药用植物斜叶黄檀不同组织内生细菌多样性分析.pdf

昭 通 学 院 学 报第 45 卷 第 5 期Vol.45 No.5Journal of Zhaotong University2023 年 10 月Oct.202398收稿日期：2023-07-28 基金项目：河北工业职业技术大学校级项目（bz202203）。作者简介：濮宏积（1985），男，云南曲靖人，副教授，主要从事医学与医学技术研究。通信作者：徐冬梅（1980），女，河北石家庄人，副教授，博士，主要从事微生物技术及应用研究。化学 医学研究药用植物斜叶黄檀不同组织内生细菌多样性分析濮宏积1，杨本寿1，石 添3，闫欣月2，李建良2，王振宇2，陈美俊1，徐冬梅2（1.曲靖医学高等专科学校 微生物研究所，云南 曲靖 655000；2.河北工业职业技术大学 环境与化学工程系，河北 石家庄 050091）摘要：了解药用植物斜叶黄檀内生细菌群落结构及变化规律，为进一步开发利用斜叶黄檀内生细菌资源提供科学数据。应用高通量测序技术，对表面消毒后的云南山地斜叶黄檀内生细菌 16S rDNA 进行测序，分析不同组织内生细菌的群落结构及多样性，预测内生菌群的功能丰度。结果表明，斜叶黄檀不同组织内生细菌具有丰富的多样性，群落组成有显著差异。在所有组织样本中，内生细菌的优势门为变形杆菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinomycetes）和酸杆菌门（Acidobacteriota），优势属为糖单胞菌属（Saccharopolyspora）、马赛菌属（Massillia）、食酸菌属（Brevundimonas）。各菌群丰富度在根部最高，茎中最低，而多样性在茎中最高，叶片最低。其中，根中内生细菌的氨基酸转运和代谢等 10 类 COG 功能丰度均比茎叶组织中高，叶组织中有 5 类功能丰度比根茎中高，茎内菌群各功能丰度值均偏低。在 KEGG L3 功能预测中根组织内生细菌群落中 10 个代谢通路的丰度均比茎叶高。关键词：斜叶黄檀；内生细菌；16S rDNA；多样性；高通量测序中图分类号：R914文献标志码：A文章编号：2095-7408（2023）05-0098-09斜叶黄檀 Dalbergia Pinnata（Lour.）Prain 是豆科黄檀属多年生的木质藤本植物，具有珍贵的香药两用价值，在我国主要分布于广西、云南、海南等地1。斜叶黄檀木质部富含芳香树脂，是著名的传统香料，常被用于制作熏香材料，防治瘟疫以及各类祭祀活动，在民间称为“降真香”2。在药用方面具有祛风止痛、活血、敛疮的功效3，此外，研究人员通过实验证实了斜叶黄檀的美白褪黑的作用4。目前，对斜叶黄檀的研究主要集中在品种鉴定5，化学成分6-9，以及抗氧化、抗菌等药理研究方面10-11。内生细菌定殖在健康植物组织内部，与植物形成互利关系。在植物的微生态系统中发挥重要作用的群体12。在组织如根茎叶及果实中广泛分布，能促进植物生长、提高抗逆性和降低病虫害。对调节植物的微生态平衡发挥重要的作用13-16。2021 年，蓝柏成等对乔木降香黄檀茎干的心材与边材内生菌多样性进行研究，发现了影响群落结构的木材环境因子17。但是，至今对斜叶黄檀不同组织内生细菌资源的研究几乎没有。因此，本研究以采自云南德宏州瑞丽市勐卯镇州林科所菠萝山的斜叶黄檀为实验材料，对斜叶黄檀不同组织中内生细菌的多样性等进行分析，通过探讨群落结构的潜在功能，完善其内生细菌种质资源，为进一步研究植物与微生物的互作机制、植株与内生细菌香药两用价值的开发等提供科学数据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集2022 年 6 月，斜叶黄檀样品采集于云南省德宏州瑞丽市勐卯镇州林科所菠萝山，使用铁锹、无菌采样袋、高枝剪等工具，完成健康植株茎叶不同组织样本的采集，共得到 9 个样品（各 3 个重复）。