蒲公英和板蓝根对LPS诱导的小鼠肠黏膜屏障损伤的调理机制研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45，No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202305004蒲公英和板蓝根对LPS诱导的小鼠肠黏膜屏障损伤的调理机制研究李慧1，刘宇飞1*，李金龙2，刘文君1，薛虹1，曹炫1，刘欣1(1.哈尔滨体育学院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030)摘要：抗生素杀死细菌释放的内毒素常对动物消化道造成损伤，为筛选能有效净化肠道内毒素从而减轻肠道损伤的中草药，本研究对小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)建立肠黏膜屏障损伤模型，随后将小鼠分为蒲公英处理组(P组，80 mg/kg，=7)，板蓝根处理组(B 组，210 mg/kg，=7)和PBS处理组(G 组，0.01 mol/L PBS，=7)，分别于处理后0、3 d和7 d收集各组小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，利用小鼠LPS检测试剂盒检测各组小鼠各个时间点肠道组织中的LPS，结果显示，与治疗前比较，蒲公英治疗3 d和7 d小鼠的十二指肠、回肠和结肠组织中LPS的含量显著降低(0.05)；板蓝根治疗7 d小鼠的十二指肠、回肠和空肠LPS的含量显著降低(0.05)。采用ELISA方法检测各组小鼠各肠道组织中分泌型IgA(sIgA)抗体水平各时间点的变化，结果显示，与治疗前比较，治疗3 d和7 d蒲公英和板蓝根组小鼠空肠和回肠组织sIgA抗体的水平显著升高(0.05)。采集治疗0、3 d和7 d各组小鼠肠道组织进行组织病理学观察，结果显示，对照组LPS诱导小鼠主要损伤的部位是小肠段，其大肠段组织形态学变化则不显著，而蒲公英组和板蓝根治疗组小鼠肠道组织的形态结构恢复正常。本研究首次证实蒲公英和板蓝根在治疗后可以显著降低小鼠各肠段组织中LPS的含量，提高肠道组织黏膜免疫的功能，为这两味中草药应用于肠道内毒素的净化提供实验依据。关键词：细菌内毒素；蒲公英；板蓝根；小鼠中图分类号：S853.7文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)08-0859-05The regulatory mechanism of dandelion and isatis root onlipopolysaccharide induced intestinal mucosal barrier injury in miceLI Hui1,LIU Yu-fei1*,LI Jin-long2,LIU Wen-jun1,XUE Hong1,CAO Xuan1,LIU Xin1(1.Harbin sport university,Harbin 150001,China;2.Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)Abstract:The release of endotoxin from the bacterial induced by the treatment of antibiotic often cause damage to thedigestive tract of animals.In order to screen the effective Chinese herbal medicines for the purification of the intestinal damage,the model of gut mucosa barrier junjury was established in mice by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(LPS).The micewere divided into the dandelion treatment group(P group,80mg/kg,=7),isatis root treatment group(B group,210mg/kg,=7),and PBS treatment group(G group,0.01mol/L PBS,=7).At 0,3 and 7 days after treatment,ELISA was used to detect the LPScontent in the duodenum,ileum,and colon tissues of each group in mice at different time points.Compared with the control收稿日期：2023-05-05基金项目：2021 年度哈尔滨体育学院科研实验室(平台)专项项目(LAB2021-10)；黑龙江省自然科学基金(联合引导)项目(LH2022C051)作者简介：李慧(1986-)，女，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，主要从事运动干预与慢性疾病防治生物机制研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorgroup,the contents of LPS in the duodenum,ileum,and colon tissues of mice in the dandelion group were significantly reduced(0.05)after 3 and 7 days of treatment;the contents of LPS in the