苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR_Cas9基因编辑载体构建.pdf

中中 国国 瓜瓜 菜菜2024，37（3）：20-27试验研究苦 瓜 是 葫 芦 科（Cucurbitaceae）苦 瓜 属（Mo-mordica charantia L.）一年生攀缘草本植物，广泛分布在热带、亚热带和温带地区1-3。苦瓜药膳兼用，富含维生素、膳食纤维、粗蛋白、氨基酸等营养物质和皂苷、酚类、类黄酮、多糖等化合物4，具有降糖、降脂、抗病毒、防衰老等多种药理作用5-6，深受广大消费者青睐，市场前景广阔。八氢番茄红素脱氢酶（phytoene dehydrogenase，PDS）是类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶，与-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）和类胡萝卜素异构酶（CRTISO）共同催化八氢番茄红素合成番茄红素，影响番茄红素及下游类胡萝卜素的生成7-8。PDS收稿日期：2023-11-27；修回日期：2024-01-12基金项目：广东省农业科学院协同创新中心项目（XTXM202203）；广州市科技计划项目（202206010170，202201010493）；广东省自然科学基金项目（2022A1515010343）；广东省农业农村厅种业振兴行动专项（2022-NPY-00-027）；广东省农业科学院创新基金项目（202301）；广东省农业科学院学科团队建设项目（202130TD）作者简介：韩鑫，女，在读硕士研究生，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail：通信作者：张长远，男，研究员，主要从事蔬菜遗传育种研究。E-mail：苦瓜 McPDS 基因克隆及 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建韩鑫1，2，郭金菊1，张惠尧1，吴廷全1，张长远1（1.广东省农业科学院设施农业研究所广州510640；2.华中农业大学园艺林学学院武汉430070）摘要：以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶（phytoene dehydrogenase，PDS）基因为靶标，构建其特异 gRNA 的 CRISPR/Cas9 基因编辑载体，以期为建立苦瓜 CRISPR/Cas9 基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系 B07 叶片 cDNA 为模板，同源克隆苦瓜 McPDS 基因 CDS 序列。结果表明，McPDS 基因 CDS 序列全长 1731 bp，编码 576 个氨基酸，蛋白质相对分子质量为 64.44 kD，理论等电点（PI）为 7.09。跨膜结构分析结果表明，该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明，McPDS 与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的 PDS 蛋白同源性较高。此外，以 McPDS 为靶标基因，在 5 端筛选 2 个高特异性靶点，经设计引物，成功构建 1 个双靶点 CRISPR/Cas9 基因编辑载体，为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。关键词：苦瓜；McPDS；基因克隆；载体构建；基因编辑中图分类号：S642.5文献标志码：A文章编号：1673-2871（2024）03-020-08Cloning and CRISPR/Cas9 gene editing vector construction of McPDS inbitter gourd（Momordica charantia L.）HAN Xin1,2,GUO Jinju1,ZHANG Huiyao1,WU Tingquan1,ZHANG Changyuan1（1.Institute of Facility Agriculture,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,Guangdong,China;2.Collegeof Horticulture&Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,Hubei,China）Abstract:A gRNA-specific CRISPR/Cas9 gene editing vector targeting phytoene dehydrogenase（PDS）gene of bittergourd