壁且破碎较少，CPE明显减轻(图3A)，表明BBM可抑制BEV在MD-BK细胞中复制，减轻BEV感染造成的CPE。实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，在BEV感染BBM处理的MDBK细胞12 h后显著降低(0.05)、24 h后极显著降低(0.01)BEV 5UTR mRNA转录水平，其中BEV感染48 h后约降低50%(图3B)，表明BBM具有抑制BEV 5UTR mRNA转录水平作用，且抑制作用随BEV感染时间的延长而增强。子代病毒滴度测定结果显示，与对照处理相比，自感染开始显著降低(0.05)、12 h后极显著降低(0.01)BEV子代病毒滴度，且抑制作用随时间的延长而增强(图3C)，表明BBM可显著抑制BEV在MDBK细胞中的子代病中 国 预 防 兽 医 学 报2023年884毒滴度。2.4BBM对BEV感染BALB/c小鼠的预防作用为检测BBM对BALB/c小鼠感染BEV是否具有预防作用，本研究BBM给药小鼠后以BEV感染，取各组织经荧光定量PCR检测BEV 5UTR mRNA的转录水平，同时观察各组织病理变化。荧光定量PCR结果显示，与阳性对照组(DMSO)相比，感染后5 d和10 d小鼠小肠和肝脏中BEV 5UTR mRNA的转录水平均极显著 降 低(0.01)，感 染5 d时 脾 脏 和 肾 脏 中BEV5UTR mRNA的转录水平显著降低(0.05)，10 d时其极显著降低(0.01)(图4)；各剂量BBM均具有预防BALB/c小鼠肝、脾、肾、小肠组织中BEV 5UTRmRNA转录水平升高的作用。表明BBM具有预防BALB/c小鼠感染BEV的作用。病理切片观察结果显示，与阳性对照组(DMSO)相比，高剂量组小鼠感染后5 d、10 d可显著抑制肾脏出血及肾小球肿大；低剂量组小鼠5 d、10 d可有效减缓肾小球充血肿大，减少炎性细胞浸润，使肾小球和肾小管间质病变均降低。低剂量组小鼠5 d、10 d可减少肝脏出血、肝静脉充血；高剂量组5 d可减轻上述症状，10 d可显著抑制肝脏出血、肝静脉充血，减少细胞中颗粒状物质产生及细胞质空泡状现象的发生，使肝小叶结构完整、中央静脉清晰、肝细胞索呈整齐的放射状。低剂量组小鼠感染后5 d可减少脾脏充血，中性粒细胞增多，10 d时脾小梁减少，巨细胞增多；高剂量组感染后5 d可减少组织充血，白细胞增多，10 d时脾脏充血显著减轻且红髓与白髓界限清晰，出现少量巨细胞。低剂量组小鼠感染后5 d可减少小黏膜下层的炎性细胞浸润，10 d可使隐窝增多，肠绒毛增长且隐窝增大；高剂量组小鼠感染后5 d、10 d可使肠绒毛上皮细胞由多层变为单层(图5)。上述结果进一步表明BBM具有预防BALB/c小鼠感染BEV的作用。李泽宇，等.天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究第9期885图2BBM影响BEV感染MDBK细胞dsRNA荧光变化的IFA结果Negative control1滋mol/L5滋mol/L10滋mol/LBBMA：BEV感染MDBK细胞中CPE的观察；B：荧光定量PCR检测BEV5UTR mRNA水平；C：BEV感染不同时段子代病毒滴度的测定A:Detection of cytopathogenic effect of MDBK cells infected with BEV;B:Detection of BEV 5UTR mRNA level by RT-qPCR;C:Detection ofvirus titer at different time intervals after BEV infection图3BBM对BEV在MDBK细胞中复制水平影响的检测结果24h036h48hHours post-infection with BEVAB10滋mol/L BBMPositive controlHours post-infection with BEV8000000060000000400000002000000015000001000000500000048h36h24h12h0Positive controlBBM 10滋mol/LHours post-infection with BEV48h36h24h12h0129630C图4BBM对BEV感染BALB/c小鼠预防感染试验中感染后5 d(A)、10 d(B)BEV 5UTR mRNA转录水平的荧光定量PCR检测结果DMSO50mg/kg BBM100mg/kg BBM1.1伊1071.0伊1079.0伊1063.0伊1062.0伊1061.0伊10605 days post-infection with BEVADMSO50mg/kg BBM100mg/kg BBM2.0伊1071.5伊1071.0伊1075.0伊1061.5伊1061.0伊1065.0伊105010 days post-infection with BEVB2.5BBM对BEV感染BALB/c小鼠的治疗作用为检测BBM对BEV感染BALB/c小鼠是否具有治疗作用，取BEV感染后灌胃BBM的各组BALB/c小鼠各组织，按照1.6方法经荧光定量PCR检测和组织病理变化观察。