duodenum,ileum,and jejunum of mice in the isatis root groupwere significantly reduced(0.05)after 7 days of treatment.At the same time,ELISA method was used to detect the changes insIgA content in the intestinal tissues of mice in each group.The results showed that compared with the control group,the levels ofsIgA in the duodenum,jejunum,and ileum tissues of mice in the dandelion and isatis root groups were significantly increased(0.05)after 3 and 7 days of treatments;The histopathological observations of the intestinal tissues in the different groups ofmice were carried out after 0,3 and 7 days of treatment.The results showed that the main damage in the LPS group mice was thesmall intestine,and the morphological changes in the large intestine were not significant.However,the intestinal tissue morphologyand structure in the mice in the dandelion and isatis root groups returned to normal.Our study for the first time verified thatdandelion and isatis root can significantly reduce the content of LPS in various intestinal tissues,improving the mucosal immunefunction of the intestine,and providing experimental basis for the application of these two Chinese herbal medicines for thepurification of intestinal endotoxins.Key words:bacterial endotoxins;dandelion;isatis root;mice革兰氏阴性菌是引起人类感染性疾病的主要病原之一，其感染能力通常与其细胞壁内毒素相关，内毒素的主要成分为脂多糖(LPS)1。传统上细菌感染的疾病一般采用抗生素防治，细菌感染早期，抗生素杀灭细菌的同时也抑制了细菌增殖所产生的内毒素，但在感染中后期，细菌大量增殖，抗生素杀灭细菌的同时内毒素也会大量释放，加剧细菌性疾病的感染2-3。人和动物肠道内有大量的共生菌，正常情况下菌群处于动态平衡，但随着环境污染、人们生活习惯的改变及抗生素的滥用，肠道菌群也会发生改变，使原有的平衡状态被打破。长期暴露于低剂量的LPS的机体可出现低度炎症综合征，如肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝及慢性炎症性肠病等4-6。因此急需寻求可以清除体内细菌代谢产物-内毒素的药物。传统中药对LPS损伤后的改善效果显著，具有直接清除LPS的中和作用、对炎症因子分泌失调的拮抗作用和改善微循环血流性质的调节作用等7。目前经实验证实有较好的抗炎、抗内毒素作用的单味中药多集中在清热解毒、益气、活血化瘀、温阳、滋阴等中药8-10，这类中药对肝肾和胃肠道损伤及副作用均较小，比较安全，在动物营养、疾病的防治研究中，已经逐渐作为抗生素的替代品11。板蓝根和蒲公英作为上述中药的典型代表，已有研究证明其对体外或体内急性内毒素中毒具有良好的治疗效果12-15。但关于中药对慢性内毒素感染的治疗情况尚未明确，长期内毒素暴露对机体肠道各个部分的组织形态结构和免疫性能起到哪些损伤？这两种中药能否有效净化肠道中的内毒素的水平？基于此，本实验将LPS经腹腔注射小鼠后，以板蓝根和蒲公英治疗7 d，观察两味中药对小鼠各肠道的治疗效果，为中药净化肠道内毒素的研究提供数据支持。1材料与方法1.1主要实验材料6周龄雌性昆明小鼠购于成都达硕实验动物中心(2023-17F)。所有动物实验均遵守动物实验的基本原则及动物福利。LPS购自Sigma公司；小鼠sIgA检测试剂盒和小鼠LPS检测试剂盒，均购自晶美生物制药有限公司。1.2实验设计21只6周龄雌性昆明小鼠经腹腔注射LPS(按体质量2 mg/kg给药)，每隔24 h 1次，连续30 d后停止，随后将小鼠分为3组：蒲公英组(P组，按体质量80 mg/kg灌胃给药，=7)，板蓝根组(B组，按体质量210 mg/kg灌胃给药，=7)和LPS组(G组，0.01 mol/L PBS灌胃给药，=7，G组作为阳性对照组)。另选取健康小鼠为对照组(Z组，0.01 mol/LPBS灌胃给药，=7)。分别于中药给药前(0)，给药后3 d和7 d收集各组小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠组织。1.3小鼠肠道中LPS含量的检测将收集的各个试验阶段小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠组织(1g)，利用小鼠LPS检测试剂盒检测各肠道组织中LPS的含量。