was constructed,hoping to lay a foundation for the establishment of CRISPR/Cas9 gene editing technology systemof bitter gourd.In this study,the CDS region of McPDS gene was cloned from the leaf cDNA of bitter gourd inbred lineB07.The results showed that the coding region length of McPDS was 1731 bp,encoded 576 amino acids，the theoreticalrelative molecular weight was 64.44 kD,and the theoretical isoelectric point（PI）was 7.09.The transmembrane structureanalysis showed that the protein was a hydrophilic non-transmembrane protein.Phylogenetic analysis showed thatMcPDS had high homology with PDS proteins in cucurbit plants such as cucumber and melon.In addition,using McPDSas the target gene,two highly specific targets were screened at the 5 end,primers were designed,and a double-targetCRISPR/Cas9 gene editing vector was successfully constructed,which laid a technical foundation for the establishment ofbitter gourd gene editing system.Key words:Bitter gourd；McPDS；Gene cloning；Vector construction；Gene editingDOI：10.16861/ki.zggc.202423.074220第3期，等：基因编辑载体构建试验研究基因编码的蛋白主要位于叶绿体的类囊体膜上，对叶绿体具有光保护作用，其功能的缺失会导致叶绿素降解，造成光漂白现象9。由于该表型明显，易于观察，PDS 基因常被用作报告基因，建立病毒诱导的基因沉默（VIGS）体系和基因编辑技术体系等，对基因功能研究和作物遗传改良具有重要意义10。CRIPSR/Cas9 系统是新近发展起来的一种高效、精准的基因组编辑技术，已成功应用于拟南芥、烟草和水稻等多个物种中，实现了基因定向编辑11。目前该技术正在被广泛应用于植物基因功能鉴定和品种改良等领域，具有广阔的应用前景。Zeng 等12利用 CRIPSR/Cas9 系统对水稻的 PIN5b、GS3 和 MYB30 基因同时进行定点突变，获得的突变体分别表现出穗长增加、粒径增大和耐寒性增强等特点。Santosh 等13利用 CRISPR/Cas9 方法在籼稻 CV.MTU1010 基因组中创建了突变等位基因DST184-305，该基因有助于提高籼稻品种的耐旱耐盐性和产量。在番茄中，通过 CRISPR/Cas9 技术敲除SP5G、SlMYB12、AGL6 等基因，可使果实产量快速提升14、高效获得粉红果色番茄15和无籽果实16。马存发等17利用 CRISPR/Cas9 技术敲除青花菜的BoSP11 基因，创制了花期自交亲和材料。目前，利用 CRIPSR/Cas9 系统对苦瓜基因进行定点编辑的研究还未见报道。笔者以苦瓜自交系B07 叶片为试材，采用 RT-PCR 技术同源克隆苦瓜McPDS 基因，对其编码蛋白的理化性质、结构特征及保守结构域等进行分析，并以该基因为靶标，利用 CRIPSR/Cas9 系统构建双靶点基因编辑载体，以期为苦瓜基因编辑体系的建立及农艺性状的定向改良奠定技术基础。1材料与方法1.1试验材料本试验所用植物材料 B07 是由广东省农业科学院设施农业研究所选育的高世代、大顶类型苦瓜自交系，于 2023 年 3 月下旬种植于广东省农业科学院白云试验基地，常规管理。于幼苗四叶一心时，取其嫩叶立即放入液氮速冻，并于-80 冰箱保存备用。植物总 RNA 提取试剂盒 SV Total RNA Isola-tion System Kit（Promega，美国），反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Kit（TaKaRa，日本），DNA 凝胶回收试剂盒（TIANGEN，德国），pMD-19T Vector、T4DNA 连接酶（TaKaRa，日本），限制性内切酶 BsaI（NEB，美国），质粒小提中量试剂盒（TIANGEN，德国），大肠杆菌 DH5、根癌农杆菌 GV3101 均购自天根生化科技（北京）有限公司。