荧光定量PCR结果显示，与阳性对照组(BEV/DMSO)相比，感染给药组(BEV/BBM)小鼠各组织中BEV 5UTR mRNA的转录水平极显著降低(0.01)，趋近于给药对照组(BBM)(图6)，表明BBM对BEV感染BALB/c小鼠具有治疗作用。病理切片观察结果显示，与阳性对照组(BEV/DMSO)相比，感染给药组(BEV/BBM)小鼠感染后3 d可抑制BEV感染引起的小鼠肾脏出血现象，6 d可减轻肾小球充血水肿等症状，10 d可明显减少炎性细胞的增多；3 d可减轻BEV感染导致的小鼠脾脏中巨噬细胞增多的症状，6 d可改善其红细胞增多，脾小梁增多等现象，10 d可明显减轻脾脏充血，减少脾小梁，改善红髓与白髓界限不清晰等病变，感染后10 d使中性粒细胞、巨细胞及白细胞增多；3 d可减少其小肠黏膜下层的炎性细胞浸润，使肠绒毛增长隐窝增多且变深，6 d可使肠绒毛上皮细胞由多层变为单层，10 d可明显抑制小鼠小肠黏膜充血水肿，黏膜下层的炎性细胞增多，肠绒毛代偿性增宽且缩短，隐窝减少且形态改变等情况；3 d可减少BEV感染导致的肝脏出血、肝静脉充血，6 d可使小鼠肝细胞索排列整齐，细胞质呈空泡状现象改善，10 d可明显抑制肝脏出血、肝静脉充血，减少细胞质空泡状现象的发生，使肝小叶结构完整、中央静脉清晰、肝细胞索呈 整齐的放射状，与给药对照组(BBM)基本一致(图7)。进一步表明，BBM具有治疗BALB/c小鼠各组织感染BEV的作用。图6BBM对BEV感染BALB/c小鼠的治疗试验中给药后0(A)、3 d(B)、6 d(C)、10 d(D)BEV 5UTR mRNA转录水平的荧光定量PCR检测结果3 Days post-administrationBEV/DMSOBEV/BBMBBM2.0伊1071.5伊1071.0伊1075.0伊1063.0伊1062.0伊1061.0伊1066.0伊1024.0伊1022.0伊10200 Days post-administrationBEV/DMSOBEV/BBMBBM2.0伊1071.5伊1071.0伊1075.0伊1063伊1042伊1041伊1042伊1032伊1031伊1035伊1020ABBEV/DMSOBEV/BBMBBM6 Days post-administration3.0伊1072.0伊1071.0伊1072.0伊1061.0伊1061.5伊1031.0伊1035.0伊1020CBEV/DMSOBEV/BBMBBM10 Days post-administration6.0伊1074.0伊1072.0伊1072.0伊1061.5伊1061.0伊1065.0伊1052.5伊1032.0伊1031.5伊1031.0伊1035.0伊1020D图5BBM对BEV感染BALB/c小鼠的预防感染试验中感染后5 d(A)及10 d(B)各组织病理变化观察结果IntestineSpleenLiverKidneyIntestineSpleenLiverKidneyBA中 国 预 防 兽 医 学 报2023年8863讨论近年来，BBM的抗病毒作用逐渐被发现，盐酸小 檗 胺 通 过 阻 断S蛋 白 介 导 的 膜 融 合 有 效 抑 制SARS-CoV-2感染13，通过干扰晚期的细胞自噬抑制牛病毒性腹泻病毒的复制14。但目前为止BBM对BEV复制影响的作用尚不明确，本研究首次将BBM应用于抗BEV的研究，探明了BBM具有体外抑制BEV复制的作用。本研究首先采用MTT法检测不同浓度BBM对MDBK细胞增殖的抑制作用，选择抑制作用相对较小的BBM浓度 进行后续试验，结 果 显 示24 h时15滋mol/L、20滋mol/L浓度显著抑制MDBK增殖，因此选用1滋mol/L、5滋mol/L、10滋mol/L的BBM进行后续试验。