1.1.2 实验试剂（见表 1）99第 5 期药用植物斜叶黄檀不同组织内生细菌多样性分析濮宏积，杨本寿，石 添，等表 1 实验试剂试剂型号公司国家DNA 抽提试剂盒DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN美国琼脂糖biowest agArosebiowest西班牙FastPfu PolymeraseFastPfu PolymeraseTransGen中国AxyPrep DNA Gel Extraction KitAxygen BiosciencesAxygen美国建库试剂盒NEXTFLEX Rapid DNA-Seq KitBioo Scientific美国测序试剂盒MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent KitsIllumina美国1.1.3 实验仪器（见表 2）表 2 实验仪器仪器型号公司国家移液器Eppendorf N13462CEppendorf德国小型离心机Eppendorf 5430 REppendorf德国高速台式冷冻离心机Eppendorf 5424REppendorf德国超微量分光光度计NanoDrop2000Thermo Fisher Scientific美国酶标仪BioTek ELx800Biotek美国旋涡混合器QL-901海门其林贝尔仪器制造有限公司中国粉碎研磨仪TL-48R上海万柏生物科技有限公司中国MP 研磨仪FastPrep-24 5GMP美国紫外可见光光度计NanoDrop2000Promega美国电泳仪DYY-6C北京市六一仪器厂中国PCR 仪ABI GeneAmp9700 型ABI美国测序仪Illumina MiseqIllumina美国微型荧光计Quantus FluorometerPromega美国琼脂糖电泳用于检测 DNA 的提取质量，超微量分光光度计用于测定 DNA 浓度和纯度；PCR 引物序列如下338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。PCR 程序参数设定为（1）95 预变性 3min，（2）27 个循环（95 变性 25s,55 退火 35s,72 延伸 35s），（3）72延伸 10min（4）。琼脂糖凝胶电泳用于分离混合 PCR 产物，Axygen 胶回收试剂盒被用于分离纯化，Quantus Fluorometer 用 于 对 回 收 产 物 进 行 定 量。Bioo Scientific 的 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 试剂盒用于建库，步骤包括：（1）接头链接；（2）磁珠筛选去除自连片段；（3）PCR 富集模板；（4）磁珠回收 PCR 产物获取得到最终文库。测序使用的是上海美吉 Miseq PE300/NovaSeq PE250平台。测序得到的数据被上传至 NCBI（序列号为SUB12166990）。1.2.3 数据处理和分析使用 fastp 软件18（version 0.20.0）对测序序1.2 方法1.2.1 样品的表面消毒用蒸馏水冲洗植株样本 10min 左右。将样本剪碎置于烧杯，大功率超声清洗 3min。清洗过的植物样品被放置在烧杯中并依次用以下试剂进行处理：0.1%Tween20 溶液浸泡 1min，5%次氯酸钠溶液 3-5min；无菌水冲洗 3 遍；5%硫代硫酸钠溶液 10min；75%乙醇 5min，无菌水清洗 3 遍；5%碳酸氢钠溶液 10min；最后以无菌水冲洗 3 遍；取部分清洗无菌水用培养基做对照培养。同时，无菌水冲洗后的植物样品被放置在细菌 LB 培养基上做实验对照培养，在 37 条件下将样本培养 72h后检验细菌生长情况确定表面消毒效果。检测无菌后，将严格表面消毒的样品放置于培养皿中无菌风干 40h（每个处理进行 3 组平行实验）。处理完毕的样本送公司进行高通量测序。1.2.2 DNA 提取与检测、16S rDNA V5-V7 区扩增和高通量测序内生细菌总DNA的提取依照试剂盒说明进行。100 第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年（总第 210 期）列进行质控分析。FLASH 软件19（version 1.2.7）被用于拼接，步骤如下：（1）过滤读数，对质控分析后 50bp 以下的读出序列进行过滤，去除含 N 碱基的读出序列；（2）将成对读出序列拼接成单条序列，最小重叠长度设定为 10bp；（3）设定拼接序列的重叠区允许的最大错配比率为 0.2，以此筛选不符合标准序列；（4）根据序列首尾两端的编码序列和引物序列来区分样品并调整序列方向。我们使用 UPARS 软件 E（版本号 7.1）对序列进行 OTU 聚类并剔除嵌合体20-21。我们用 RDP classifier22（版本号 2.2）对单条序列注释物种分类，并且比对 Silva 16S rRNA 数据库（v138）。