1.2McPDS基因克隆提取苦瓜叶片总 RNA，反转录合成 cDNA。利用 Primer Premier 5.0 设计 McPDS 基因序列特异性引物，引物序列如下：McPDS-F：ATGTCACTATGT-GGATCTGTCTCTG；McPDS-R：TCACCGAAC-GCCCGCCTCAGC。PCR 反应体系（20 L）：Prime-STAR Max Premix（2X）10 L，引物 McPDS-F/R（10 molL-1）各 0.5 L，模板（cDNA）1 L，ddH2O补足至 20 L。PCR 扩增程序：94 3 min；94 1 min，58 45 s，72 1 min，30 个循环；72 延伸4 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶、纯化回收目的片段。目 的 片 段 加 A 尾 后 连 接 至 克 隆 载 体pMD19-T。连接反应体系及条件：pMD19-T Vector1 L，目的片段 4 L，Solution5 L，16 连接30 min。采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5 感受态细胞，涂布于含 100 mgmL-1氨苄青霉素的 LB 固体培养基上，37 倒置培养 16 h，筛选到的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.3McPDS蛋白生物信息学分析利 用Protparam（http:/web.expasy.org/prot-param/）在线分析 McPDS 蛋白的理化性质；利用ProtScale（http:/web.expasy.or g/protscale/）对 McP-DS 蛋白进行亲水性分析；通过在线软件 NCBI-CDS（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析 McPDS 蛋白的保守结构域；利用 TMHMM2.0 Server（TMHMM 2.0-DTU Health Tech-Bioin-formatic Services）分析 McPDS 蛋白跨膜结构；通过Signal P 4.1 Server（SignalP 4.1-DTU Health Tech-Bioinformatic Services）预 测 McPDS 蛋 白 信 号肽；分别 利 用 PRABI（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Swiss-Model（Swissmodel.expasy.org）预测 McPDS蛋白的二级和三级结构；采用ClustalW和MEGA-X软件进行氨基酸多序列比对及系统进化树 构 建。1.4CRISPR/Cas9基因编辑载体构建1.4.1gRNA 靶点选择和靶标引物设计利用在线网站 CRISPOR（http:/ 2 个靶位点，序列分别为：靶标 1：GGAGAACAGCATCTCHAGGTTGG；靶 标2：韩鑫，等：苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建21中国瓜菜第37卷试验研究AAAGTAGTGATCGCTGGTGCAGG。根 据 靶 点序 列 合 成 相 应 的 靶 点 引 物，序 列 如 下：CrM-cPDS-F：CAGTGGTCTCATGCAGGAGAACAG-CATCTCGAGGT；CrMcPDS-R：CAGTGGTCT-CAAAACGCACCAGCGATCACTACTTT。1.4.2CRISPR/Cas9 表达载体构建利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R 扩 增“gRNA1+骨 架+tRNA+gRNA2”序列，PCR 反应体系（50 L）：Biorun Pfu PCR Mix 25 L，CrMcPDS-F 1 L，CrMcPDS-R 1 L，模 板（SEQ1）1 L，Nucle-ase-free Water 补足至 50 L。PCR 反应程序为：94 5 min；94 30 s，50 45 s，72 54 s，循环 30 次；72 10 min，16 30 min。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段经切胶、回收后，酶切连接至载体 PHsbdcas9i，获得 pHSb-dcas9i-McPDS-gRNA 表达载体。