将收集的肠道组织加入0.01 mol/L PBS缓冲液中匀浆机搅碎后离心收集上清液，取10 滋L加于酶标板孔中40 滋L样品稀释液底部，每孔加入酶标试剂中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年860100 滋L，空白孔除外，置37 孵育60 min，将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体。每孔先加入显色剂A 50 滋L，再加入显色剂B 50 滋L，37 避光显色15 min。每孔加终止液50 滋L终止反应，以空白孔调零，依序测量各孔的OD450nm值。标准品孔各加不同浓度的试剂盒中标准品50 滋L。1.4小鼠各肠道分泌型IgA(sIgA)含量的检测将收集的各个试验阶段小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠组织(1 g)，利用小鼠sIgA检测试剂盒检测各肠道组织中sIgA含量。各肠道组织处理具体操作步骤同1.3。1.5小鼠各个肠段组织病变的观察收集用药后0，3 d和7 d各组小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠组织，于10%中性福尔马林缓冲液中固定后，对组织修剪，用不同浓度的酒精脱水，包埋在石蜡中。用切片机切割为5 滋m的组织切片，在60 的水中膨胀，然后置于载玻片上，经HE染色观察回肠、结肠、空肠和十二指肠的组织病变。1.6数据的统计与分析采用GraphPad Prism 7计算并采用 检验分析各组实验数据的差异性，数据以依 表示。组织病理学观察使用显微镜观察并拍照。*：0.05，表示同期与对照组之间差异显著，*：0.01，表示同期与对照组之间差异极显著；#：0.05，表示与同组治疗前之间差异显 著，#：0.01，表示与同组治疗前之间差异极显著。2结果与讨论2.1小鼠各肠段LPS含量的检测结果利用小鼠LPS试剂盒检测各实验阶段各肠道组织中LPS含量，结果显示，治疗3 d和7 d，P组和B组小鼠十二指肠LPS的含量极显著低于G组(0.05)，治疗7 d，P组小鼠空肠LPS的含量显著高于治疗前(0.05)，治疗3 d和7 d，B组小鼠空肠LPS的含量显著高于G组(0.05)；治疗3 d和7 d，P组和B组小鼠结肠LPS的含量均极显著低于G组(0.01)；治疗3 d和7 d，P组小鼠回肠LPS的含量显著低于G组(0.05)，治疗3 d，B组小鼠回肠LPS的含量显著高于G组(0.05)，治疗7 d，B组小鼠回肠LPS的含量显著的低于G组(0.05)(图1)。Z组治疗期间各肠段均无变化。上述结果表明蒲公英和板蓝根在治疗7 d后可有效清除肠道组织中的LPS。本研究利用蒲公英和板蓝根治疗LPS处理小鼠，检测各个肠道组织中LPS的含量，发现G组小鼠后期LPS浓度低于对照组。研究发现动物机体可以代谢部分LPS，从而使LPS的摄入率与排泄率平衡16，因此本研究G组会出现上述情况。2.2小鼠各组肠道sIgA含量的检测结果利用小鼠sIgA检测试剂盒检测各组小鼠各肠道组织中sIgA含量，结果显示，治疗3 d和7 d，P组和B组小鼠十二指肠sIgA的含量极显著低于治疗前(0.05)，治疗3 d和7 d，B组小鼠空肠sIgA的含量显著高于治疗前(0.05)；治疗3 d和7 d，P组小鼠回肠sIgA的含量显著低于治疗前(0.05)，治疗7 d，B组小鼠回肠sIgA的含量显著低于治疗前(0.05)；治疗3 d和7 d，P和B组小鼠结肠sIgA的含量极显著低于治疗前(0.01)。Z组和G组治疗期间sIgA均无变化(图2)。上述结果表明经蒲公英和板蓝*：0.05表示同期治疗组与对照组之间差异显著，*：0.01表示同期与对照组之间差异极显著；#：0.05表示与同组治疗前差异显著，#：0.01表示与同组治疗前差异极显著。下同。*:0.05 indicates significant differences between the same period andthe control group;*:0.01 indicates extremely significant differences between the sameperiod and the control group.#:0.05 indicates a significantdifference between 0 days of treatment and the same group;#:0.01 indicates a highly significant difference between 0 days oftreatment and the same group.The same as below.图1不同药物治疗0、3 d和7 d后小鼠十二指肠段(A)、空肠段(B)、结肠段(C)和回肠段(D)LPS含量的检测结果李慧，等.蒲公英和板蓝根对 LPS 诱导的小鼠肠黏膜屏障损伤的调理机制研究第 8 期861Pre-treatment3 days after treatment7 days after treatmentABCD400300200100020015010050030020010003002001000*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#图3不同药物治疗0，3 d和7 d后小鼠十二指肠段(A)、空肠段(B)、结肠段(C)和回肠段(D)组织病理学观察根治疗后，可促进小鼠各个肠道组织中sIgA的含量升高，进而提高各个肠道的免疫性能。蒲公英是清热解毒类中草药，含有总黄酮、绿原酸、咖啡酸等多种活性成分，具有抗菌消炎、抗应激、免疫调节等多种生物学效应。蒲公英对人体具有提高免疫力的作用，本研究发现LPS处理后与对照组相比，经蒲公英治疗组可提高小鼠回肠和空肠的sIgA的含量。