2 实验结果2.1 数据的处理和统计通过高通量测序，获得斜叶黄檀不同组织内生细菌的原始序列，然后去除非特异性扩增序列和线粒体叶绿体序列等操作后，获得 V5-V7 区有效序列总数，根、茎、叶中分别为 111528 条、110770 条、108226 条，共计 330524 条有效序列，平均长度 376 bp。为了保证结果的均一性，后续对这些有效序列按最少序列数目进行抽平处理。根茎叶的内生细菌 Observed OTUs 稀释结果可以看出（图 1），斜叶黄檀根茎叶的稀释曲线末端进入平台呈现饱和，说明本次研究样本的测序数据量结果合理。2.2 OTU 聚类为了更直观的展示斜叶黄檀的 OTU 在不同组织中的分布情况，对 OTU 代表序列进行统计分析，绘制 Venn 图谱，直观分析样本物种构成及比例。如图 2 所示，斜叶黄檀内生细菌共有 905 个OTU。其中根（root）茎（stem）共有的 OTU 数目是 245 个，茎叶共有的 OTU 数目是 244，根叶共有的 OTU 数目是 268。图 2 OTU 韦恩图分析根、茎、叶不同组织内生细菌注释到门 的 OTU 数 目 分 别 为 24、16、17（图 3A）。根、茎和叶在属水平上特有的 OTU 数目分别是 382、271 和 274，三 者 共 有 的 OTU 数 目 为167（图 3B）。其中，叶中没有特异性的门被注释，茎中注释到唯一特异性的门为浮游菌门（Planctomycetota）。如图 3C 所示，三者共有的细菌门类为变形杆菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinomycetes）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）以及脱硫菌门（Desulfobacterota）。图 3 内生细菌群落分类及组成分析注：图中每一色块代表一个植物样本，色块之间的重叠区域表示对应样本之间的共同 OTU，每个色块中的数字对应分组中单独的 OTU 数目，A 图注释到门，B 图注释到属，C 图为根茎叶中共有的门图 1 Observed OTUs 稀释曲线 101 第 5 期药用植物斜叶黄檀不同组织内生细菌多样性分析2.3 多样性分析通过 多样性分析可以得到群落中物种的丰富度、均一性和多样性等信息，其中以 Chao 和Ace 指数表征丰富度，二者数值越大表明丰富度越大。Shannon 指数和 Simpson 指数用于多样性表征23，Shannon 指数越大，种类多样性越大，而Simpson 指数越大则相反，表明多样性越小。对斜叶黄檀各组织内生细菌进行多样性指数分析，结果如表 3 所示，各样本覆盖指数（Coverage）均达到 99%以上，斜叶黄檀不同组织所有的内生细菌几乎都能被检测到，所有结果均具有良好的置信水平。其中，根中内生细菌多样性的 Chao 指数均高于茎和叶，按照 Chao 指数大小可知，内生细菌的丰富度由大到小的组织依次是根（G平均）叶（Y平均）茎（J平均）。根据 Shannon 指数大小可知，不同组织内生细菌多样性由大到小的顺序依次为茎 根 叶。因此，根中内生菌群的丰富度最高，茎中内生菌群的丰富度最低，但是茎中菌落多样性最高。表 3 多样性指数表 SampleEstimatorsShannon香浓指数Simpson辛普森指数Chao丰富度指数CoverageG 平均3.85650.0692239.72750.9994Y 平均3.71180.07309176.04210.9992J 平均4.04840.03300169.22220.99942.4 多样性分析 多样性描述的是物种内的丰富度、多样性、均匀度等指标，因此也被称为生境内多样性，多样性指沿着环境梯度的变化，不同群落之间物种组成的差异性或是更替的速率，因此也被称为生境间多样性，通用 PCoA 图来展示不同样本或者组本间距离。主坐标（PCoA）分析图展示不同组织样本和分组间群落组成的差异，距离越远表明差异越大。水平群落结构的距离矩阵与主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）结果如图 4 所示，第一主成分和第二主成分的贡献率分别为 41.77%和 27.06%，总计贡献率为 68.83%，解释了群落组成的差异。3 个处理组的 3 个样本重复性较好，方差很小。从整体上看，斜叶黄檀根茎叶在 PCoA 图上遗传距离较远，说明根茎叶不同组织中菌群组成差异显著。