酶切连接体系：10Buffer 2 L，Bsa1 L，T4_ligase 1 L，PHsb-dcas9i 4 L，胶回收产物 4 L，Nuclease-free Water补足至 20 L。反应条件：37 20 min；37 10 min，20 10 min，循环 5 次；37 20 min，80 5 min。上述使用的模板 SEQ1 序列为：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca。取 510 L 连接产物转入大肠杆菌 DH5 感受态，将转化菌液涂布于卡那霉素抗性平皿中，37 培养 12 h，挑斑，利用引物 zmpl-chen-F/zmpl-chen-R进行菌斑 PCR，目的片段长度约 800 bp。PCR 反应体系（25 L）：Biorun Magic PCR Mix 12.5 L，M13F（100 mol L-1）1 L，zmpl（100 mol L-1）1 L，模 板 1 L，Nuclease-free Water 补 足 至25 L。PCR 反应程序为：94 5 min；94 30 s，50 45 s，72 54 s，循环 30 次；72 10 min，16 30 min。筛选到阳性克隆后，利用引物zmpl-chen-F 进行测序，对测序正确的菌液提取质粒。引物序列为：zmpl-chen-F：gtaaaacgacggccagt；zmpl-chen-R：ccagaaattgaacgccgaag。2结果与分析2.1苦瓜叶片总RNA提取利用植物总 RNA 提取试剂盒提取苦瓜叶片总RNA，经 1%琼脂糖凝胶电泳获得 2 条清晰条带（图1），RNA 质量浓度为 366.534 ngL-1，A260/A280和A260/A230比值分别为 2.18 和 2.27。结果表明，RNA纯度较高，完整性好，可用于后续试验。2.2苦瓜McPDS基因克隆将上述提取的总 RNA 反转录合成 cDNA，以cDNA 为模板，利用引物 McPDS-F/McPDS-R 进行PCR 扩增，扩增条带约 1700 bp，与预期结果一致，凝胶电泳结果如图 2-A 所示。对 PCR 产物进行凝胶回收，加 A 尾，连接至克隆载体 pMD19-T，转化大肠杆菌 DH5 感受态，涂布于含 100 mgL-1氨苄青霉素的 LB 固体培养基中，37 培养箱中倒置培养 16 h。挑取单菌落，37、200 rmin-1摇菌，PCR检测筛选阳性单克隆（图 2-B），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果表明，该基因编码区长度 1731 bp，编码 576 个氨基酸。在 NCBI 数据库 BLAST 比对结果表明，该基因编码的氨基酸与甜瓜 PDS 基因编码的氨基酸（NP_001284459.1）同源性高达 93.58%，将该基因命名为 McPDS。2.3生物信息学分析2.3.1苦瓜 McPDS 蛋白理化性质分析利用 Prot-param 在线软件分析苦瓜 McPDS 蛋白理化性质，结果 表 明，苦 瓜McPDS蛋 白 分 子 式 为C2908H4568N772O829S26，相对分子质量为 64.44 kDa，其带正、负电荷残基数均为 69，理论等电点（PI）为 7.09，表明苦瓜 McPDS 为中性蛋白。不稳定指数为44.05（40），属不稳定蛋白。McPDS 脂溶指数为92.08。利用 ProtScale 对苦瓜 McPDS 进行蛋白亲/疏水性分析，总平均亲水性值为-0.154。一般而言，蛋注：14 代表不同的叶片 RNA 样本。Note:1-4 represent different RNA sample of leaves.图 1苦瓜叶片总 RNA 电泳图Fig.1Electrophoretic map of total RNA from bittergourd leaves123428S RNA18S RNA22第3期，等：基因编辑载体构建试验研究白中氨基酸分值与其亲水性呈负相关。苦瓜 McP-DS 蛋 白 氨 基 酸 序 列 中 第 151 位 的 分 值 最 低（-2.667），亲水性值最强，而第 111 位因具最高分值（2.367），相应具最强的疏水性。苦瓜 McPDS 蛋白整个多肽链中亲水性氨基酸呈均匀分布，疏水性区域不明显，推测 McPDS 为亲水性蛋白。保守结构域预测分析结果表明，McPDS 蛋白具有 1 个保守的PDS 结构域（PLN02612）（图 3）。注：M.DNA 标记（DL2000）；13 代表不同的样本。下同。Note：M.DL2000 DNAmarker;1-3 represent different samples.The same below.