IFA也发现BBM可显著减少BEV dsRNA荧光斑点，抑制BEV在MDBK细胞中的增殖，与对照相比，1滋mol/L和5滋mol/L的BBM使BEV dsRNA荧光斑点显著减少，10滋mol/L BBM能有效抑制BEV dsRNA荧光斑点出现，表明此浓度可抑制BEV在MDBK细胞中的复制，与其抑制SARS-CoV-2在Vero E6细胞中增殖的浓度相同15；此结果在不同时间段的细胞CPE的观察中也得到验证，结果显示BEV引起的细胞脱落、破碎等现象在BBM作用下明显减弱，处理24 h后对各浓度细胞活性影响均较大，但仅给DMSO而不给药组细胞也出现大量细胞凋亡现象，因此不排除细胞正常生长凋亡及DMSO的影响。另外，10滋mol/L BBM处理MDBK细胞36 h以上会造成约30%细胞发生凋亡和死亡，但与相应时间图7BBM对BEV感染BALB/c小鼠的治疗试验中给药后0(A)、3 d(B)、6 d(C)、10 d(D)各组织病理变化观察李泽宇，等.天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究第9期887BCDIntestineSpleenLiverKidneyAIntestineSpleenLiverKidneyIntestineSpleenLiverKidneyIntestineSpleenLiverKidney1段对照组相比仍表现出对BEV复制的抑制作用，显著降低细胞中5UTR mRNA转录水平，最高相差42%，同时也发现显著降低病毒滴度。可见BBM虽有一定的细胞毒性，但是能有效抑制BEV在靶细胞中的复制，后期可通过对BBM化学结构优化等方式降低其的细胞毒性，从而为抗病毒药物的研发提供重要依据。本研究发现BBM体外能抑制BEV感染宿主细胞，为进一步研究BBM是否能在体内有效保护宿主免受BEV感染，或对BEV感染有治疗作用。参照相关文献12，本研究利用BALB/c小鼠先经BBM灌胃(50 mg/kg、100 mg/kg BBM)后感染BEV，进行了预防试验，另外将小鼠感染BEV后经BBM灌胃(100 mg/kgBBM)，验证BBM治疗效果。根据BBM的用药方法和吸收-代谢机制、灌胃的BBM通过肠吸收后经肝脏代谢原理，以及考虑到本实验使用的BEV株毒力较强，具有短时间致消化系统病变的特点，本研究选择肝脏、肠进行检测；为检测BBM是否具有一定肾毒性，本研究选择肾脏检测；有研究发现脾脏病毒含量很低的原因或与感染途径相关16-17，因此本实验根据BEV感染严重影响宿主机体免疫特性的特点，同时选择免疫器官脾检测。通过对上述小鼠组织中BEV复制水平检测和组织病变观察，结果证实小鼠经BBM灌胃后再感染BEV可有效抑制小鼠体内各组织BEV mRNA复制，减弱BEV感染造成的各组织病理损伤，可见BBM具有预防BALB/c小鼠感染BEV。治疗试验结果也发现BEV感染BALB/c小鼠后经BBM灌服可有效降低小鼠体内各组织中BEV mRNA复制，减轻BEV感染造成的各组织病理损伤。经上述研究结果综合分析，本实验证实100 mg/kg BBM对该BEV株感染具有预防及治疗作用，且给药时间越长作用越明显。综上所述，本研究首次从BBM体内外抑制BEV角度阐明了BBM具有抑制BEV体外复制及预防和治疗BEV感染BALB/c小鼠的作用，为BBM用于BEV防控提供了有力的依据；同时为利用BBM开发新型抗牛肠道病毒引发的腹泻治疗药物和临床防治牛病毒性腹泻病提供了理论基础。参考文献：魏丹丹，孙超，常继涛，等.宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究J.中国预防兽医学报，2022，44(6)：598-605.李 昊，赵 龙，汤 承，等.牛 环 曲 病 毒Man 荧 光 定 量RT-PCR方法的建立与应用J.中国预防兽医学报，2022，44(12)：1298-1303.王以欣，姜晓霞，孙晓波，等.牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其在该病毒检测中的应用J.中国预防兽医学报，2022，44(6)：624-629.ZHAO WEI-JIA,BAI BING-LONG,ZHONG HONG,et al.Berbamine(BBM),a natural STAT3 inhibitor,synergisticallyenhances the antigrowth and proapoptotic effects of sorafenib onhepatocellular carcinoma 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