图 4 斜叶黄檀不同组织样本主坐标（PCoA）分析图注：横坐标和纵坐标分别表示主成分 1 和 2 对样本分布的贡献率。图中的每个点代表一个样本，同颜色点属于同一组2.5 内生细菌群落结构及物种丰度分析由图 5 可知，斜叶黄檀根茎叶中内生细菌主要由变形杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门等优势门组成。图 5 不同组织样本门水平内生细菌组成分析注：Root、stem 和 leaf 分别代表斜叶黄檀的根、茎、叶。纵坐标为类群名称，横坐标为门水平相对丰度（也就是所占的比例），不同颜色的矩形代表不同的物种，矩形长短代表比例的大小。图中展示相对丰度排名前 6 位的类群根据表 4 可知不同组织中的群落组成在门类水平的相对丰度。其中，变形杆菌门在根、茎、叶中的相对丰度分别为 28.25%、59.29%、58.72%。其中，根中丰度最低，茎叶中相对较高，且超过了所有其他全部内生细菌门类。从丰富度来说，放线菌门在根中最高，达到 37.74%，茎和叶中相对较低，分别为 14.94%和 16.91%。茎中酸杆菌门最高，为 4.46%，远高于根和叶组织中。叶中拟杆菌门最高，为 8.56%。因此可以看出，根茎叶中的优势门有放线菌门、变形菌门和酸杆菌门。根中的最大的优势门是放线菌门，茎和叶中最大濮宏积，杨本寿，石 添，等 102 第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年（总第 210 期）的优势门是变形菌门。表 4 内生细菌门水平相对丰度（相对丰度值 1.0%）门 Phylum根root（%）茎 stem（%）叶 leaf（%）Proteobacteria28.2559.2958.72Actinomycetes37.7414.9416.91Firmicutes17.3216.0112.30Bacteroidetes4.762.838.56Desulfobacterota8.840.070.77Acidobacteriota0.724.460.67Others 2.382.392.07如表 5 所示，属水平上相对丰度大于 1.0%的 前 10 个 属 中，占 比 最 多 的 为 糖 单 胞 菌 属（Saccharopolyspora）、马 赛 菌 属（Massillia）、食 酸 菌 属（Brevundimonas）、罗 尔 斯 通 菌 属（Ralstonia）、鞘 单 胞 菌 属（Sphingomonas）和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、芽 孢杆菌属（Bacillus）、脱硫菌属（Desulfovibrio）、金 黄 杆 菌 属（Chryseobacterium）和 水 杆 属（Aquabacteriums）。表 5 内生细菌部分优势属（相对丰度大于 1.0%）GenusMean relative abundance（%）Saccharopolyspora8.35Massillia7.33Brevundimonas4.58Ralstonia4.46Sphingomonas3.65Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia3.60Bacillus3.04Desulfovibrio 2.73Chryseobacterium 2.03Aquabacterium 1.98如图 6 所示，根中糖单胞菌属是优势属，相对于茎叶丰富度最大。叶中马赛菌属为优势属，相对于根茎的丰富度最大。茎中糖单胞菌属、马赛菌属以及罗尔斯通菌属丰富度类似。从图中也可以看出，茎中内生细菌物种多样性高，未知物种最多。图 6 不同组织样本属水平内生细菌组成分析注：Root、stem 和 leaf 分别代表斜叶黄檀的根、茎、叶。纵坐标为类群名称，横坐标为属水平相对丰度（也就是所占的比例），不同颜色矩形代表不同的种属，矩形长短表示物种所占比例。图中展示相对丰度排名前 6 位的类群通过聚类热图（heatmap）可以直观比较样本内和样本间内生细菌群落组成及丰富度。用颜色变化反映物种的丰度信息，颜色块代表物种的图 7 属水平上内生细菌群落热图分析注：通过物种聚类对平均丰度前 50 的属绘图，展示差异物种属水平不同组织内生菌群的分布情况。颜色深浅反映物种的丰度变化，可直观地展示物种的变化趋势。50 个分组用 50 个不同的颜色展示 103 第 5 期药用植物斜叶黄檀不同组织内生细菌多样性分析相对丰富度值，红色表示高丰富度，蓝色表示低丰富度。