图 2苦瓜 McPDS 基因 PCR 扩增产物（A）及菌斑 PCR 验证（B）Fig.2PCR amplified product of McPDS（A）and colony PCR validation（B）图 3McPDS 蛋白保守结构域分析Fig.3Conserved domain analysis of McPDS2.3.2苦瓜 McPDS 蛋白跨膜结构分析采用TMHMM 2.0 Server 在线软件对苦瓜 McPDS 蛋白跨膜区进行预测，结果表明，McPDS 蛋白无跨膜区，属非跨膜蛋白。SignalP-4.1 预测结果显示，苦瓜McPDS 蛋白存在信号肽的概率仅为 0.45%，说明苦瓜 McPDS 为非分泌蛋白。2.3.3苦瓜 McPDS 蛋白二、三级结构预测二级结构预测结果表明，苦瓜 McPDS 蛋白由 41.32%的-螺旋、38.89%的无规则卷曲、15.28%的延伸主链和 4.51%的-折叠组成（图 4）。三级结构预测和同源建模分析表明，苦瓜 McPDS 基因编码的蛋白三级结构与番木瓜八氢番茄红素脱氢酶 PDB ID：Q0PQZ4.1.A 蛋白序列一致性高达 83.33%，覆盖度为100%（图5）。图 4McPDS 蛋白的二级结构预测Fig.4Secondary structure prediction of McPDSM123M123AB2000 bp1000 bp750 bp500 bp100 bp1731 bp2000 bp1000 bp750 bp500 bp100 bp1731 bpQuery seq.Specific hitsSuperfanilies17515022530037545052557601002003004005000100200300400500HelixSheetTurnCoil氨基酸位置 Amino acid positionPLN02612PLN02612 superfamily250 bp250 bp韩鑫，等：苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建23中国瓜菜第37卷试验研究2.3.4PDS 蛋白多序列比对及系统进化分析将McPDS 基因编码的氨基酸序列在 NCBI 上进行BLAST 比对，结果表明，其与黄瓜、南瓜、甜瓜、冬瓜的同源性分别为 95.1%、94.3%、94.1%、93.8%，同源性较高。利用 ClustalX 和 MEGA-X 软件，将 McP-DS 基因编码的氨基酸序列与 NCBI 数据库中登录的 15 种植物中的 PDS 序列构建 Neighbor-Joining（NJ）系统进化树。结果表明，苦瓜 McPDS 与甜瓜、黄瓜、冬瓜和南瓜等其他葫芦科作物的 PDS 蛋白聚为同一支，亲缘关系较近（图 6）。2.4苦瓜McPDS基因编辑载体构建利用引物 CrMcPDS-F/CrMcPDS-R 扩增 gRNA表达盒，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测（图 7-A），目的片段纯化回收后，采用 Golden Gate 克隆法构建pHSbdcas9i-McPDS-gRNA 表达载体，采用热激法转化大肠杆菌 DH5，涂板，利用引物 zmpl-chen-F/R 检测阳性单克隆，目的片段大小约 800 bp，与预期结果相符（图 7-B）。阳性克隆测序结果表明，“gRNA1+骨架+tRNA+gRNA2”序列成功连接至植物表达载体 pHSbdcas9i（图 7-C）。以上结果表明基因 编 辑 载 体 pHSbdcas9i-Cr-PDS 构 建 成 功（图7-D）。将 pHSbdcas9i-Cr-PDS 提取质粒，转化农杆菌GV3101，涂布于卡那霉素+利福平抗性的固体 LB培养基中，菌落生长状态如图 8-A 所示。挑选出 3个单克隆利用引物 zmpl-chen-F/R 进行 PCR 检测，扩增片段大小约 800 bp，与预期结果相符（图8-B）。挑取阳性单克隆于卡那霉素+利福平抗性的液体 LB 培养基中培养 12 d，按体积比 1 1 加入 60%甘油，于-80 冰箱中保存，用于后续苦瓜遗传转化。图 5McPDS 蛋白三级结构预测Fig.5Prediction of tertiary structure of McPDS图 6苦瓜 McPDS 与其他植物 PDS 的系统进化树Fig.6Phylogenetic tree of McPDS protein with PDS from other plantsNP_001284459.1（甜瓜 Cucumis melo）XP_031740146.1（黄瓜 Cucumis sativus）XP_022979440.1（冬瓜 Cucurbita maxima）XP_022955514.1（南瓜 Cucurbita moschata）McPDS（苦瓜 Momordica charantia）XP_047263859.1（辣椒 Capsicum annuum）XP_016498102.1（烟草 Nicotiana tabacum）XP_015162210.1（马铃薯 Solanum