大多数病菌利用宿主肠黏膜表面作为侵入感染的入口，而以sIgA为主的体液免疫在肠黏膜免疫系统中起主导作用，是阻止病菌在肠黏膜黏附和定植的第一道免疫防线17-18。同时，结合2.1蒲公英治疗后可以有效降低十二指肠、回肠和结肠组织LPS含量的结果，推测蒲公英可清除小肠和大肠组织的LPS含量，并提高LPS损伤严重的小肠组织的免疫性能。而板蓝根治疗后结果显示，与Z组相比，回肠组织LPS先显著升高后降低，回肠sIgA的含量先显著升高后与对照组之间无显著差异；结肠组织LPS和sIgA的水平显著低于对照组。可见板蓝根在调节sIgA水平方面作用不明显，且调节过程与蒲公英存在差异，其中机理还有待进一步研究。2.3小鼠各个肠段组织病理学观察对各组小鼠各肠道进行组织病理学观察，十二指肠段结果显示，G组小鼠在治疗前十二指肠小肠绒毛出现严重的断裂脱落现象，随治疗时间的延长逐渐好转，治疗7 d后与Z组之间无显著差异；P组小鼠治疗3 d后明显好转，小肠绒毛的形态较优良，但治疗7 d后，小肠绒毛出现轻微断裂；B组小鼠经治疗3 d后小肠绒毛脱落和小肠绒毛数量均有改善，治疗7 d后小肠绒毛数量和形态显著恢复(图3A)。空肠段结果显示，G组小鼠在治疗3 d后，空肠段小肠绒毛出现严重的脱落现象，潘氏细胞明显增多，治疗7 d后有所好转；B组小鼠经治疗3 d小肠绒毛固有层出现变性坏死，治疗7 d后小肠绒毛存在断裂现象；P组小鼠经治疗3 d后，小肠绒毛仍存在不同程度的断裂与溶解现象，但治疗7 d后均恢复良好，与Z组之间无显著性的差异(图3B)。各组各时期结肠组织均正常，上皮细胞排列紧密规整，腺体排列整齐，结构清晰，无明显损伤(图3C)。回肠段结果显示，G组小鼠回肠小肠绒毛在治疗前(0)出现严重的破碎和溶解现象，治疗3 d和7 d后，小肠绒毛脱落严重；P组小鼠经治疗3 d后小肠绒毛恢复较好，但治疗7 d后又出现断裂现象；B组小鼠治疗3 d后小肠绒毛固有层发生变性坏死，治疗7 d后恢复较好(图3D)。上述结果表明蒲公英和板蓝根治疗3 d后，小鼠肠道组织病理学变化与I组之间无显著性差异。肠道黏膜是将机体内部环境和肠腔内环境分开的复杂结构，包括机械屏障、化学屏障、生物屏障及免疫屏障，一旦这些屏障的完整性被破坏，外源图2不同药物治疗0，3 d和7 d后小鼠十二指肠段(A)、空肠段(B)、回肠段(C)和结肠段(D)sIgA的含量ABCD中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年862ABCDZ groupG groupB groupP groupZ groupG groupB groupP groupZ groupG groupB groupP groupZ groupG groupB groupP group3d7d3d7d3d7d3d7d50040030020010002001501005002001501005004003002001000Pre-reatment3 days after treatment7 days after treatment*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*#*12345678910111213141516171819李慧，等.蒲公英和板蓝根对 LPS 诱导的小鼠肠黏膜屏障损伤的调理机制研究第 8 期863性有害物质(细菌、毒素等)可侵犯宿主肠道组织，造成炎症和组织损伤16,19-20。板蓝根是中医常用清热解毒药，用于治疗多种中医“实热证”，先前研究证明板蓝根具有很好的抗内毒素作用17-18,21-22。板蓝根不仅直接破坏内毒素结构，还能阻断内毒素引起的信号传导通路，从而抑制机体炎性因子的过度释放23-24。蒲公英具有抗菌、消炎和消肿散石的作用，对身体出现的伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及多种致病菌引起的肠道炎症感染均具有明显的防治作用。空肠主要对营养物质起到消化和吸收的功能，由于空肠排空能力强大，排空较快，所以经常处于空置的状态25-26；回肠粘膜的环状皱襞和绒毛都不如空肠发达，但孤立淋巴小结特别是集合淋巴小结的数量则远比空肠要多，因而回肠的免疫功能要强于空肠。本研究利用LPS处理后，小鼠空肠小肠绒毛固有层出现变性坏死，小肠绒毛存在断裂现象；回肠小肠绒毛固有层发生变性坏死，但经板蓝根治疗7 d后组织形态恢复良好。结合本研究上述各肠段LPS的含量检测结果，可见这两味中药材在空肠和回肠的组织形态修复中发挥了一定作用。综上所述，内毒素处理小鼠后主要损伤部位是小肠的回肠和空肠段，对结肠的组织形态影响不显著，虽然机体自身可以将体内的内毒素排出，但是肠道尤其是回肠段组织的损伤并不能得到良好的恢复。本研究首次证实蒲公英和板蓝根在治疗7 d后可以显著性的降低回肠肠段组织LPS的含量，并提高回肠肠道的黏膜免疫功能，为以后小肠肠道内毒素的净化提供潜在的开发前景。参考文献：谷巍，孙明杰，王丽荣，等.嗜酸乳杆菌发酵复方中药成分变化对腹泻小鼠的影响J.中国预防兽医学报，2019，41(5)：520-526.TSUJIKEWA A,KIRYU J,YAMASHIRO K.Interactions be-tween blood cells and retinal endothenlium in endotoxic spsisJ.Hypertension,2000,36:250-258LI CHAO,ZHOU HONG-CHAO,AN YI-LIN,et al.Effects oflipopolysaccharide on T lymphocyte cell subsets and cytokine se-cretion in mesenteric lymph nodes of 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