对高通量测序数据分析，绘制前 50 个属的热图。结果如图 7 所示，在根部，丰富度较高的菌群有糖单胞菌属（Saccharopolyspora）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、脱硫 菌 属（Desulfovibrio），丰 富 度 最 低 的 属 是Terriglobus，该属在叶中的分布也较少，而在茎中较高。在茎中，丰富度较高的有芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘单胞菌属（Sphingomonas）、罗尔斯通菌属（Ralstonia），丰富度最低的属是假细菌属（Pseudarthrobacter）。在叶中，丰富度较高的是马赛菌属（Massillia）、食酸菌属（Brevundimonas）和黄色杆菌属（Flavobacterium），丰度最低的也是 Terriglobus。从上述结果可以看出，根茎叶中丰度最高的三个属完全不同，不同组织内生细菌优势属差异显著。2.6 功能预测利用 PICRUSt 软件包，针对 16S 扩增子测序结果，对不同组织样本内生细菌群落 COG 和KEGG 的功能丰度进行预测。结果如图 8 所示，斜叶黄檀根茎叶不同组织内生细菌 COG 功能分类大致相同，但是丰度有差异。图 8 不同组织内生细菌群落功能丰富度柱状图如表 6 所示，根中内生细菌有 10 种功能丰度均比茎和叶中高，包括氨基酸转运和代谢、能量代谢与转换、转录、增殖、碳水转运与代谢、辅酶运输、脂质代谢、核糖体、无机离子的运输和代谢、次级代谢物的合成、分解代谢及防卫机制。而叶中有 5 种功能丰度比根和茎中高，包括细胞壁、细胞膜及外周膜生物合成、翻译后修饰蛋白转换、分子伴侣、信号转导、细胞运动及胞内运输、囊泡运输。相对于根和叶来说，茎中菌群功能丰度均偏低。此外，相对于高丰度菌群功能，有 4 种功能丰度在根茎叶菌群中整体偏低，包括在 RNA 加工和修饰、染色体结构和活力、细胞外结构、细胞骨架等。表 6 内生细菌群落 COG 功能丰度功能丰度最高（根茎叶）丰度中等（根茎叶）丰度最低（根茎叶）E（氨基酸转运与代谢）根叶茎C（能量代谢和转换）K（转录）D（细胞增殖）G（碳水化合物转运和代谢）H（辅酶的运输和代谢）I（脂质运输和代谢）J（翻译、核糖体结构与生物发生）P（无机离子的运输和代谢）Q（次级代谢物的生物合成、运输和分解代谢）V（防卫机制）M（细胞壁、细胞膜及外周膜生物合成）叶根O（翻译后修饰 蛋白转换、分子伴侣）T（信号转导）N（细胞运动）U（细胞内运输、分泌和囊泡运输）A（RNA 加工和修饰）无根、茎、叶B（染色体结构和活力）W（细胞外结构）Z（细胞骨架）濮宏积，杨本寿，石 添，等 104 第 45 卷昭 通 学 院 学 报2023 年（总第 210 期）对不同组织样本内生菌群 KEGG L3 的功能丰度进行预测，结果如表 7 所示，根组织中 10 个代谢通路丰度均为最高，茎和叶组织中丰度较高的均有 5 个。其中根茎叶各组织中 ansamycins 的生物合成功能丰度均为最高，其次是细菌的趋化性功 能。Caron fixation in photosynthesis organisms 在各组织内生群落中的功能丰度均为最低。表 7 内生细菌群落 KEGG L3 功能丰度（相对丰度大于 1.0%）功能丰度根（%）茎（%）叶（%）Biosynthesis of ansamycins3.885.433.84Bacterial chemotaxis2.152.632.15Biosynthesis of vancomycin group antibiotics1.581.821.41Valine,leucine and isoleucine biosynthesis1.731.821.78Fatty acid biosynthesis1.691.711.67C5-Branched dibasis acid metabolism1.551.651.58Pentose phosphate pathway1.311.461.37Pantothenate and CoA biosynthesis1.361.561.38Streptomycin biosynthesis1.331.441.29Caron fixation in photosynthesis organisms1.141.291.183 总结与讨论本研究主要从生物学、药用价值与开发着手，为最大程度确保研究的科学性、创新性和系统性，本次采集标本季节选择在春季，能够完整的采集植物的根、茎、叶，确保样本组织提取的完整性。