tuberosum）NP_001234095.1（番茄 Solanum lycopersicum）XP_027771295.1（茄子 Solanum pennelli）VDD06108.1（芜菁 Brassica rapa）NP_001303088.1（油菜 Brassica napus）NP_193157.1（拟南芥 Arabidopsis thaliana）AAD02489.1（水稻 Oryza sativa）NP_001338939.1（玉米 Zea mays）XP_044371316.1（黑小麦 Triticum aestivum）10040641001001009775901001001007424第3期，等：基因编辑载体构建试验研究注：A.“gRNA1+骨架+tRNA+gRNA2”序列扩增结果；B.菌落 PCR 鉴定；C.基因编辑载体测序结果；D.pHSbdcas9i-Cr-PDS 基因编辑载体结构示意图。M.DNA 标记（DL2000）；18 代表不同的样本。Note:A.Amplification results of“gRNA1+scaffold+tRNA+gRNA2”;B.Colony PCR identification;C.Sequencing results of gene editing vec-tor;D.Structure diagram of pHSbdcas9i-Cr-PDS expression vector.M.DL2000 DNAmarker;1-8 represent different samples.图 7pHSbdcas9i-Cr-PDS 表达载体构建及鉴定结果Fig.7Construction and identification of pHSbdcas9i-Cr-PDS expression vectorA5000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM1B6000 bp4000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM12345678800 bp193 bpCDpVS1 StaARBM13Fatu26tRNAT1-T2gRNA35S3xFLAGNLSpVS1 RepApVS1 onVbomoriKanRLBpoly（A）HygR35SRBTNLSbdCas9pHSbdcas9i-Cr-PDS15697540550560570580590600610620630640650660670680690700710720730740750760770780790800韩鑫，等：苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建25中国瓜菜第37卷试验研究3讨论与结论基因编辑技术已经成为农业育种的主流方式，其中 CRISPR/Cas9 系统具有设计简单、编辑效率高，以及成本低等特点，广泛应用于作物育种研究中，在品质改良，提高产量，增强抗病、抗逆性等方面发挥着重要作用18。目前，CRISPR/Cas9 系统已广泛应用于水稻12、大豆19、番茄20、西瓜21、香蕉22、柑橘23等作物的遗传改良。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是植物类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶，通过在植物体内积累八氢番茄红素来影响花、叶、果实中的类胡萝卜素含量24-25。PDS 基因敲除或者功能丧失能够影响类胡萝卜素合成代谢，导致植株白化9，可以用来作为判定植物基因编辑技术体系是否成功建立的标记。舒海燕等26对菠萝八氢番茄红素脱氢酶基因Aco-PDS1 进行定点编辑，突变株系的白化表型表明了 Aco-PDS1 基因成功进行了编辑突变，以此来判定菠萝 CRISPR-Cas9 系统的成功建立。胡春华等22利用 CRISPR/Cas9 系统定点敲除香蕉内源性八氢番茄红素脱氢酶基因，成功获得了香蕉白化突变株系。这些研究均表明了 PDS 基因在 VIGS 和CRISPR/Cas9 等研究中的重要作用。苦瓜作为重要的岭南特色瓜类蔬菜，分子生物学研究起步较晚，相比黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科作物，分子研究基础薄弱。截止到目前，尚未建立完善的苦瓜基因编辑体系。笔者以苦瓜自交系 B07 为材料，首次克隆出苦瓜 McPDS 基因，该基因 cDNA 序列全长为 1731 bp，编码 576 个氨基酸。苦瓜 McPDS 基因编码的氨基酸序列与甜瓜、黄瓜、冬瓜和南瓜等其他葫芦科作物 PDS 蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性，均在 80%以上，说明该基因在进化过程中较为保守。笔者以 McPDS 为靶标基因，在 5 端编码区位置设计 2 个靶位点，通过 Golden Gate 方法构建了 1个双靶点基因编辑载体。目前，基于 CRISPR/Cas9系统的基因编辑载体已在很多作物中成功构建。陈博雯等27构建了尾叶桉 EuCAD 基因的双靶点基因编辑载体，并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。由于苦瓜遗传转化体系尚不成熟，笔者构建的基因编辑载体 pHSbdcas9i-Cr-PDS 尚未进行基因编辑效率的验证，有待后续进一步研究。农杆菌介导法是目前植物中应用最为广泛的基因转化方法，具有操作简单、能稳定复制及表达等优势28。因此，利用本研究中构建的pHSbdcas9i-Cr-PDS编辑载体，通过农杆菌介导法建立苦瓜基因编辑体系，是后续研究的重点。综上所述，笔者克隆了苦瓜 McPDS 基因，并成功构建了 1 个双靶点 CRISPR/Cas9 基因编辑载体，填补了苦瓜在基因编辑研究方面的空白，为后续建立苦瓜基因编辑体系，并利用该体系研究苦瓜基因功能及定向改良苦瓜重要农艺性状奠定了技术基础。参考文献1丁国庆，贺心茹，费永俊 苦瓜育种研究进展J 中国瓜菜，2023，36（7）：1-7.2林春妹，廖道龙，刘子凡，等 苦瓜种质资源耐热性评价及其鉴定指标的筛选J/OL 热带作物学报：1-10 2023-11-27.http:/ 苦瓜 DNA 分子标记研究进展J 中国瓜菜，2023，36（6）：10-15.4周潇恬，罗非君 苦瓜的功能成分和生物活性研究进展J 现代食品，2020（10）：66-71.5王娜，李艳军，于娅，等 苦瓜种质资源农艺性状评价J 东北农业科学，2022，47（4）：99-103.6PALAMTHODI S，LELE S S Nutraceutical applications ofgourd family vegetables：Benincasa hispida，lagenaria sicerariaand momordica charantiaJ Biomedicine&Preventive Nutri-图 8农杆菌的菌落生长状况（A）及菌落 PCR 鉴定（B）Fig.8Growth status（A）of Agrobacterium and colony PCR identification（B）BM1232000 bp1000 bp750 bp500 bp100 bp800 bpA26第3期，等：基因编辑载体构建试验研究tion，2014，4（1）：15-21.7王玉萍，刘庆昌，翟红 植物类胡萝卜素生物合成相关基因的表达调控及其在植物基因工程中的应用J 分子植物育种，2006，4（1）：103-110.8吴磊，姜朋，张瑜，等 苏麦 3 号小麦穗部病毒诱导的基因沉默（VIGS）体系的建立及验证J 江苏农业学报，2017，33（2）：248-252.9薛生玲，张芬，夏雪，等 芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因 BaP-DS1 的克隆及原核表达J 基因组学与应用生物学，2016，35（7）：1787-1792.10ZHOU J，LUAN X，LIU Y，et al Strategies and methods forimproving the efficiency of CRISPR/Cas9 gene editing in plantmolecular breedingJ Plants（Basel），2023，12（7）：1478.11GUPTA D，BHATTACHARJEE O，MANDAL D，et al CRIS-PR-Cas9 system：A new-fangled dawn in gene editingJ LifeSciences，2019，232：116636.12ZENG Y，WEN J，ZHAO W，et al Rational improvement ofrice yield and cold tolerance by editing the three genesOsPIN5b,GS3,andOsMYB30withtheCRISPR-Cas9systemJ Frontiers in Plant Science，2020，10：1663.13SANTOSH KUMAR V V，VERMA R K，YADAV S K，et alCRISPR-Cas9 mediated genome editing of drought and salttolerance（OsDST）geneinindicamegaricecultivarMTU1010JPhysiology and Molecular Biology of 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