其次，采集过程中保留了一部分该生长植物的根系土壤，以便于开展生长环境和伴生菌落的研究。通过 16S rDNA 高通量测序及群落丰富度和多样性分析发现，所有组织样本中，内生细菌优势门为变形杆菌门、放线菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门等，优势属为糖单胞菌属、马赛菌属、食酸菌属、罗尔斯通菌属和鞘单胞菌属。其中，变形杆菌门在斜叶黄檀的茎和叶中相对丰度远高于根部，且超过了茎叶中所有其他全部门类，放线菌门为根部最大的优势门。此外，茎部的酸杆菌门远高于根和叶，叶中拟杆菌门丰度高于根和茎。群落丰富度在根中最高，茎中最低，群落多样性在茎中最高，叶片最低。斜叶黄檀植株不同组织内生细菌群落丰富度与多样性不同，可能与植株不同组织具有不同的香药的功能有关，也可能与周围环境因子如温湿度、病原菌侵害等有关。比如，放线菌门、拟杆菌门是农用抗生素的重要种质资源来源24-25，其在根部的功能丰度最高，可能与根部抵抗土壤复杂多变的环境，与植株具有较高的抗逆能力有关。COG 功能丰度预测结果表明，根中内生菌群具有丰富的功能，包括氨基酸转运和代谢、能量代谢与转换、转录表达等，均比茎叶高，而茎内群落功能丰度均偏低。在这些功能中氨基酸转运与代谢的丰度最高。植物无时无刻不在与外界不同的病原体及有益微生物接触，并做出应激反应，氨基酸是植物初级代谢中蛋白质、能量和氮素代谢的核心成分，也是各种活性化合物的前体，在植物与微生物的相互作用中具有特定的功能。其中，根系分泌的某些氨基酸可能通过信号传递参与了生物相互作用过程26。KEGG L3 通路功能预测结果显示，根中各通路功能均为最高，茎和叶组织中通路功能丰度均分。其中，安沙霉素类（ansamycins）抗生素的代谢功能均为最高，远高于其他通路，说明内生菌群可能通过抗生素合成与植物共同抵抗外界病原体的共生作用。这为研究斜叶黄檀与内生细菌之间的互作关系提供丰富的微生物资源信息。在后续的研究中，可通过分离筛选和纯培养获得微生物纯种，进而筛选具有辅助植物抗病、药物合成、香料物质合成等功能相关的目的菌株，为进一步开发利用该植物提供数据支撑。105 第 5 期药用植物斜叶黄檀不同组织内生细菌多样性分析参考文献：1 陈焕镛.海南植物志:第 2 卷 M.北京:科学出版社,1965:287.2 张丹雁,范紫颖,马换换,等.西南地区民族习用药香龙肝香(杠香)的品种鉴定 J.安徽农业科学,2018,46(16):11-13+43.3 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analyzed.Results showed that there was a rich diversity of endophytic bacteria in different tissues,and the community composition was significantly different.In all tissue samples,Proteobacteria,Actinomycetes and Acidobacteriota were the dominant endophytic bacteria.The dominant genera were Saccharopolyspora,Massillia,and Brevundimonas.The richness of each flora was highest in the root and lowest in the stem,while the diversity was highest in the stem and lowest in the leaf.The prediction results of endophytic bacterial COG functional abundance showed that the endophytic bacteria in roots had higher functional abundance in ten categories,including amino acid transport and metabolism,e